Name: Reaktif oksijen türleri Solea Senegalensis sperm hücreleri, hücre içi konumunu değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Keşfedin Solea senegalensis spermatozoa hücrelerinde reaktif oksijen türlerinin hücre içi lokalizasyonunu konfokal mikroskopi ile değerlendirme yöntemini. Bu protokol sperm sağlığı ve oksidatif stres araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AQUAGAMETE SK 1205 maliyet eylem teşekkür ediyoruz. Bu eser mali AGL201568330-C2-1-R project (MINECO/FEDER) tarafından desteklenmiştir. David G. Valcarce cunta de tarafından finanse edilen Castilla y Leon (EDU1084/2012) ve Fondo sosyal Europeo. Yazar Dr. Ana Riaza ve Stolt deniz çiftlik S.A., Dr Paulino de Paz, Dr Ignacio Martínez Montero ve José Ramón Guiérrez kabul edersiniz. Biz de videografisi için Paula Fernández Colado teşekkür ederim.

Not: Fluorochrome kuluçka ve confocal analiz en az 2-3 h bir kontrol ve bir tedavi örnek alacak. Veri işleme bu zaman hesaplamaya dahil değil. Gerekli malzemeler Malzemeler tablobulunabilir. Bu iletişim kuralı için taze veya cryopreserved sperm uygulanabilir. Solea senegalensis soğuk suda, iş her zaman soğuk koşullarda (4-7 ° C) olarak çoğaltılır bir balık türüdür. Protokol genel görebilmek için bkz: şekil 1 .
1. hazırlık çalışmaları daha önce deneme
<ol><li>1 bir mitokondri leke mM analitik sınıfta DMSO hisse senedi çözüm hazırlamak.</li>
	<li>1 μg/mL ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) hisse senedi çözüm deiyonize su hazır olun.</li>
	<li>Bir 200 mOsm/kg zil çözüm (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,7) hazırlamak</li>
	<li>4 mM 2 ', 7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) hisse senedi çözüm analitik sınıf metanol içinde hazır olun. Not: stok çözümleri-20 ° C de ihtiyaç kadar aliquots içinde tutun.</li>
	<li>4-7 ° C'de microcentrifuge ayarla</li>
</ol>2. numune hazırlama Fluorochrome kuluçka önce
Not: Pipetting ve resuspending nazik sperm kullanımı tercih edilir.
<ol><li>Eğer cryopreserved hücrelerle çalışma, bir su banyosu Solea senegalensis sperm1040 ° C'de çözdürme için hazır olun. Su banyosu için 7 saman örneklerinde bırakın s.</li>
	<li>Kesmek için makas kullanırken, örnek bir microfuge tüp içine boşaltın ve vasıl 1000 x g, 4-7 ° C için 1 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Seminal plazma veya cryoprotectants ile seminal plazma cryopreserved örnekten boyama protokolüyle engelleyebilir herhangi bir bileşeni atmak için pipetting tarafından kaldırın.</li>
	<li>50-100 μL 4 ° C 200 mOsm/kg zil çözüm hücrelerde resuspend.</li>
	<li>Bir Neubauer veya bir stereoskopik mikroskop altında benzer bir sayım odası ile sperm konsantrasyonu belirlemek.</li>
	<li>1-2 x 106 hücre/mL 0.5 mL 4 ° C'de zil çözüm son hacmi kadar hücre süspansiyon oranında seyreltin.</li>
</ol>3. fluorochrome kuluçka
Not: Fluorochromes, düşük ışık koşullarında, çözümde özellikle ne zaman ele gerekir.
<ol><li>DCFH-DA hisse senedi çözüm 3.125 μL ekleyin (örnekteki son konsantrasyonu: 25 mikron) çalışma Numune dilüsyonu için. 4-7 ° C'de karanlık1040 min için kuluçkaya.</li>
	<li>30 dakika sonra 0.5 μL DAPI hisse senedi çözüm ekleyin (örnekteki son konsantrasyonu: 2 mikron) ve hisse senedi çözüm leke 0.5 μL mitokondri, (örnekteki son konsantrasyonu: 100 nM) örnek. Her iki fluorochromes 10 dk için karanlıkta kuluçkaya.</li>
</ol>4. numune hazırlama için Confocal mikroskobu
<ol><li>Kuluçka süresi sonra santrifüj kapasitesi 1000 x g, 4-7 ° C için 1 dk de hücre süspansiyon.</li>
	<li>Süpernatant dikkatle pipetting tarafından atmak.</li>
	<li>10-20 μL 200 mOsm/kg zil çözüm ekleyin.</li>
	<li>Yer 5 μL konsantre hücre süspansiyon, bir slayt üzerinde bırakın.</li>
	<li>Dikkatle, hazırlık kapak slaytta koymak ve Lehçe ile kapatın. Lehçe kuru olduğunda, hazırlık confocal mikroskopi için hazırdır.</li>
</ol>5. confocal Kur deneme önce
Not: mikroskop bağlı olarak DCFH-DA "yanmış". En iyi koşullarda bir sigara çok değerli örnek ile önce kurun.
<ol><li>Mikroskop, lazerler, kamera ve mikroskop bilgisayarı açın.</li>
	<li>Her fluorochrome uyarma ve emisyon maximums dikkate alarak uyarma lazerler ayarlayın:<ol>
<li>Bir uyarma en çok 358 DAPI için kullanmak nm ve emisyon en fazla 465 nm.</li>
		<li>Mitokondrial leke için bir uyarma en çok 644 kullanmak nm ve emisyon en fazla 662 nm.</li>
		<li>DCFH-DA, bir uyarma en çok 504 kullanmak nm ve emisyon en fazla 525 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sperm hücreleri üzerinde odaklanmak için 25 X amacı ile çalışmaya başlamak. Bu fluorochrome en yüksek yoğunluk raporları, çünkü odak DAPI kanala seçin. Hücreleri odaklandık sonra Solea senegalensis sperm hücreleri boyutu yaklaşık 2 mikron olduğundan, 63 X veya 100 X amacı ayrıntılı bir değerlendirme için kullanabilirsiniz.</li>
	<li>Her kanal için iğne deliği ve sondaj, kazanç ve gerilim en iyi duruma getirme. Aynı şekilde, arka plan azaltmak için dijital ofset ayarlayın. Bir kez tüm parametreleri kullanılan fluorochrome için optimize edilmiş, ayarları kaydedin. Tek bir için bir rutin deney Solea senegalensis sperm hücresi (Bu parametreler her deneyde değişebilir) aşağıdaki kullanılan: 1 ve kazanç gerilimi 750 V iğne deliği.</li>
</ol>6. görüntüleri edinimi
<ol><li>Resim alma için istenen kalite koşullarını seçin. Bit derinliği, görüntü biçimi, hafif levha kalınlığı gibi satın alma ayarlarını tanımlayın ve tek taraflı aydınlatma seçin. Tek bir için bir rutin deney Solea senegalensis sperm hücreleri (Bu parametreler her deneyde değişebilir) aşağıdaki kullandık: çerçeve boyutu 1024 piksel; 16 bit / piksel; tarama hızı 2-4).</li>
	<li>Açın ve başlamak ve alan görüntüsünü almak için tarama alanını Merkezi.</li>
	<li>Kırpma aracını kullanarak, ilgi bölge seçin ve canlı basın.</li>
	<li>Aralığı gösterge aracı yardımıyla arka plan azaltmak için dijital ofset ayarlayın. Her kanal için bunu ve görüntü al.</li>
	<li>Her fluorochrome ve onların birleştirme için bireysel kanalları kalitesini kontrol edin.</li>
</ol>7. bir 3D görüntü Video oluşturma
<ol><li>Z-yığın alma ayarları.<ol>
<li>Yazılımda Z-yığın seçeneği.</li>
		<li>Tek hücre, hücre grubunu veya bölge ilgi seçin ve odaklanır.</li>
		<li>Z-yığın 'First Slice' ve 'Son dilim' seçenekleri ile sınırlandırmak ve aralığı iyi odak yardımıyla 0.2 µm için z adıma kurmak. Bu fluorochrome en yüksek yoğunluk bildirebilir ve kolayca tüm sperm kafa seçebilirsiniz çünkü odaklanmaya DAPI kanalını seçin. Her kanal için en iyi satın alma parametrelerini seçin ve deneme çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Z-yığın denemeyi çalıştırmak. Kanalları bölünmüş ve her sinyal hücrelerindeki lokalizasyonu gözlemlemek.</li>
	<li>Z-yığın işlemi.<ol>
<li>Birim render: deneme tamamlandığında, Z-yığın işleme yazılımı seçenekleri seçin ve toplu oluşturun seçeneğini seçin. Adımlar ve döndürme derece (360 °) sayısını seçin. Dosyayı bir video uzantısı ile kaydedin.</li>
		<li>Anaglify: anaglify seçeneği process penceresine. Bu araç bir 3D görüntü split kanallı video oluşturmanızı sağlar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Amaral, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functionality+and+chemical+compound+action+on+sperm+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function.</a> Curr Med Chem. , (2016).</li>
<li>Morielli, T., O'Flaherty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+impairs+function+and+increases+redox+protein+modifications+in+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.</a> Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).</li>
<li>Gürler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability%2C+synthesis+of+reactive+oxygen+species%2C+and+DNA+damage+of+bovine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. , (2016).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+E+Analogue+Improves+Rabbit+Sperm+Quality+during+the+Process+of+Cryopreservation+through+Its+Antioxidative+Action%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action.</a> PLoS One. 10 (12), e0145383(2015).</li>
<li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+ROS+production+through+mitochondria-targeted+antioxidant+and+mitochondrial+uncoupling+increases+post-thaw+sperm+viability+in+yellow+catfish%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish.</a> Cryobiology. 69 (3), (2014).</li>
<li>Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation-induced+human+sperm+DNA+damage+is+predominantly+mediated+by+oxidative+stress+rather+than+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).</li>
<li>Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+phosphatidylserine+translocation%2C+intracellular+hydrogen+peroxide%2C+and+DNA+integrity+in+canine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm.</a> Theriogenology. 73 (3), (2010).</li>
<li>Guthrie, H. D., Welch, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reactive+oxygen+species+on+sperm+function%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of reactive oxygen species on sperm function.</a> Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).</li>
<li>Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+and+sperm+function--in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health.</a> J Androl. 33 (6), (2012).</li>
<li>Valcarce, D. G., Robles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+captivity+and+cryopreservation+on+ROS+production+in+Solea+senegalensis+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa.</a> Reproduction. 152 (5), (2016).</li>
<li>Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paradoxical+relationship+between+stallion+fertility+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress.</a> Biol Reprod. 91 (3), (2014).</li>
<li>Cabrita, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0044848614002105">Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis.</a> Aquaculture. 432, 389-401 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

İyi mitokondri sperm motilitesi ve fonksiyon için anahtar organelleri vardır bilinmektedir. Bu organelleri aynı anda doğrudan ROS üretim söz konusu. İlginçtir, ROS kontrollü düzeyde uygun sperm fonksiyonu1için ihtiyaç vardır. Doğurganlık ve oksidatif stres arasında olumlu ilişkiler memeliler11 ' de gösterilen ama sperm kalitesi12aşırı düzeyleri etkiler. Doğru pozitif veya negatif etkisi belirleyici olabilir bir önemli bir faktör sadece ROS düzeyleri ...

Reaktif oksijen türleri üretim sperm kalitesi ile bağlantılı son zamanlarda1. Ne kadar ROS üretim mitokondri içinde normal bir fizyolojik süreç olarak, ROS üretim aşırı Oksidatif Stresin farklı düzeylerde sperm hücreleri hasara açık bir nedenidir. İnsanlarda, oksidatif stres hareketliliği ve yetenek capacitation2geçmesi için değiştirme erkek infertilitesi ile ilişkilidir; Memelilerde, DNA bütünlük içinde donmuş sperm örnekleri değişikliği de H2O23sentezi için ilgili olmuştur.
Dondurma yetiştiricilik bankacılık gen için ortak bir tekniktir. Bu teknoloji özellikle türlerin Solea senegalensisgibi üreme sorunları ile önemlidir. Piyasada değerli bu türün üreme disfonksiyon bireylerde tutsak Kur eksikliği nedeniyle tarihi gösterir. Bu gerçeği sperm dondurma sperm durumu Yapay döllenme için gerekli kılar. Ancak, dondurma gibi çalışmalar antioksidan takviyesi faydalı etkisini bildirdin bu spermlerin4 için zararlı olabilir oksidatif stres kaynağı olacaktır. ROS inhibisyonu yoluyla mitokondrial hedefli antioksidan bildirildi sperm dondurma sarı yayın balığı5için faydalıdır.
Bu nedenle, ROS seviyelerinde sperm örnekleri bu moleküller sperm hayatta kalma ve üreme8için bir dezavantaj olarak kabul edilmiş, özellikle dondurma6,7 sonra bilmek önemlidir. Ayrıca, ROS dağıtım hücre içinde eğitim potansiyel hasar düzeyi anlaması çok önemli olabilir. Örnek olarak, ROS seviyesinin düşük mitokondri içinde normal ve uyumlu sperm fonksiyonu ile kabul edilebilir ama ROS yüksek düzeyde çekirdek içinde Sperm DNA hasarı belirtileri olabilir. H2O2 mitokondri yayımlanan olabilir ve bir küçük ve ücret daha az molekül9olduğu için çekirdek nüfuz en alakalı ROS biridir. Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) özellikle hücre içi peroksit yeşil Floresans yayan ortaya çıkarabilir. Bu makalede, H2O2 hücre içi Yerelleştirme Solea senegalensis sperm confocal mikroskobu kullanılarak tespit için detaylı bir protokol sunulmuştur.

<table><tbody><tr><td>2&asal;,7&prime;-Diklorodihidrofloresein diasetat (DCFH-DA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6883</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskopi</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Kapak fişleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Analitik Sınıf</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, Analitik Sınıf</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MitoTrackerKoyu Kırmızı&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj (soğutmalı)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neubauerchamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717810</td><td></td></tr><tr><td>Slaytlar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10143562BEF</td><td></td></tr></tbody></table>

reaktif oksijen türleri solea senegalensis sperm hücreleri, hücre içi konumunu değerlendirilmesi

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Oksidatif stres sperm kalitesini azalan en önemli faktörlerden biridir. Reaktif oksijen türleri (ROS) sperm hücreleri içinde algılamak için etkin iletişim kuralları geliştirme herhangi bir tür yüksek öneme sahip olduğunu, ancak bu yöntemler sık kullanılmayan ve teleost içinde daha az. Dondurma gen bankacılık dahil olmak üzere farklı amaçlar için yararlı bir yöntem su ürünleri içinde ve sperm kullanılabilirlik yıl boyunca garantili. Yordamlar donma/çözülme ROS üretimin neden ve sperm hücrelerine de zarar. Göz önüne alındığında bu potansiyel zarar ROS üretim aşırı onların yerelleştirme bağlı olarak sperm H2O2 algılamak ve hücre içi onun yerelleştirme tarafından confocal mikroskobu değerlendirmek için detaylı bir metodoloji neden sağlanır. Bu amaçla, 3 fluorochromes (2 ', 7 '-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), bir canlı mitokondri leke ve 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)) bir arada ortak Yerelleştirme2 H2O değerlendirmek için kullanılır sperm hücreleri çekirdek veya mitokondri Solea senegalesis sperm örnekleri ile.

Confocal mikroskobu teleost sperm hücre içi ROS değerlendirme için ideal bir yöntemdir. Bu çalışmada (şekil 1) sunulan üç fluorochromes (DAPI, bir mitokondri leke ve DCFH-DA) temel araştırma uygulanabilir ve uygulama içinde kullanılan yordamlar geliştirmeye sahip olamaz birçok yararlı bilgi sağlar endüstriyel su ürünleri tesisleri, dondurma iletişim kuralları gibi. Analiz türleri farklı yürütülen hücre içi ROS varlığı ve diğer parametreleri ilişkilendirmek iç...

Bu iletişim kuralı H2O2 Yerelleştirme Solea senegalensis sperm hücreleri hassas fluorochrome DCFH-DA ROS, mitokondri için canlı mitokondri leke ve DAPI için çekirdek için kullanma içinde algılamak için detaylı bir metodoloji açıklar görselleştirme, anılan sıraya göre. Protokol taze ya da çözdürülen sperm hücreleri ile 2 saat içinde yapılması için tasarlanmıştır.

Reaktif oksijen türleri Solea Senegalensis sperm hücreleri, hücre içi konumunu değerlendirilmesi

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

Bu deneyin genel amacı, konfokal mikroskopi yoluyla Solea senegalensis spermatozoalarında reaktif oksijen türlerinin hücre içi konumunu değerlendirmektir. Reaktif oksijen türleri, farklı düzeylerde hücresel hasara yol açarak etkili sperm fonksiyonu için güvenlik açısından risk oluşturmaktadır. Lipid peroksidasyonu hareketlilik ve dölleme üzerinde olumsuz bir etki yaratabildiğinden, spermatozoalar oksidatif strese karşı özellikle hassas olabilir.Reaktif oksijen türleri, intrinsik apoptotik kaskadı bile tetikleyebilir. Peroksit, mitokondriden salınır ve küçük, yüksüz bir molekül olduğu için çekirdeğe nüfuz ederek DNA'yı etkileyebilir. Bu protokolde, hücreye dahil olduktan sonra oksidatif reaksiyonla modifiye edilebilen ve yeşil floresans yayan bir florofor kullanıyoruz.Bu sayede, reaktif oksijen türlerinin yerleşimini tam olarak belirleyebilirsiniz. Bu videoda Solea senegalensis spermatozoaları ile çalışıyoruz ancak bu protokolü ticari öneme sahip ilgili türlerle veya Sibrifis veya Mirica gibi annelerle de kullanabilirsiniz. Bu tekniğin fiziksel-reaktif biyoloji veya apikültür alanlarındaki kullanımına dair bazı örnekler şunlardır.Protokolleri takiben kriyopresipitasyonun değerlendirilmesi. Bu sperm aktivasyonundan önce ve sonra reaktif oksijen türü etiketlerinin karşılaştırılması. Veya reaktif oksijen türü etiketlerini iyi ve kötü nefes alanlarla ilişkilendirebilirsiniz.Öncelikle, fluorokrom stoklarınızı hazırlayın. Fluorokrom manipülasyonlarını güvenlik bilgi formu önerilerine uygun olarak gerçekleştirmeniz gerektiğini göz önünde bulundurun. Stokların tartımı ve hazırlanması sırasında özel özen gösterilmelidir.Stok çözeltilerini ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de alikotlar halinde saklayın. Bu protokolde üç florokrom kullanıyoruz. Uzak kırmızı floresan boya, canlı hücrelerdeki mitokondrileri boyar ve mitokondriyal lokalizasyon için kullanılabilir.DAPI, floresan mikroskobisinde DNA boyama için yaygın olarak kullanılan bir probdur. DNA'daki adenin-timin bakımından zengin bölgelere güçlü bir şekilde bağlanır. 27-diklorofloressein diasetat ise hücreye nüfuz edebilen floresan özelliği olmayan bir probdur.Hücre içinde de-esterifiye olur ve oksidasyon üzerine yüksek floresan özellikli 27-diklorofloresesine dönüşür. Bu protokol taze veya kriyoprezerve spermatozlar ile başlatılabilir. Bu çalışmada, kriyoprezerve bir örnek kullandık.40 °C sıcaklıkta çözündürme işlemi için bir benmari hazırlayın. Materyali temizleyin. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanarak, kriyoprezervasyon uygulanmış samanınızı seçin.Pipeti yedi saniye boyunca banyoda bekletin. Çözülmüş örneği makas kullanarak bir mikrosantrifüj tüpüne boşaltın. Her zaman 4 °C'de çalışın.Numuneyi bir dakika boyunca santrifüjleyin. Peletlenmiş sowellere zarar vermeden kriyoprotektanları dikkatlice uzaklaştırın. 50 veya 100 µL hacmindeki az miktarda RINGA çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.Hücre süspansiyonunuzun bir dilüsyonunu yeni bir bower veya benzeri bir sayım odasına yükleyin ve hücreleri sayın. Numunenin bu konsantrasyonunu hesaplayın. Hücre süspansiyonunu, önceden soğutulmuş RINGA solüsyonu içinde 0.5 milliliters nihai hacimde, milimetre başına bir ila iki milyon hücre olacak şekilde dilüye edin.Pipetleme ve yeniden süspansiyon işlemleri sırasında spermatozoalarla nazikçe işlem yapılmalıdır. Çalışma örnek çözeltisine 3.125 microliters diklorofloresresin diasetat stok çözeltisi ekleyin. Örnekteki nihai konsantrasyon 25 micromolar'dır.40 dakika boyunca 4 ila 7 santigrat derece sıcaklıkta inkübe edin. 30 dakika sonra, numuneye 0.5 µL DAPI stok çözeltisi ve 0.5 µL mitokondri boyama stok çözeltisi ekleyin. Her iki florokromun inkübasyon süresi 10 dakikadır.Bir lam üzerine beş mikrolitrelik konsantre hücre süspansiyonu damlası yerleştirin. Hazırlığın üzerine dikkatlice bir lamell yerleştirin ve kapatın. Cihazı açın ve kontrol panelinden 100 büyütmeli objektifi seçin.Numuneyi mikroskopta bulun ve lambayı açın. Sistem yazılımı, ihtiyacınız olan florokromların doğrudan bir listeden seçilmesine olanak tanır. Seti seçin.Emisyon maksimumu 465 nanometre olan DAPI, emisyon maksimumu 662 nanometre olan MitoTracker Deep Red ve emisyon maksimumu 525 nanometre olan DCF. Işını okülerlere yönlendirin. İlgilenilen bir alanı odaklayın.Yazılıma geri dönün ve çerçeve boyutunu seçin. Daha iyi bir çözünürlük için çift yönlü tarama modunu belirleyin. İstenilen tarama hızını seçin.Başlamak için tarama alanını açın ve ortalayın. Alanın bir görüntüsünü alın. Kırpma aracını kullanarak ilgilenilen bölgeyi seçin ve Live düğmesine basın.Ardından çalışma alanınızı seçmiş olacaksınız. Arka planı azaltmak için aralık göstergesi aracı yardımıyla dijital ofset ayarını yapın. Bunu her kanal için gerçekleştirin ve görüntünüzü kaydedin.Bu, sonuçların bir örneğidir. Bir birleştirilmiş görüntü için, her bir fluorokromun bireysel kanalları ve bunların kombinasyonları gösterilmiştir. Bu, bir Solea senegalensis sperm hücresinin etiketleme şemasıdır.Elde edilen görüntüleri incelediğinizde, beklendiği üzere DAPI'nin çekirdek içinde, MitoTracker'ın ise mitokondriyal halka içerisinde konumlandığını gözlemleyebilirsiniz. İlk adım, bir z-yığını (z-stack) deneyi gerçekleştirmektir. Z-yığını penceresine gidin ve ince odak yardımıyla, görüntüleme için ilk ve son pozisyonu seçin.Optimum görüntüleme parametrelerini seçin ve deneyi gerçekleştirin. Her lam için görüntüler elde edeceksiniz. Bu, bir z-yığını (z-stack) sonucuna örnektir.Kanalları ayırabilir ve her bir sinyalin hücre içindeki konumunu gözlemleyebilirsiniz. 3D penceresine geçtiğinizde, farklı grafik seçenekleri belirleyebilirsiniz. Birçok parametreyi özelleştirebilir, kanalları ayırabilir ve birleştirebilirsiniz.Bu, Solea senegalensis sperm hücreleri içindeki reaktif oksijen türlerinin farklı konumlanma modellerini gösteren 3B görünümlerin bir örneğidir. Üst alanda, DCF esas olarak mitokondrilerle kolokalize olmuştur; alt alanda ise sinyal çekirdeğe kadar uzanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, konfokal mikroskopi kullanarak bu spermatozoalarda peroksit hücre içi lokalizasyonunun nasıl değerlendirileceğini öğrenmiş olacaksınız.Sorun giderme önerilerini ve diğer bilgileri metin içerisinde bulabilirsiniz.

evaluation-intracellular-location-reactive-oxygen-species-solea

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz, kalitatif ve kantitatif çalışmalar için çeşitli amoeba ve memeli hücre modellerinde uygulanabilir, reaktif oksijen türlerinin (ROS) ölçümü için protokoller kümesi uyarlanmıştır.

Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Burada canlı zebra balığı embriyolarında oksidatif stresi ölçmek için bir protokol bildiriyoruz. Bu prosedür, hem tüm embriyo dokularında hem de tek hücreli popülasyonlarda reaktif oksijen türlerinin (ROS) tespitine izin verir. Bu protokol hem kalitatif hem de kantitatif analizleri gerçekleştirecektir.

Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

Elektron paramagnetic rezonans (EPR) spektroskopisi serbest radikallerin ölçmek için kesin bir yöntemdir. Farklı hücresel kompartmanlarda serbest radikallerin algılanması için seçici spin sonda kullanımı sağlar. Biz tedavi, depolama ve örnekleri EPR ölçümler için aktarma kolaylaştırmak biyolojik örnekler toplamak için pratik ve verimli bir yöntem mevcut.

Elektron Paramagnetic rezonans ortam sıcaklığı ve 77 K biyolojik örneklerde kullanımı

Burada, metodolojileri spermatozoan membran bütünlüğü, sperm fertilizasyon yetki ile ilişkili bir hücresel özellik değerlendirmek için mevcut. Biz sperm membran fluorimetric değerlendirilmesi için üç teknikler tarif: eşzamanlı belirli floresan problar, floresans mikroskobu ve gelişmiş sperm adanmış akış sitometresi ile boyama. Örnek yöntemleri birleştirerek da sunulmaktadır.

Fluorimetric teknikleri Sperm membran değerlendirilmesi için

Bu protokol hücre içinde hücre altı bölmesi özgü redoks durumunun değerlendirilmesi açıklanır. Redoksduyarlı floresan prob bozulmamış hücrelerde uygun oranmetrik analiz sağlar.

Hücre altı kompartmana özgü Redoksduyarlı Yeşil Floresan Protein kullanılarak Hücresel Oksidasyonun Değerlendirilmesi

Escherichia coli, yenidoğan Gram-negatif bakteriyel menenjitin önde gelen nedenidir. Bakteriyel enfeksiyon sırasında, nötrofiller tarafından üretilen reaktif oksijen türleri önemli bir bakterisidal rol oynar. Burada, menenjit E. coli'yeyanıt olarak nötrofillerdeki reaktif oksijen türlerini tespit etmek için bir yöntem sunuyoruz.

Meningitik Escherichia Coli ile Enfekte Olan Nötrofillerde Reaktif Oksijen Türlerinin Gerçek Zamanlı Nicelemesi

Burada, Müller glial hücrelerinde (MGC'ler) 2′,7′-diklorofloresein diasetat probu (DCFH-DA) kullanarak hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için sistematize, erişilebilir ve tekrarlanabilir bir protokol öneriyoruz. Bu yöntem, bir akış sitometresi ile toplam hücresel ROS seviyelerini ölçer. Bu protokolün kullanımı çok kolaydır, uygundur ve yeniden üretilebilir.

Müller Glial Hücrelerinde 2′,7′-Diklorofloresein Diasetat Probu ve Akış-Sitometri Kullanılarak Reaktif Oksijen Türlerinin Miktarının Belirlenmesi

Sperm mitokondriyal fonksiyonunun yüksek çözünürlüklü respirometri ile analizi, kapalı bir oda sisteminde serbestçe hareket eden spermatozoanın oksijen tüketiminin ölçülmesine izin verir. Teknik, sperm mitokondriyal özellikleri ve bütünlüğü hakkında bilgi sağlayan insan spermatozoasında solunumu ölçmek için uygulanabilir.

İnsan Spermatozoasında Mitokondriyal Fonksiyonu Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri

Bu makale, menide peroksidaz pozitif lökositlerin incelenmesi için ekonomik ve etkili bir protokol sunmaktadır. Bilgisayar destekli semen analizi (CASA) sisteminin yardımıyla, spermdeki peroksidaz pozitif lökosit konsantrasyonu toplam 60 dakika içinde elde edilebilir ve bu da androloji laboratuvarının ve andrologların verimliliğini etkili bir şekilde artırır.

Semende Peroksidaz Pozitif Lökositlerin İncelenmesi

Bu protokol, yüksek verimli bir tarama yaklaşımı kullanarak bir floresan boya probu olarak dihidroetidyum (DHE) kullanarak hücre içi reaktif oksijen türlerini (ROS) ölçmek için yeni bir yöntemi açıklar. Protokol, üç farklı hepatoselüler karsinom hücre hattında hücre içi reaktif oksijen türlerinin (ROS) kantitatif değerlendirme yöntemlerini açıklar.

Dihidroetidyum (DHE) Floresan Boya Kullanılarak Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Üretiminin Yüksek Verimli Tarama Değerlendirmesi

Keşfedin Solea senegalensis spermatozoa hücrelerinde reaktif oksijen türlerinin hücre içi lokalizasyonunu konfokal mikroskopi ile değerlendirme yöntemini. Bu protokol sperm sağlığı ve oksidatif stres araştırmalarına katkı sağlar.

Reaktif oksijen türleri Solea Senegalensis sperm hücreleri, hücre içi konumunu değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet