Name: Kuş sperm toplama Cloacal masaj ve Sperm DNA izolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Öğrenin, kuşlarda kloakal masaj ile spermatozoa toplama ve DNA izolasyonu yöntemlerini. Bu protokol, davranışsal ve evrimsel ekoloji çalışmalarında yüksek kaliteli DNA elde etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ve Jeffrey Kittilson laboratuvarı için destek biz Jose Noguera cloacal Masaj, erken hakkında yardım almak için teşekkür ederiz. Bu eser bir ND EPSCoR FAR0022429 Ödülü BJH için tarafından desteklenmiştir. Yayın ücreti cömertçe NDSU bölümü Biyolojik Bilimler tarafından desteklendi.

Bu iletişim kuralı omurgalı hayvan konular içerir ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Kuzey Dakota Eyalet Üniversitesi tarafından onaylandı.
1. meni koleksiyonundan bir ötücü kuş cloacal masaj kullanarak
Not: Cloacal masaj bir çoğalma etkin kuşlar sadece üzerinde etkili meni koleksiyonu tekniktir, ancak başarıyla uygun esir durumlarda Üreme mevsimi dışında yapılan. Üreme faaliyet cloacal masaj kullanmadan önce hedef türler için tespit edilmelidir. Bu teknik yakalama üzerine yabani kuş vurmak ya da esaret altında düzenlenen kuşlar kullanılabilir.
<ol><li>(İçinde durumu doğurmak) bir erkek kuş ile başlayan sigara dominant el pençesinde bander'ın aktarım kuş dominant el palm (şekil 1) dokunmadan ventral yan ile.<ol>
<li>Kuş başı lateral palmiye kenarına en yakın olduğundan emin olun. Hafif baş ve orta parmak, yüzük ve serçe kullanarak güvenli. Bu kuşun havalandırma ve kuyruk maruz bırakır.</li>
		<li>Kuş bacaklar gevşek veya hafifçe ölçülü palmiye kullanarak bırakın.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig1.jpg"> Resim 1 : Kavrama cloacal masaj için. Kuş hafifçe dominant el palm ve pinky parmak tarafından güvenli baş dokunmadan ventral yan ile sabitlenir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="2"><li>Baskın işaret parmağı ve başparmak lağım üstün sonu her iki tarafında yerleştirin ve hafifçe parmak birlikte kuyruk ( Şekil 2) doğru çok hafif basınç uygularken çimdik. Lağım cloacal mukoza (pembe iç) açığa çıkar. Not: kuş ise cloacal tümsek küçük olabilir şu anda meni, üreten ve lağım evert zordur. Tecrübesiyle, çoğalma etkin ve etkin olmayan erkek5,11cloacas arasında ayırt etmek kolaydır.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig2.jpg"> Resim 2 : Parmak pozisyonu ve cloacal tümsek. Lağım üstün sonuna (A) hafif basınç uygulayarak çıkar. Bir çoğalma aktif erkek ötücü içinde cloacal tümsek açıktır ve firma (B). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="3"><li>Sigara dominant el ile kuyruk el stabilize etmek için tabanının dorsal tarafta parmağı yastık yerleştirin ve diplidir lağım hemen altında parmak ucu yerleştirin. Not: Kısa ve yumuşak küçük resim cloacal masaj gerçekleştirmek için avantajlıdır ve kaza sonucu yaralanma kuş korur.</li>
	<li>Baskın başparmak hareket derin ve cranially lağım kalma orta basınç ile tekrarlayan bir hareket. Kuş cinsel ilißki kadar devam edin. Bireysel bağlı olarak, bu genellikle 1 ve birkaç düzine vuruşları arasında sürer.</li>
	<li>En kısa zamanda kuş cinsel ilißki, meni mikrohematokrit tüp içinde toplamak. Cloacal masaj birden fazla cinsel ilißki elde etmek için yineleyin. Not: Ötücü meni hafif kahverengi ve genellikle biraz kalın bir tutarlılık vardır. Beyaz ve koyu maddelerden lağım atılır meni değildir ve meni örnek kontamine. Az miktarda kan lağım bulunan görünümünü veya içinde ile karışık meni genellikle masaj sırasında çok fazla baskı tarafından neden olur.</li>
	<li>DNA ekstraksiyon için 1 x PBS (pH 7,4) 20 µL ile microcentrifuge tüp meni yerleştirin. Not: 1 x PBS içinde depolanan meni suni tohumlama için uygun değildir, ancak DNA ekstraksiyon daha sonraki bir tarihte kullanılan-80 ° C'de saklandığında PBS Oda sıcaklık olabilir veya soğutulmuş ama meni örnek yatırılır sıvı bir durumda olması gerekir.<ol>
<li>Sperm örnek varlığı seyreltilmiş örnek (şekil 3) bileşik mikroskop altında küçük bir miktar görüntüleyerek doğrulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>-80 ° C'de seyreltilmiş meni ayıklama kadar saklayın.</li>
</ol>2. çıkarma DNA'ın kuş meni
Not: Bu iletişim kuralı birden fazla ticari DNA ekstraksiyon kitleri ile test edilmiştir, ancak sadece bir DNA kiti12ile kullanıldığında başarılı oldu. Değiştirilen kiti Protokolü adım simgesiyle *.
<ol><li>Dithiothreitol (DTT) suda 1 M çözeltisi hazırlamak ve bir vortex.* kullanarak mix<ol>
<li>Aliquot DTT çözüm ve -20 ° c kadar kullanımdan hemen önce saklayın. Elde edilebilir için her örnek, 1 M DTT solution.* 10 µL gerektirir</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 mM Tris-Cl, pH 8.0 içeren bir arabellek hazırlamak; 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; ve % 4 SDS. Bu buffer.* 90 µL ayıklanmasını her örneği gerektirir<ol>
<li>Arabellek, oda sıcaklığında saklayın. Çöktürülmüş Eğer o dissolve.* 56 ° c sıcak</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir rocker veya shaker 65 içeren bir kuluçka Onceden ° C.*</li>
	<li>Hemen çıkarma işlemine başlamadan önce 10 µL DTT çözüm 10 örnekleri açılan Eğer adım 2.2 her örnek elde edilebilir, örneğin 900 µL arabellek artı 100 µL DTT çözüm için hazırlanan tampon 90 µL ile karıştırın. Bu karışım DTT-buffer.* adı verilecek</li>
	<li>70 µL 1 x PBS tüm seyreltilmiş meni örnek ve iyi bir vortex.* kullanarak karıştırın</li>
	<li>100 µL eklemek DTT-tampon ve 10 µL İndinavir K çözüm örnek. Girdap 20 saniye sonra bir rocker veya shaker.* 1 saat önceden ısıtılmış kuluçka makinesine kuluçkaya</li>
	<li>200 µL tampon AL ve 200 µL eklemek taze alkol (% 100) ve 20 seconds.* için girdap</li>
	<li>Tüm örnek bir spin sütuna aktarmak ve 6.000 x g. atma 1 dakikada toplama tüp santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Sütun yeni bir tüp yerleştirin ve 500 µL hazırlanan tampon AW1 ekleyin. 1 6.000 x g. atma dakikada toplama tüp santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Sütun yeni bir tüp yerleştirin ve 500 µL hazırlanan tampon AW2 ekleyin. 6.000 x g. adlı 1 dakika santrifüj atmak akışı aracılığıyla ve sütun geri televizyonda yer.</li>
	<li>3 dakika 20.000 x g. atma, koleksiyon tüp santrifüj kapasitesi ve sütun bir 1.5 mL microcentrifuge tüp yerleştirin.</li>
	<li>Damlalıklı 35 AE µL arabellek sütun membran doğrudan ve oda sıcaklığında 5 güncellemeler için kuluçkaya</li>
	<li>1 dakikada 14.000 x g. atma spin sütun santrifüj kapasitesi ve ayıklanan örnekleri-80 ° C'de depolayın</li>
</ol>

<ol><li>Briskie, J. V., Montgomerie, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1349186">Sperm size and sperm competition in birds.</a> Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).</li>
<li>Monaghan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+life+histories%3A+the+long+and+the+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Telomeres and life histories: the long and the short of it.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).</li>
<li>Carrell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+the+male+gamete%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of the male gamete.</a> Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).</li>
<li>Burrows, W. H., Quinn, J. P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/ps/article-abstract/16/1/19/1564432?redirectedFrom=fulltext">The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey.</a> Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).</li>
<li>Wolfson, A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4510381?seq=1#page_scan_tab_contents">The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds.</a> Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).</li>
<li>Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4089416?seq=1#page_scan_tab_contents">Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment.</a> The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).</li>
<li>Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00265-009-0871-x">Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus.</a> Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).</li>
<li>Purchase, C. F., Earle, P. T. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jai.12070/abstract">Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data.</a> J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).</li>
<li>Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/318577a0">Forensic application of DNA 'fingerprints'.</a> Nature. 318 (12), 577-579 (1985).</li>
<li>Criscuolo, F., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1600-048X.2008.04623.x/abstract">Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres.</a> J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).</li>
<li>Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. <a target="_blank" href="http://www.birds.cornell.edu/homestudy/handbook-of-bird-biology">Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition</a>. , Wiley-Blackwell, Princeton University Press. ISBN 9781118291047 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.scribd.com/document/54238221/QIAamp-DNA-Micro-Handbook">QIAamp DNA Micro Handbook</a>. , Third edition (2014).</li>
<li>Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+DNA+extraction+method+for+sperm+on+the+perivitelline+membrane+of+avian+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs.</a> Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).</li>
<li>Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003347296904236">Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler.</a> Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).</li>
<li>Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+morphology+and+sperm+velocity+in+passerine+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).</li>
<li>Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semen+collection+and+spermatozoa+characteristics+in+budgerigars+%28Melopsittacus+undulates%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Rec%22%5BJournal%5D)">Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates).</a> Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).</li>
<li>Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/232663050_Attempted_Semen_Collection_Using_the_Massage_Technique_and_Semen_Analysis_in_Various_Psittacine_Species">Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species.</a> J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Biz küçük ve orta ölçekli kuşlar üreme etkin durumda sperm toplama ve kuş sperm DNA ayıklanması için basit ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır.
Açıklanan Sperm DNA ekstraksiyon protokolü bir kit basitlik için değiştirilebilir, ancak kuş meni kullanmak için rafine. Sperm lizis standart ayıklama kimyasallar9,13tarafından dayanıklı ve sperm örneği ötücüler toplanan oldukça küçük (genellikle bir kaç microliters). Bu faktörler DTT uygun...

Sperm kalitesini ve rekabet1, sperm telomer dynamics2, epigenetik3ve benzer konular, ilgili sıra onlar biyolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılır ve sperm kolayca cloacal kullanarak tatmak mümkündür çalışmaları için ideal konular kuştur Masaj. Cloacal masaj meni kuşlar4,5,6toplamak için bir nazik, non-invaziv manuel tekniktir. Yinelenen örnekleri kolayca elde edilebilir ve hiçbir özel araç alan veya laboratuvar gerçekleştirmek basit yapmak gerekli. Cloacal masaj yıllardır kullanılıyor olsa da, mevcut gelen açıklamalar yazılı öğrenmek zordur. Bu yayın belirsizlik cloacal masaj öğrenmede yer ve zamanı azaltmak için tasarlanmıştır.
Meni cloacal masaj kullanarak kuşlardan toplanan hemen hareketliliği değerlendirme4,7 veya suni tohumlama8için kullanılan veya gelişmiş görüntüleme ve DNA ekstraksiyon gibi diğer kullanımlar için dondurulmuş. Sperm örneği ötücü kuşlar küçük ama yoğun paketlenmiş sperm barındırır. DNA sperm9özel koruyucu özellikleri üstesinden gelmek için değişiklikleri ile sadelik için bir ticari ekstraksiyon kiti kullanılarak elde edilir. Çıkarma sonra sperm telomerlerin qPCR10kullanılarak ölçülebilir.

<table><tbody><tr><td>Mikrohematokrit kılcal tüpler</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362566</td><td>Herhangi bir tedarikçi kullanılabilir. Daha küçük tüpler, yontma serçesi gibi çok küçük ötücü kuşlar gibi küçük semen örneklerinin toplanması için daha etkili olabilir.</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Herhangi bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Herhangi DNA</td><td></td><td>ekstraksiyonundan önce semen örneklerini saklamak için kullanılır.</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td>Herhangi bir tedarikçi kullanılabilir.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1233508</td><td>herhangi bir tedarikçi kullanılabilir.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td>Herhangi bir tedarikçi kullanılabilir.</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td>Herhangi bir tedarikçi kullanılabilir.</td></tr><tr><td>QIAamp DNA mikro kiti</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Qiagen QIAamp DNA mikro kiti özellikle tavsiye edilir. Bu DNA ekstraksiyon protokolü diğer ticari kitlerle denendi, ancak çok az başarı elde edildi. Bunun nedenleri bizim için bilinmiyor.</td></tr></tbody></table>

kuş sperm toplama cloacal masaj ve sperm dna izolasyonu

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Meni topluluğu çeşitli sperm kalitesi, sperm telomer dynamics ve epigenetik ilgili çalışmalar da dahil olmak üzere uygulamalar için yararlı olabilir. Kuşlar biyolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılan konulardır ve tekrarlanan sperm örnekleri içeren çalışmaları için idealdir. Ancak, az kaynak şu anda toplamak ve kuş sperm DNA ayıklamak nasıl öğrenmek isteyenler için kullanılabilir. Burada cloacal Masaj, kuş sperm toplamak için bir nazik, non-invaziv el ile teknik açıklayın. Ne kadar bu teknik literatürde kurulur, kullanılabilir açıklamaları öğrenmek zor olabilir. Ayrıca DNA kuş meni bir ticari ekstraksiyon kiti değişiklikleri ile kullanarak çıkarma hakkında bilgi sağlar. Cloacal masaj kolayca herhangi bir küçük ve orta boyutlu erkek kuş üreme durumda kullanılabilir. Koleksiyon meni hemen motilite testleri için kullanılan, veya burada açıklanan protokol sonrası DNA ekstraksiyon için dondurulmuş. Bu ayıklama protokolü için kuş sperm rafine ve başarıyla birçok ötücü türü (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanusve Turdus migratorius toplanan örnekleri üzerinde kullanılan ) ve bir columbid (Columba livia).

Cloacal masaj ve açıklanan protokol birçok ötücü türü ve bir columbid (Tablo 1) gerçekleştirilen ayıklama DNA'yı kullanarak. Sperm meni örneklerinin cloacal masaj tarafından toplanan varlığı 400 X büyütme (şekil 3) seyreltilmiş numune bir bileşik mikroskop altında küçük bir miktar ile ilgilenen tarafından doğrulandı. DNA sperm örneği açılan house burada açıklanan protokolü kullanarak serçeler toplanan sonra sekiz örnekleri Jel Elektroforez (ü...

Bu iletişim kuralı cloacal Masaj, kuşlar ve kuş sperm bir ticari ekstraksiyon kiti değişiklikleri ile kullanarak çıkarma DNA meni toplamak için bir non-invaziv el ile teknik açıklar.

Kuş sperm toplama Cloacal masaj ve Sperm DNA izolasyonu

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

Bu prosedürün genel amacı, erkek kuşlardan semen toplamak ve semen örneklerinden DNA izole etmektir. Bu yöntem, sperm rekabeti ve epigenetik kalıtım ile ilgili davranışsal ve evrimsel ekolojideki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kullanımının kolay olmasıdır.Kloakal masaj, sahada veya laboratuvarda hızlıca gerçekleştirilebilir ve DNA ekstraksiyon yöntemi, modifikasyonlar uygulanmış ticari bir kit kullanır. Bu teknik, üreme mevsimindeki yabanıl veya kafesteki kuşlarda kullanılabilir ve belirli kafes ortamlarında yıl boyunca etkili olabilir. Üreme açısından aktif olan erkeği, baskın olmayan elinizle kuş halkalayıcı tutuşuyla yakalayın.Ardından, ventral tarafı avuca değecek ve başı avucun lateral kenarında olacak şekilde baskın ele aktarın. Şimdi başı ve gövdeyi serçe, yüzük ve orta parmaklarla hafifçe sabitleyin. Kuşun kloakı ve kuyruğu şu an açığa çıkmış durumdadır.Bacaklar serbest bırakılabilir veya avuç içi kullanılarak hafifçe sabitlenebilir. Ardından, baskın elin işaret parmağı ve başparmağını kloakanın üst ucunun her iki yanına yerleştirip hafifçe sıkarak kuyruğa doğru hafif bir basınç uygulayıp kloakayı dışa doğru çevirin. Kuş semen üretmiyor değilse, pembe kloakal mukoza net bir şekilde görülmelidir.Deneyimle, reprodüktif olarak aktif ve inaktif erkeklerin kloaklarını birbirinden ayırt etmek kolaylaşır. Semen toplamak için, stabilite sağlamak amacıyla baskın olmayan elin işaret parmağının ucunu kuyruk tabanının dorsal tarafına yerleştirin ve ardından başparmağınızın ucunu dışa dönük kloakanın hemen altına yerleştirin. Kısa ve düzgün bir tırnak yapısı şiddetle tavsiye edilir.Şimdi, kuş ejaküle olana kadar orta şiddette bir basınçla, kloakanın altında kalarak başparmağınızı derin ve kranial yönde tekrarlayan hareketlerle hareket ettirin. Bu işlem tek bir hareket sürebileceği gibi onlarca hareket de sürebilir. Kuş ejaküle olur olmaz, vizkoz açık kahverengi semeni bir mikrohematokrit tüpüne toplayın.Beyaz veya koyu renkli maddeler kontaminandır, herhangi bir miktarda kan ise çok fazla basınç uygulandığını gösterir. Gerektiğinde, birden fazla ejakülat elde etmek için masaj işlemini tekrarlayın. DNA ekstraksiyonu için örneği, 20 µL PBS içeren bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.Numunedeki sperm varlığını doğrulamak için, seyreltilmiş numuneden küçük bir miktarı bir bileşik mikroskobunda 400X büyütmede inceleyin. Ardından, sperm numunelerini ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de saklayın. Bu protokol, ticari bir kitin modifikasyonudur.Su içerisinde 1 molar DTT'nin 10 µL'lik alikotlarını hazırlayıp -20 °C'de saklayın. DNA ekstraksiyonuna başlamadan hemen önce, her bir örnek için bir alikot DTT ile bir alikot tris klorürü karıştırın. Ardından, her örneğe 70 µL PBS ekleyin ve karışımları vorteksleyin.Ardından, her örneğe bir miktar DTT tampon karışımı ve 10 µL proteinaz K çözeltisi ekleyin. Örnekleri karıştırmak için 20 saniye boyunca vorteksleniz. Şimdi örnekleri, çalkalayıcı üzerinde 65 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve örnekleri hafif ajitasyonla bir saat boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından, 200 microliters tampon AL ve 200 microliters taze %100ethanol ekleyin ve örnekleri 20 saniye boyunca vorteksleyin. Ardından her bir örneği bir spin kolona aktarın ve örnekleri 6,000G hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin. Toplama tüpünü atın ve kolonları yeni tüplerin üzerine yerleştirin.Kolona 500 µL buffer AW1 ekleyin ve kolonları tekrar santrifüjleyin. Toplama tüplerini tekrar atın ve kolonları yeni tüplere yerleştirin. Şimdi 500 µL buffer AW2 ekleyin ve santrifüj döngüsünü tekrarlayın.Ardından akış sıvısını atın ve spin kolonunu santrifüje geri yerleştirerek bu kez 20,000G'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra toplama tüpünü atın ve kolonu bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Şimdi doğrudan kolon membranının üzerine 35 µL tampon AE ekleyin ve çözeltinin DNA'yı oda sıcaklığında beş dakika boyunca elüye etmesine izin verin.Ardından, DNA içeren elüsyon tamponunu 60 saniyelik santrifüjleme ile mikro santrifüj tüpüne aktarın. Şimdi kolonları atın ve DNA'yı -80 °C'de saklayın. Tarif edilen kloakal masaj ve DNA ekstraksiyon yöntemleri, birkaç passerin türünde ve bir Columbid türünde başarıyla kullanılmıştır.Ekstre edilen DNA'nın jel elektroforezinde, yayılma olmadan belirgin bantların görülmesi, yüksek kaliteli DNA'nın başarıyla izole edildiğini gösterir. Bu örnek, ev serçesi semeninden elde edilen DNA'dır. Bu videoyu izledikten sonra, reprodüktif erkek kuşlardan kloakal masaj yoluyla semen örneklerinin nazikçe nasıl toplanacağını ve bir ekstraksiyon kiti kullanarak bu semen örneklerinden DNA'nın nasıl ekstre edileceğini iyi bir şekilde anlamış olmalısınız.Kloakal masaj, doğru şekilde uygulandığında ve tekniğe hakim olunduğunda sadece birkaç saniye içinde tamamlanabilir.

avian-semen-collection-cloacal-massage-isolation-dna-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Erkeğin spermatid yalıtma ve etkinleştirmek için bir...

İzolasyon ve In vitro Etkinleştirme Caenorhabditis elegans Sperm

Bu video, menide spermatozoa yokluğu ile karakterize bir durum olan azospermili bir hastadan epididimal spermatozoanın perkütan aspirasyonunu göstermektedir. Prosedür, skrotal alanın dezenfekte edilmesini, epididimal sıvının özel bir kültür solüsyonu ile bir şırınga kullanılarak aspire edilmesini ve canlı spermatozoayı izole etmek için toplanan numunenin işlenmesini içerir. Hazırlanan spermler daha sonra ileri kısırlık tedavi prosedürlerinde kullanıma hazır hale gelir.

Perkütan Epididimal Spermatozoa Aspirasyonu ve İşlenmesi için Bir Teknik

Erkek germ hattındaki de novo mutasyonlar, sonraki nesillerde olumsuz sağlık sonuçlarına katkıda bulunabilir. Burada, çevresel ajanlar tarafından indüklenen erkek germ hücrelerindeki mutasyonları ölçmek için bir transgenik kemirgen modelinin kullanımı için bir protokol açıklıyoruz.

Transgenik Kemirgen Deneyi sayısallaştırabilmek Erkek Germ Hücre Mutant Frekans

Bu yazıda, yoğunluk gradient Santrifüjü tekniği ve sperm Fizyoloji araştırma kendi uygulamasında performansını açıklayan hedefliyoruz.

Sperm yoğunluğu degrade Santrifüjü kullanarak fark kalitesini topluluğu

In vitro fertilizasyon, laboratuvar nüfusunu korumak ve akım uygulamaları için senkronize embriyolar üretmek için çeşitli model organizmalar ile yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Burada, biz Meksika Tetra balık, Astyanax mexicanusfarklı nüfusu için bu tekniği uygulayan bir protokol sunuyoruz.

Gamete koleksiyonu ve Astyanax mexicanus In vitro fertilizasyon

Burada sunulan pachytene spermatositler zenginleştirmek için bir protokol, yuvarlak spermatidler, ve yetişkin fare testislerinden uzayan spermatidler standart laboratuvar ekipmanları ile bir kesintili sığır serum albumin yoğunluğu gradyanı kullanarak.

Standart Laboratuvar Ekipmanları Kullanılarak Fare Testlerinden Pachytene Spermatosit ve Spermatidlerin Zenginleşmesi

Burada yetişkin fare testislerinden canlı meiotik ve post-meyotik mikrop hücrelerini izole etmek için basit ve etkili bir yöntem salıyoruz. Düşük sitotoksisite, menekşe heyecanlı DNA bağlayıcı boya ve floresan-aktive hücre sıralama kullanarak, bir birçok downstream uygulamaları için son derece zenginleştirilmiş spermatojenik hücre popülasyonları izole edebilirsiniz.

Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon

Bu protokol, iyon kanalı aktivitesini doğrudan kaydetmek amacıyla, tüm hücre konfigürasyonunda memeli sperm hücrelerinden elektriksel kayıtların nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Yöntem, çeşitli sperm iyon kanallarının elektrofizyolojik profillerini tanımlamada etkili olmuş ve moleküler kimliklerini ve regülasyonlarını ortaya çıkarmaya yardımcı olmuştur.

Memeli Sperm Hücrelerinin Plazma Zarı Boyunca Elektrik Akımlarının Kaydedilmesi

Bu protokol, sperm motilite özellikleri ve timotaksis kullanılarak düşük DNA parçalanma indeksine sahip yüksek kaliteli spermlerin taranması için bir yöntemi tanımlar. Yöntem, U şeklinde yatay bir yüzme şeridi kullanır ve yüksek kaliteli spermin tampon damlacıklar yoluyla karşı tarafa ulaşmasını sağlarken, ölü sperm, hücre kalıntıları ve safsızlıklar hariç tutulur.

Düşük DNA Parçalanma İndeksine Sahip Yüksek Kaliteli Sperm Hazırlamak İçin U Şeklinde Yatay Yüzme Tekniği

Bu prosedür, 2H2O veya U13C Glukoz ile stabil izotop etiketleme ve ardından metabolomik analiz kullanılarak döllenme sırasında spermden oositlere aktarılan metabolitleri tanımlamayı amaçlar. Döteryum etiketli sirler, etiketlenmemiş barajlarla eşleştirilir. Toplanan implantasyon öncesi embriyolar, maternal (döteratlanmamış) metabolitlerden paternal (döteratlanmış) metabolitleri ayırmak için kütle spektrometresi ile analiz edilir.

Döllenme Sırasında Spermden Oosit'e Aktarılan Baba Metabolitlerinin Kütle Spektrometresi Tanımlaması için Kararlı İzotop In-Vivo Etiketleme

Bu protokol, kriyokonsertif at menisinden canlı somatik hücreleri (SC'ler) izole etmek için basit bir mikroaspirasyon tekniği sunar. Geleneksel yaklaşımların aksine, bu teknik uzun in vitro kültürlerden kaçınır ve sperm kontaminasyonunu engeller; böylece somatik hücre klonlamasında hemen kullanılmasını sağlar.

Klonlama için Nükleer Donör olarak Kryokonserif At Sperminden Somatik Hücreleri İzole Etmek İçin Basit Bir Mikroaspirasyon Tekniği

Öğrenin, kuşlarda kloakal masaj ile spermatozoa toplama ve DNA izolasyonu yöntemlerini. Bu protokol, davranışsal ve evrimsel ekoloji çalışmalarında yüksek kaliteli DNA elde etmeyi sağlar.

Kuş sperm toplama Cloacal masaj ve Sperm DNA izolasyonu

Daha fazla video keşfet