Bir HS-MRM tahlil için Protein Biyofarmasötikler sıvı Kromatografi iyon hareketlilik QTOF kütle spektrometresi tarafından Host-hücre proteinleri miktar

HS-MRM testinin genel amacı, peptit öncüllerinin iyon hareketliliğini, ayrılmasını fragman iyonlarının yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrik tespiti ile birleştirerek peptit veya protein kantifikasyonunu etkileyen MRM girişim fenomenini azaltmaktır. Bu yöntem, biyoterapötik karakterizasyonun yanı sıra protein veya peptit biyobelirteç miktar tayini ve kantitatif proteomik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, biyofarmasötik proteinlerde bulunabilecek düşük miktarda konak hücre proteinlerinin saptanmasına izin vermesidir.

İlk olarak, veri toplama yazılımında analiz yöntemi oluştur'a tıklayın ve oluştur ve al ve işle yöntemini seçin. Yöntem adını ve açıklamasını yazın, yöntem klasörüne göz atın ve ileri'ye tıklayın. Analiz türü için peptit haritası IMS'yi seçin ve ileri'ye tıklayın.

Ardından mevcut sistem yapılandırmasını seçin ve ileri'ye tıklayın ve bitirin. Yeni oluşturulan yöntemde, cihazlar sekmesine tıklayın, ikili çözücü yöneticisini seçin ve dakikada 0,2 mililitrelik bir akış hızında peptit ayrımı elde etmek için gradyan ayarlarını düzenleyin. 30 dakikada bir ila %40 çözücü B'den bir gradyan seyreltmesi kullanın, ardından iki dakikalık bir kolon yıkama ve toplam 45 dakikalık bir çalışma süresi ile 10 dakikalık bir dengeleme yapın.

Ardından, numune yöneticisini seçin ve numune sıcaklığını 10 santigrat dereceye ve sütun sıcaklığını 60 santigrat dereceye ayarlayın. Enstrümanlar sekmesinde Vion IMS QTof enstrümanını seçin. Ayarlar bölümünde, analizör modu için hassasiyeti seçin ve kılcal voltaj için üç kilovolt, kaynak sıcaklığı için 100 santigrat derece, çözünme sıcaklığı için 250 santigrat derece, koni gazı akışı için saatte 50 litre ve çözünme gazı akışı için saatte 500 litre girin.

Deney sekmesine tıklayın ve mod için yüksek tanımlı MSE'yi seçin. Ardından düşük kütle için 100, yüksek kütle için 2000 ve tarama süresi için 0,4 saniye girin. Çarpışma enerjisi bölümünde, düşük enerji ayarı için altı elektron volt yazın ve 15 ila 40 elektron volt arasında yüksek enerjili bir rampa seçin.

Alım süresi için beş ile 30 dakika arasında özel bir çalışma zamanı kullanın. Ardından, seçenekler sekmesine tıklayın ve beş dakikalık otomatik kilit düzeltme aralığı ile otomatik kilit düzeltme modunu seçin. Ardından kilit düzeltmeye devam et seçeneğini seçin ve otomatik dedektör kontrolünün devre dışı bırakıldığından emin olun.

Mevcut sistem konfigürasyon menüsünde Vion IMS QTof cihazını seçin ve araçlara tıklayın. Kılcal voltaj için üç kilovolt, örnekleme konisi için 40 volt, kaynak ofseti için 100 volt, kaynak sıcaklığı için 100 santigrat derece, çözünme sıcaklığı için 250 santigrat derece, koni gazı akışı için saatte 50 litre, çözünme gazı akışı için saatte 500 litre ve referans kılcal voltaj için üç kilovolt girin. Cihaza 10 mikrolitre numune enjekte ederek az önce açıklanan LC-HDMSE testini kullanarak önceden hazırlanmış 10 nanomolar sahte çivili numuneyi analiz edin.

Sahte peptit karışımında bulunan altı fosforilaz B peptit standardının ayrı ayrı dizileri, tutma süreleri ve HDMSE deneyinde gözlemlenen en bol öncüleri ile birlikte burada gösterilmektedir. Infliximab sindiriminde sivri uçlu sahte peptitlerden biri için elde edilen HDMSE spektrumları burada gösterilmektedir. Veri toplama yazılımında, analiz yöntemi oluştur'a tıklayın ve oluştur ve elde et ve işle yöntemini seçin.

Yöntem adını ve açıklamasını yazın, yöntem klasörüne göz atın ve ileri'ye tıklayın. Analiz türü için niceliklendir'i seçin, Ölç Testi Tof 2D Kromatografik Ölç'ü seçin ve ileri'ye tıklayın. Ardından mevcut sistem yapılandırmasını seçin ve ileri'ye tıklayın ve bitirin.

Yeni oluşturulan yöntemde enstrümanlar sekmesine tıklayın. Dakikada 0,2 mililitrelik bir akış hızında peptit ayrımı elde etmek için ikili çözücü yöneticisini seçin ve gradyan ayarlarını düzenleyin. 30 dakikada bir ila %40 çözücü B'den gradyan seyreltme kullanın, ardından iki dakikalık bir kolon yıkama ve toplam 45 dakikalık çalışma süresi ile 10 dakikalık bir dengeleme yapın.

Araçlar sekmesinde numune yöneticisini seçin ve numune sıcaklığını 10 santigrat dereceye ve sütun sıcaklığını 60 santigrat dereceye ayarlayın. Şimdi Vion IMS QTof cihazını seçin ve ayarlar bölümünde analizör modu için hassasiyeti seçin. Daha sonra kılcal voltaj için üç kilovolt, kaynak sıcaklığı için 100 santigrat derece, çözünme sıcaklığı için 250 santigrat derece, koni gazı akışı için saatte 50 litre ve çözünme gazı akışı için saatte 500 litre girin.

Deney sekmesine tıklayın ve deney türü için işlev tablosundan bir veya daha fazla MS, MSMS veya MRM işlevini seçin. Varsayılan alma işlevini silin, artı MRM ekle'ye tıklayın ve çalışma zamanı bölümünde bekletme penceresi parametrelerini düzenleyin. Tof MRM işlev düzenleyicisinde, peptit öncüsü ana şarj oranını girin, öncü çözünürlük için düşük'ü seçin ve öncü şarj durumunu girin.

Ardından, ürün ana şarj oranını başlangıç çarpışma enerjisi için 16 elektron volt, sabit tarama süresi için 0,1 saniye ve spektrum sütunu için geniş olarak girin. Çoğalt düğmesini kullanarak 10 MRM geçişi daha ekleyin ve 18 ila 36 elektron volt aralığında farklı çarpışma enerjisi değerleri kullanın. Her peptit için en iyi üç geçişi belirledikten sonra, her bir peptit için üretilen sinyalleri en üst düzeye çıkarmak için optimum çarpışma enerjisini bulmak için bir Tof MRM deneyi yapıldı.

Ardından, peptit başına yalnızca bir fragman iyonu içeren bir HS-MRM yöntemi ayarlayın. Tof MRM işlevi yerine HS-MRM işlevini seçerek daha önce oluşturulan Tof MRM yöntemini değiştirin. HS-MRM işlev düzenleyicisinde ana şarj oranını girin, öncü çözünürlük için düşük'ü seçin ve öncü şarj durumunu girin.

Ardından öncü CCS değerini girin ve öncü CCS çözünürlüğü için düşük'ü seçin. Ürün iyonu için ana şarj oranını girin, optimum çarpışma enerjisini seçin, 0,4 saniyelik bir tarama süresi seçin ve tüm izotoplarını içerecek geniş bir spektrum ayarı seçin. Son HS-MRM testi, her peptit için yalnızca en iyi geçişi korur ve tüm çivili numuneleri analiz etmek için kullanılır.

HS-MRM veri toplama yöntemi için oluşturulan analiz yönteminde amaç sekmesine tıklayın ve bileşenleri yönet'i seçin. Deneme türü altındaki açılır menüden HS MSMS/HS MRM seçeneğini belirleyin. Oluştur'a tıklayın ve bileşen adını, beklenen bekletme süresini, çıkarma süresi penceresini ve öncü ana şarj oranını girin.

XIC çıkarma modunu seçin ve beklenen CCS değerini yazın. Parça iyonu için şarj durumunu ve ana şarj oranını girin. Ardından HS-MRM testi tarafından izlenen tüm peptit bileşenlerini girin.

Aynı HS-MRM edinme yönteminin amaç sekmesinde, varsayılan miktarlara tıklayın ve tüm sahte peptit bileşenleri için 0.1, bir, 10 ve 100 nanomolar girin. İlk değeri girdikten sonra, tüm bileşenler için aynı konsantrasyonu girmek için sağ tıklayın ve doldur seçeneğini seçin. Kalibrasyon eğrisinin dört konsantrasyonunun tümü için aynı prosedürü tekrarlayın.

Şimdi işleme sekmesine gidin ve çıkarma ayarlarına tıklayın. Kütle toleransı için 10 PPM girin. Ardından CCS sapma süresi toleransına tıklayın ve CCS toleransı için %5 girin.

İşleme sekmesinde, en yüksek işleme ayarlarını seçin. Düzgünleştirme bölümünde, düzgünleştirme algoritması olarak ortalama'yı, yarım genişlik olarak birini ve yinelemeler olarak birini seçin. Tümleştirme bölümünde, otomatik tepe genişliği ve otomatik algılama seçeneklerinin her ikisinin de işaretli olduğundan emin olun.

Ardından, işleme sekmesinde hedeflenen ekran ayarlarını seçin ve RT penceresinde RT'ye en yakın seçeneğini seçin. Ardından tutma süresi toleransı için 0,2 dakika girin. Kantitasyon ayarlarını seçin ve kalibrasyon menüsünde, kalibrasyon eğrisi uyum türü için doğrusal, ağırlık türü için x üzeri bir kare, bileşen değer türü için konsantrasyon, bileşen değer birimleri için litre başına milimol ve kalibrasyon noktalarının ortalamasını alarak hesaplamak için hiçbiri'ni seçin.

Niceleme menüsünde, yanıt değeri olarak alanı seçin. Tüm konsantrasyonlarda sahte peptitler için üretilen HS-MRM kromatogramlarının örnekleri burada sunulmaktadır. HS-MRM piklerinin entegrasyonunu takiben her bir peptit için elde edilen kalibrasyon eğrileri burada görüntülenir.

Dört tekrarlanan enjeksiyona dayalı olarak hesaplanan tepe alanı nispi standart sapması burada özetlenmiştir. Yüksek seçiciliğe sahip MRM testi, hem iyon hareketliliği öncü ayrımını hem de hedeflenen yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrik algılamasını içerdiğinden, biyofarmasötik partileri arasında birden fazla konak hücre proteini için hızlı, yüksek verimli bir izleme testi olma konusunda büyük bir potansiyele sahiptir. Bu videoyu izledikten sonra, bir Vion IMS QTof cihazında yüksek seçiciliğe sahip bir MRM testinin nasıl kurulacağını iyi anlamış olmalısınız.