Name: Bir HS-MRM tahlil için Protein Biyofarmasötikler sıvı Kromatografi iyon hareketlilik QTOF kütle spektrometresi tarafından Host-hücre proteinleri miktar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Öğrenin HS-MRM yöntemiyle biyofarmasötiklerdeki düşük yoğunluklu konak hücre proteinlerini iyon hareketlilik ayrımı ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi kullanarak nicel olarak analiz etme. Bu teknik biyoterapötik karakterizasyonu ve proteomik çalışmaları için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Lesley Malouin ve Tony Catlin suları Corporation şekilde alt alta yazılmalıdır şekil 6 hazırlamak için teşekkür etmek istiyorum.

1. infliksimab Özet (~ 24 h yordam) hazırlık
<ol><li>50 mM amonyum bikarbonat, %1 50 mM NH4HCO3, 500 mM dithiothreitol (DTT) 50 mM NH4HCO3ve 500 mM iodoacetamide (IAM) 50 mM NH4HCO3Anyonik yüzey aktif taze çözümleri hazırlayın.</li>
	<li>750 µL 50 mM NH4HCO3için eklemek infliksimab mAb (10 mg/mL) 200 µL ve 50 µL % 1 Anyonik yüzey aktif çözüm ve varlığında % 0.05 Anyonik yüzey aktif 60 ° C'de 15 dakika için protein denatüre.</li>
	<li>500 mm DTT 40 µL ekleyin ve 20 mM DTT huzurunda 60 ° C'de 60 dk için örnek azaltmak.</li>
	<li>500 mm IAM 20 µL ekleyin ve örnek ~ 10 mM IAM huzurunda karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika alkylate.</li>
	<li>Microcentrifuge tüp içeriği MS sıralama sınıf Lys C/tripsin 20 µg içeren bir cam şişe ekleyin ve 37 ° C'de 3 h için örnek sindirmek</li>
	<li>MS sıralama sınıf Lys C/tripsin ve Özet örnek gecede (12-15 h) 37 ° C'de 20 µg içeren başka bir cam şişe için sindirilmiş örnek aktararak ikinci enzim aliquot (20 µg) Ekle</li>
	<li>Gecede proteolizis sonra %100 formik asit (FA) 5 µL ekleyin ve sindirmek için 30 dk 37 ° C'de asit değişken Anyonik yüzey aktif çürümeye kuluçkaya.</li>
	<li>Spin aşağı sindirmek için Anyonik yüzey aktif çözünmez bileşeni çökelti santrifüj 4.000 x g, 15 dak.</li>
	<li>~ 1000 µL infliksimab Özet, yeniden elde etmek ve bir LC otomatik örnekleyici şişede yerleştirin; Özet konsantrasyon ~ 2 mg/mL olması gerekir. LC/MS sistem analiz için hazır olması ne kadar "denemeler" den bir dondurucu-20 ° C'de depolayın.</li>
</ol>2. spiking peptid standartları (~ 30 dk)
<ol><li>İnfliksimab Özet donmuş örnek oda sıcaklığında bir bankta cam şişe koyarak çözülme.</li>
	<li>1 mL %0.1 1 µM hisse senedi çözümleri PHO tüm altı peptid standartları hazırlamak için SK H2O bir tavşan phosphorylase b (PHO) Özet şişe içinde (şişe her peptid 1 nmol içerir) şişede bulunan ekleyin.</li>
	<li>4 x 1-mL dilutions 0,1, 1, 10 ve 100 nM peptidler, % 0,1 kullanarak içeren çözümler elde etmek için PHO hisse senedi çözümün hazırlamak seyreltme solvent olarak SK. Cam şişe (LC otomatik örnekleyici şişeleri) içinde tüm dilutions hazırlamak ve 100 µL infliksimab Özet arka plan matris için tüm şişeleri ekleyin. Özet arka plan üzerinde-sütun 2 µg her 10 µL enjeksiyon ile yükleyin. Seyreltilmiş infliksimab Özet içeren boş bir örnek hazırlamak (aynı 1:10 seyreltme), çivili yok peptidler ile.</li>
</ol>3. Kurulum LC/HDMS E veri alma yöntemi
Not: bir HS-MRM Alım ayarlamak için gerekli adımları özetleyen iş akışı şekil 1'de tasvir ve ayrıntılı bölümleri 3-6 açıklanmıştır. Bir veri bağımsız HDMSE veri kümesi edinimi izlenen her peptid, üst m/z electrospray iyonlaşma, takip en bol peptid iyon tutma zamanı kurmak için gerekli ve ilgili CCS (collisional cross Bölüm) iyon hareketlilik ayrılması türetilmiş. Buna ek olarak, veri-bağımsız veri kümesi her peptid öncü için üç en bol parçası iyonlar m/z ilgili bilgiler sağlar. İş akışı (CE optimization) İkinci adımda, testin duyarlılığı her parçası iyon için en yüksek iyon yoğunluğu elde etmek için çarpışma hücre enerji tuning tarafından artırılır. Son olarak, son adımda, yukarıda açıklanan tüm parametreleri için izlenen her peptid HS-MRM Düzenleyicisi tanıtılmaktadır.
<ol><li>LC/MS deneyler bir veri bağımsız Alım yöntemi (HDMSE) kullanarak bir ultra performanslı sıvı Kromatografi Sistemi birleştiğinde bir quadrupole uçuş saat (QTOF) Kütle Spektrometre gerçekleştirin. Not: Malzeme bölümünde enstrüman yapılandırması hakkında daha ayrıntılı bilgi eklenmiştir. Bu araç bir seyahat eden dalga iyon hareketlilik aygıtı peptid öncüleri10ayrılması için kullanır.</li>
	<li>%0.1 SK (a Solvent) suda ve %0,1 içeren iki mobil aşama hazırlamak SK Asetonitril (Solvent B) içinde. Not: çivili mAb digests ayrılması için bir şarj edilmiş yüzey hibrid (CSH) C18 sütun (2.1 x 150 mm, 1.7-µm parçacıkları ile Paketli) kullanın.</li>
	<li>Veri toplama yazılımı "Oluştur/analiz yöntemi"'ı tıklatın ve seçin "Işleme yöntem ve bir satın alma oluşturur." Yöntem adı yazın, yöntem klasörü (dizin) bulun ve "Next".</li>
	<li>"Analiz türü," için "peptid harita (IMS)" seçin ve "Kuaterner Solvent Yöneticisi" enstrüman "Enstrüman sistem" sekmesinde seçin. Peptid ayrılık 200 µL/dk. kullanım % 40'a Solvent B 30 dk içinde ardından 2-min sütun yıkama ve 9-min denge bir degrade elüsyon-1 akış hızında elde etmek, bir toplam 50 dk. çalışma zamanı ile bu deneysel tanıtmak için degrade ayarlarını düzenle LC yöntemi düzenleyicisi parametrelerinde.</li>
	<li>"Araç sistemi" sekmesinde "Örnek Yöneticisi" aracı seçin. Numune sıcaklığı 10 ° C ile 60 ° C'ye sütun sıcaklık için ayarla</li>
	<li>QTOF Kütle Spektrometre pozitif iyon 30.000 FWHM tipik bir çözme gücü ile ESI duyarlı tarz içinde çalışır. Not: LC/HDMSE hızla çarpışma enerjiler (çarpışma hücresinde) alternatif ile inceden inceye gözden geçirmek toplayarak çalışır bir veri bağımsız edinme (DIA) modu düşük enerji (MS Kanal 1 inceden inceye gözden geçirmek için 6 V) ve (15 - 40 V rampa için yükseltilmiş bir enerji arasındadır «««üretmek) parçalanma spectra 2 MS kanaldaki habercisi seçimi olmadan.<ol>
<li>Veri toplama yazılımı varsayılan kaynak ile ilgili MS parametrelerini girin: "Benim çalışma/enstrüman sistem," dan "Vion IMS Qtof" sekmesini seçin ve "Araçlar" menüsünden, bu parametreleri girin: 3.0 kV kapiller gerilim, 100 ° C kaynak sıcaklık, 100 V kaynak ofset, 50 L/h gaz akışı ve 40 V koni gerilim koni. 250 ° C, desolvation gaz debisi 500 L/h ve 3.0 için başvuru kapiller voltaj desolvation sıcaklığı ayarlamak kV.</li>
		<li>Veri toplama yazılımı "Oluştur/analiz yöntemi"'ı tıklatın ve seçin "Işleme yöntem ve bir satın alma oluşturur." Yöntem adı yazın ve yöntem klasörü (dizin) bulun ve sonra "İleri" düğmesini tıklatın</li>
		<li>"Analiz türü," için "peptid harita (IMS)" seçin ve "Vion IMS QTof" enstrüman "Enstrüman sistem" sekmesini seçin. "Son" u tıklatın Not: Yeni oluşturulan LC/HDMSE yöntemi otomatik olarak "Enstrüman yöntemi yapılandırma" ekranı açılır.</li>
		<li>"Koyma" etiket, bu parametreleri girin: 3.0 kV kapiller gerilim, 100 ° C kaynak sıcaklık, 250 ° C'ye kadar desolvation sıcaklığı, 50 L/h koni gaz akışı ve 500 L/h desolvation gaz akışı.</li>
		<li>"Deney" sekme ayarlarını "Yüksek çözünürlüklü MSE"ve "Analiz yöntemi çalışma zamanı." u seçin "Tarama koyma" etiket, bu parametreleri girin: düşük kütle, 100; yüksek kitle, 2000; ve zaman, "CE" sekmesinde 400 Bayan inceden inceye gözden geçirmek, "6 V" düşük enerjili ayarı için yazın ve yüksek enerjili bir rampa 15 ila 40 f. "kontrol sakatlar veri azaltma" var emin olun seçin.</li>
		<li>% 0,1 ile % 50 Asetonitril hazırlanan 50 ng/mL lösin enkephalin (LE) bir çözüm demlemek SK 10 µL/dk'ya kilit-kütle kalibrasyon veri toplama sırasında akış hızında. Not: Kilit-kütle veri her 5 dk aynı kitle aralığında aynı edinme kuru kullanılarak elde edilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjekte etme 10 µL (yüklü miktar üzerinde-sütununu her peptid standart için 100 fmol IS) örneği tarafından yukarıda açıklanan LC/HDMSE tahlil kullanarak 10 nM, PHO çivili örneğini analiz.</li>
</ol>4. Kurulum Tof-MRM yönteminin çarpışma enerji (CE) en iyi duruma getirme
<ol><li>LC/HDMSE kümesinden tutma zamanı, habercisi ve parça iyon m/z her PHO peptid için edinin. M/z ve en bol için şarj durumunu korumak habercisi iyon ve karşılık gelen üç en bol parçası iyonları. Not: Bu şekil 2'genellikle LC/HDMSE tahlil tarafından kaydedilen düşük enerjili ve yüksek enerjili spectra ürününün bir örnek gösterilmiştir.</li>
	<li>Çarpışma enerji (CE) en iyi duruma getirme bir SRM/MRM denemede her peptid23en iyi sinyal almak için kullanın.<ol>
<li>Veri toplama yazılımı "Oluştur/analiz yöntemi"'ı tıklatın ve seçin "Işleme yöntem ve bir satın alma oluşturur." Yöntem adı yazın, yöntem klasörü (dizin) bulun ve "Next".</li>
		<li>"Analiz türü" için "Sayabilirsiniz." seçin "Miktarını tahlil 2D Tof Kromatografik" seçin ve "Next" tıklayın "Araç sistemi" sekmesinde, "Vion IMS QTof" seçin ve "Son" u tıklatın Not: Yeni oluşturulan Tof-MRM yöntemi otomatik olarak "Enstrüman yöntemi yapılandırma" ekranı açılır.</li>
		<li>"Koyma" etiket, bu parametreleri girin: 3.0 kV kapiller gerilim, 100 ° C kaynak sıcaklık, 250 ° C'ye kadar desolvation sıcaklığı, 50 L/h koni gaz akışı ve 500 L/h desolvation gaz akışı.</li>
		<li>"Deney" sekmesi ayarları "İşlev tablosu" ve "bir veya daha fazla MS, MSMS veya MRM fonksiyonları." u seçin Aşağı ok tuşlarını kullanarak, her peptid "Tof-MRM" işlevi üç "geçiş" (en bol habercisi ve üç en bol onun parçası iyonlar kombinasyonları) girerek ayarlayın. Not: Tof-MRM modunda bir zamanlanmış MRM yaklaşım kullanarak en yüksek hassasiyet elde edilir.</li>
		<li>"Tof-MRM" fonksiyon Düzenleyicisi'nde, peptid elüsyon sırasına göre düzenlenmiş bir tutma zaman penceresi her peptid (en az 1 dakika uzun), için seçin. "Tof-MRM" fonksiyon Düzenleyicisi'nde, peptid habercisi m/z ve ürün m/z Ekle; Çift yalıtım pencere için peptid habercisi "düşük" (4-Da pencere) seçin; Sabit tarama süresi 100 MS seçin; ve on iki farklı çarpışma enerji değerleri 14-36 V, aralığı içinde aşağıdaki gibi seçin: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ve 36, şekil 3 örnekte gösterildiği gibi. Not: yukarıda açıklanan Tof-MRM yöntemi ile belirtilen her CE, her geçiş için en az 10 veri noktaları Kromatografik tepe başına toplanır. Veri dosya boyutunu azaltmak için parça iyon sinyal için "Geniş" seçeneği (6-Da pencere) seçin. CE en iyi duruma getirilmiş değer örnekleri tablo 2'de gösterilmiştir.</li>
		<li>Enjekte etme 10 µL (yüklü miktar üzerinde-sütununu her peptid standart için 100 fmol IS) örneği tarafından yukarıda açıklanan Tof-MRM tahlil kullanarak 10 nM, PHO çivili örneğini analiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Kurulum iyon hareketlilik ayrılması peptid öncüleri kullanarak peptid miktar için son HS-MRM satın alma yönteminin
<ol><li>Veri toplama yazılımı "Araştır" menüde her CE her peptid için oluşturulan tüm 11 Kromatografik izlemeler görüntülemek ve tepeler "işleme seçenekleri/çalıştırma" araç çubuğundan "Entegre" düğmesini kullanarak entegre; en yüksek tepe alan her bir geçiş için en iyi CE belirtir.</li>
	<li>Görsel olarak iyi pik alanları her peptid 3 parçaları için karşılaştırın ve sadece en iyi "geçiş" (parça iyon); en yoğun sinyal üreten korumak Tablo 2 en iyi "dört PHO peptidler elde edilen geçişler" görüntüler.</li>
	<li>Peptid başına yalnızca bir parçası iyon içeren bir HS-MRM yöntemi kur. LC/HDMSE veri kümesinden gelen her peptid habercisi CCS değerlerini kullanın.<ol>
<li>(Bölüm 4) önceki bölümde oluşturduğunuz Tof-MRM yöntemi "Tof-MRM" işlevi yerine "HS-MRM" işlevi seçerek değiştirin.</li>
		<li>"HS-MRM" fonksiyon Düzenleyicisi'nde, öncül ile ilgili aşağıdaki parametreleri girin: m/z, quadrupole çözünürlüğü: düşük (4 Da), şarj durumu, öncü CCS değeri ve öncü CCS çözünürlüğü: düşük. Ürün iyon için onun m/z, optimum çarpışma enerji girin, bir inceden inceye gözden geçirmek zaman 0.4 s ve seçin seçin tüm onun izotoplar içerecek şekilde bir "Geniş" spektrum ayarı (6 Da). Şekil 4'te bu son HS-MRM edinme yöntem tüm dört peptidler için bir örnek gösterilmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 Çoğalt enjeksiyonlari aşağıdaki konsantrasyonları tarafından (10 µL her) takip boş mAb Özet ile başlayan HS-MRM yöntemini kullanarak tüm örnekleri (örnek) sigara çivili, analiz: 0.1, 1, 10 ve 100 nM PHO peptidler.</li>
</ol>6. HS-MRM veri kümesi analizi için işleme yöntemi oluşturulması
<ol><li>HS-MRM veri kümesi analizi için işleme yöntemi oluşturun.<ol>
<li>Analiz yöntemi, "HS-MRM" veri toplama yöntemi için oluşturulan "Amaç" sekmesinde tıklatın ve seçin "Yönetme bileşenlerin."</li>
		<li>"Deneme türü" altında açılan menüden "HS MS/MS/HS-MRM" seçeneğini seçin.</li>
		<li>Tıklayın "Oluştur/New girişindeki" ve işleme yöntemi düzenleyicisi Aşağıdaki parametrelerde tanıtmak: peptid tutma zamanı (RT), öncül şarj durumu, öncü m/z ve habercisi drift zamanı (DT). Parça iyon için m/z ve şarj durumunu girin ve "XIC" izleme ayıklama modu olarak belirtin.</li>
		<li>Aynı "HS-MRM" satın alma yöntemi "Amaç" sekmesinde, "Varsayılan tutarları" tıklatın ve aşağıdaki konsantrasyonları girin: 0.1, 1, 10 ve 100 nM PHO peptidler.</li>
		<li>"İşleme/ayıklama ayarlar" aşağıdaki parametreleri girin: varsayılan yığın hoşgörü, 10 ppm (için tüm parça iyonları m/z) ve varsayılan saat, % 5; drift PHO peptid işleme yöntemi örneği Şekil 5'te gösterilmiştir.</li>
		<li>Doğrusal eğri uydurma 1 / X2 ağırlık kalibrasyon türü için seçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüm chromatograms entegre etmek ve her PHO peptid kalibrasyon eğriler oluşturmak için HS-MRM verileri işlemek.</li>
</ol>

<ol><li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+host-cell+proteins+in+biotherapeutic+proteins+by+comprehensive+online+two-dimensional+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry.</a> MAbs. 4, 24-44 (2012).</li>
<li>Schenauer, M. R., Flynn, G. C., Goetze, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+host-cell+protein+impurities+in+biotherapeutics+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification of host-cell protein impurities in biotherapeutics using mass spectrometry.</a> Anal Biochem. 428, 150-157 (2012).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+tracking+of+host-cell+proteins+during+monoclonal+antibody+purifications+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Comprehensive tracking of host-cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry.</a> MAbs. 6, 659-670 (2014).</li>
<li>Farrell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+host-cell+protein+analysis+using+two-dimensional+data+independent+LC-MS%28E%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative host-cell protein analysis using two-dimensional data independent LC-MS(E).</a> Anal Chem. 87, 9186-9193 (2015).</li>
<li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+low-abundance+host+cell+protein+impurities+in+high-purity+monoclonal+antibodies+down+to+1+ppm+using+ion+mobility+mass+spectrometry+coupled+with+multidimensional+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography.</a> Anal Chem. 87, 10283-10291 (2015).</li>
<li>Doneanu, C. E., et al. Improved identification and quantification of host cell proteins (HCPs) in biotherapeutics using liquid chromatography mass spectrometry. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bk-2015-1202.ch013?src=recsys">Technologies for therapeutic monoclonal antibody characterization, vol. 3: Defining the next generation of analytical and biophysical techniques</a>. , Washington DC. ACS Symposium series 1202 357-393 (2015).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+co-elution+of+host-cell+proteins+with+monoclonal+antibodies+during+protein+A+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Characterization of the co-elution of host-cell proteins with monoclonal antibodies during protein A purification.</a> Biotechnol Prog. 32, 708-717 (2016).</li>
<li>Reisinger, V., Toll, H., Mayer, R. E., Visser, J., Wolschin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometry+based+approach+to+host+cell+protein+identification+and+its+application+in+a+comparatibility+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometry based approach to host cell protein identification and its application in a comparatibility exercise.</a> Anal Biochem. , 1-6 (2014).</li>
<li>Madsen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+complete+characterization+of+host-cell+proteins+in+biotherapeutics+via+affinity+depletions%2C+LC%2FMS%2FMS+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Toward the complete characterization of host-cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC/MS/MS and multivariate analysis.</a> MAbs. 7, 1128-1137 (2015).</li>
<li>Giles, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+trevelling+wave-based+radio-frequency-only+stacked+ring+ion+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Applications of a trevelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18, 2401-2414 (2004).</li>
<li>Anderson, V., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometric+multiple+reaction+monitoring+assays+for+major+plasma+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 5, 573-588 (2006).</li>
<li>Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18854821">Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 4, 1-14 (2008).</li>
<li>Picotti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+generation+of+selected+reaction-monitoring+assays+for+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput generation of selected reaction-monitoring assays for proteins and proteomes.</a> Nat Methods. 7, 43-46 (2010).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+proteins+using+peptide+immunoaffinity+enrichment+coupled+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li>
<li>Liebler, D. C., Zimmerman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+quantitation+of+proteins+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Targeted quantitation of proteins by mass spectrometry.</a> Biochemistry. 52, 3797-3806 (2013).</li>
<li>Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+for+absolute+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification.</a> J Vis Exp. (102), (2015).</li>
<li>Ebhardt, H. A., Sabido, E., Huttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22577020">Range of protein detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry in an unfractioned human cell culture lysate.</a> Proteomics. 12, 1185-1193 (2012).</li>
<li>Picotti, P., Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+dynamic+range+proteome+analysis+of+S.+cerevisiae+by+targetted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Full dynamic range proteome analysis of S. cerevisiae by targetted proteomics.</a> Cell. 138, 795-806 (2009).</li>
<li>Sherman, J., McKay, M. J., Ashman, K., Molloy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+specific+is+my+SRM%3A+the+issue+of+precursor+and+product+ion+reductancy%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">How specific is my SRM: the issue of precursor and product ion reductancy.</a> Proteomics. 9, 1120-1123 (2009).</li>
<li>Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+innacurate+and+imprecise+transitions+in+peptide+quantification+by+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated detection of innacurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry.</a> Clin Chem. 56, 291-305 (2010).</li>
<li>Rost, H., Malmstrom, L., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+tool+to+detect+and+avoid+redundancy+in+selected+reaction+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A computational tool to detect and avoid redundancy in selected reaction monitoring.</a> Mol Cell Proteomics. 11, 540-549 (2012).</li>
<li>Bao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+correction+of+interference+in+SRM+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and correction of interference in SRM analysis.</a> Methods. 61, 299-303 (2013).</li>
<li>Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+collision+energy+optimization+on+the+measurement+of+peptides+by+selected+reaction+monitoring+%28SRM%29+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).</li>
<li>Mbasu, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quadrupole+and+time-of-flight+mass+spectrometry+for+peptide+MRM+based+translational+reserch+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advances in quadrupole and time-of-flight mass spectrometry for peptide MRM based translational reserch analysis.</a> Proteomics. 16, 2206-2220 (2016).</li>
</ol>

Tüm yazarlar birkaç reaktifler ve bu makalede kullanılan aletleri üreticisi olan Waters şirketi çalışanları olan.

Yüksek çözünürlüklü (Rs > 20.000) kütle spektrometresi enstrüman platformları çeşitli tedavi amaçlı proteinleri yapısal karakterizasyonu için rutin olarak kullanılan. Buna ek olarak, MS tabanlı protein miktar genellikle SRM/MRM tarafından imza peptidler proteinler11,12 enzimatik bölünme tarafından oluşturulan kullanarak düşük çözünürlüklü (Rs ~ 1000) tandem quadrupole Kütle Spektrometreleri gerçekleştirilir , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. tek-boyut Kromatografik ayrımları tam olarak Enzimatik sindirim tarafından üretilen karmaşık peptid karışımları çözümlenemiyor peptid co elüsyon tek-protein Özet durumunda bile ortak bir olay olduğu. Çok karmaşık protein digests (Örneğin, diyetteki 1-100 ppms terapötik protein tarafından üretilen bir peptid zengini arka plan huzurunda miktar için), hassasiyet, doğruluk ve SRM/MRM doğrusallık için tahlil tarafından etkilenebilir parazit var.
SRM/MRM deneyleri Venüslüdür seçicilik, sadece öncü/parça kitleler "benzersiz" kombinasyonuna güvenerek var. Bu nedenle, bu deneyleri peptid arka plan beklenmedik bir şekilde değiştiğinde durumlarda başarısız (Örneğin, biyofarmasotik örnekleri için farklı arıtma yordamlardan sağlanır). Biz burada bir iyon yüksek çözünürlüklü quadrupole hareketlilik etkin uçuş saat (QTOF) hibrid Kütle Spektrometre üzerinde uygulanan yüksek seçicilik (HS) MRM tahlil bu sınırlamalarını aşmak için teklif (alet diyagram için bkz: şekil 6).
Enstrüman diğer ortak eluting (müdahale) peptid öncüleri iyon hareketlilik hücredeki peptid ilgi öncüleri ayıran quadrupole habercisi tam izotopik zarf yalıtır ve sabit bir CE ile parçaları çarpışma hücre. Onun en bol peptid parçası tarafından üretilen sinyal seçmeli olarak ilgi kitle bölgeler tüm iyonları, yerine uçuş tüp tam tarama gibi ile iter itici frekans (hedef geliştirme), ayarlayarak daha da geliştirilmiştir. Peptid miktar bu parça iyon tarafından üretilen yüksek-MS-çözünürlük (Rs ~ 30.000) sinyallerini kullanarak gerçekleştirilir. SRM/MRM deneyleri ile karşılaştırıldığında, HS-MRM tahlil seçicilik iki ek düzeyini sağlar: ikinci TOF analyzer artan kitle kararı ile sunulan bir öncül düzeyi iyon hareketlilik ayırma tarafından sağlanır. Bu seçicilik gelişmeler tarafından getirdiği sonuçlar üç büyüklük arasında etkileşimler özgür Şekil 7'de görüntülenen HS-MRM chromatograms görünür.
SRM/MRM deneyleri HS-MRM deneyleri optimize etmek için ayarlanabilir bazı parametreler bulunur: RT pencere (genellikle 0.2 dk az ayarla) peptid habercisi, quadrupole yalıtım pencere (4 Da), drift-zaman penceresi etrafında çevreleyen öncü (± FWHM karşılık gelen iyon mobilogram üzerinden habercisi tepe) ve parçası iyon (20,000-40,000) MS çözümü. HS-MRM deneyleri çok duyarlıdır: her PHO peptidler için en düşük tespit edilen miktar 1 femtomole Tarih-sütundur (veya 0,1 nM peptid konsantrasyon açısından). Peptid MW göz önünde bulundurarak (bkz. Tablo 1 için doğru MWs), miktar sütun üzerinde 1-2 sayfa sırasını, sütun arka plan peptidler mAb Özet dan anlamlı olarak daha yüksek miktarda (2 µg) yüklenirken algılandığında.
Çivili peptidler türetildiği tam uzunlukta PHO protein (97.2 kDa) molekül ağırlığı dikkate alarak, tahlil 50 ppm yüksek-bereket arka plan iyonlarının varlığında bir protein kirlilik tespit edebilmektedir. Algılama (5-10 ppm) daha düşük limitler düşük moleküler ağırlıklı diyetteki (10-20 kDa) için ulaşılabilir vardır. Tahlil üç (kalibrasyon eğrileri şekil 8 gösterildiği) büyüklük, 1-1000 ppm aralığında diyetteki ölçebilirsiniz anlamına gelir kapsamaktadır. Ayrıca, tablo 3'te gösterilen HS-MRM deneyleri, tekrarlanabilirlik çok iyi küçük molekül SRM/MRM deneyleri, pik alanı RSDs %15 iyi tekrarlanabilirlik ile eşleşir.
Biz bir roman tahlil Monoklonal antikor (mAb) Özet çivili peptid standartları miktar için yeteneklerini incelemiş ve yarar-e doğru geniş dinamik aralık (en az üç büyüklük) tipik olarak kapsar ve hassasiyeti gösterdi HCP analizde karşılaştı. Tüm altı peptid standartları 0.1 düşük konsantrasyonlarda tespit edildi nM (1 femtomole 2.1 mm ID Kromatografik sütun üzerinde yüklü) yüksek-bereket peptid arka plan (mAb yüklenen Özet olarak-sütun 2 µg) huzurunda. Hedeflenen HRMS ve iyon hareketlilik habercisi ayırma birleşmeyle, HS-MRM tahlil hızlı, yüksek üretilen iş izleme tahlil için birden fazla diyetteki Biyofarmasötikler birden çok toplu işlem arasında olmak için büyük bir potansiyele sahiptir.

Şu anda ağırlıklı olarak çeşitli avantajlar nedeniyle (Örneğin, ELISAs), uzun dayanır büyük biomolecules (protein) endüstriyel ayarlarında miktar: hassasiyet, yüksek performans, kullanım kolaylığı ve örnek başına düşük maliyet. Düşük-bereket protein yabancı maddelerin (ana bilgisayar-hücre proteinleri (diyetteki) 1-100 ppm) protein tedavi mevcut analiz etmek için uygulandığında, bu biyolojik deneyleri genellikle (genellikle ppm veya ng HCP/mg mAb ifade), toplam HCP yoğunluğu ama onlar sağlar tanımlamak ve ölçmek bireysel HCP kirletici. Birkaç MS tabanlı deneyleri ELISAs tamamlayacak veya ELISAs1,2,3,4,5,6 sunmak için başarısız bilgi sağlamak için geliştirilen , 7 , 8 , 9. örnek karmaşıklığı ve konsantrasyon (en az 3 büyüklük) geniş dinamik aralık arasında HCP peptidler tespit zorunluluğu nedeniyle, kapsamlı örnek ayırma ihale çok boyutlu Kromatografik yöntemler var geleneksel olarak düşük-bereket diyetteki1,2,3,4,5,6,7tanımlamanıza yardımcı olması için istihdam edilmiştir.
Doğal bir HCP kimlik takip ve doğrulama HCP izleme (Biyofarmasötikler birden çok toplu işlem arasında izleme). Bu durumda, tek-boyut LC/MS yöntemleri örnek işlem hacmi8,9geliştirmek için önerilmiştir. Ancak, HCP dinamik aralığı ölçümleri ve doğruluğu biyofarmasotik peptidler ezici varlığı ile 1 D LC/MS assay olarak etkilenebilir. Çok boyutlu bir ayrılık karşılaştırıldığında, Sinyal parazit19,20,21,22 için potansiyel bir tek-boyut Kromatografik ayırma için artar için olasılık Co eluting olmak daha fazla peptid öncüleri artırılır. Kromatografik ayırma zaman genişletmeden peptid öncüleri ayırmak için ortogonal anlamına gelir birleşme açıkça avantajlı olur. Dalga iyon hareketlilik (TWIM)10 seyahat sıkışık MS spectra milisaniye cinsinden gidermek için yeteneğine sahiptir. Yaklaşık 500 hareketlilik ayrımları tam Kromatografik pik genişliği 10 varsayarak bir tek peptid, elüsyon sırasında gerçekleştirilen s ve iyon hareketlilik cihazda bir IM ayrılması çalışma zamanı 20 ms olduğunu düşünüyor.
Protein miktar için kitle spektrometrik deneyleri başarılı bir şekilde geliştirilmiştir son on yıl iyi kabul edilen kullanarak seçili (birden fazla) tepki tandem Kütle Spektrometreleri11tarihinde, uygulanan yaklaşım (SRM/MRM yöntemi) izleme 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23. Bu düşük çözünürlüklü kitle spektrometrik tahlil sınırlamaları biri peptid ilgi "aynı" olduğunda gözlenen girişim fenomen19,20,21,22 öncü ve parça ortak eluting kitle gibi diğer peptidler (içinde 1-Da pencere) örnek mevcut. SRM/MRM yöntemleri doğruluğunu artırmak için iki yol vardır: bir seçenek diğer seçenek habercisi/parça algılama için MS çözünürlüğü artırmak için ise müdahale habercisi iyonları, kaldırmak için habercisi düzeyinde bir ilave ayrılık adım gerektirir üst üste gelen MS sinyalleri kaçının. Açıklanan yüksek seçicilik (HS) MRM edinme modu burada bu yaklaşımların her ikisi de yüksek çözünürlüklü (Rs ~ 30.000) ile peptid öncüleri iyon hareketlilik ayrılması kaplin tarafından yararlanır MS algılama, peptid parçacıkları. Tahlil burada SRM/MRM proteomik deneyler17,18,24' te en az üç dinamik alan, genelde olan büyüklük, gözlenen kapaklar açıklanan.
Belgili tanımlık yarar HCP miktar için HS-MRM testin farklı konsantrasyonlarda (0,1 - 100 nM aralığı) Monoklonal antikor Özet, çivili altı peptid standartlarına göre üretilen sinyal doğrusallık izleyerek gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Vion IMS Qtof kütle spektrometresi</td><td>Sular</td><td>186009214</td><td></td></tr><tr><td>Acquity H-Class Kuaterner solvent yöneticisi (QSM)</td><td>Sular</td><td>186015041</td><td></td></tr><tr><td>Acquity H-Class FTN Numune Yöneticisi (SM)</td><td>Waters</td><td>186015040</td><td></td></tr><tr><td>Acquity H-Class Column Manager (CM)</td><td>Sular</td><td>186015043</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril (ACN)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40867-50G-F</td><td></td></tr><tr><td>2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC kolonu, 1.8 ve mikro; m parçacıkları</td><td>Sular</td><td>186005298</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit, LC / MS Sigma</td><td>Aldrich</td><td>56302-10X1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Hi3 tavşan fosforilaz (PHO)</td> için eluent katkı maddesi MassPREP standardı <td>Sular</td><td>186006011</td><td></td></tr><tr><td>İyodoasetamid (IAM)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>I-1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>LC şişeleri (12x32 mm cam şişeler, vidalı boyunlu)</td> <td>Sular</td><td>186000327c</td><td></td></tr><tr><td>Lösin Enkefalin asetat tuzu hidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9133-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind 2.0 mL tüpler (2x50)</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Suları</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin/Lys-C enzim karışımı, kütle spec derecesi (5 x 20 ve mikro; g)</td> <td>Promega</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Su, LC / MS sınıfı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39253-1L-R</td><td></td></tr></tbody></table>

bir hs-mrm tahlil için protein biyofarmasötikler sıvı kromatografi iyon hareketlilik qtof kütle spektrometresi tarafından host-hücre proteinleri miktar

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

Alt düzey (1-100 ppm) protein kirleri (Örneğin, ana bilgisayar-hücre proteinleri (diyetteki)) protein biotherapeutics yüksek hassasiyet ve geniş dinamik alan gerektiren zorlu bir tahlil analizidir. Kütle spektrometresi tabanlı miktar deneyleri proteinler için genellikle protein sindirimi seçmeli reaksiyon izleme/çoklu reaksiyon (SRM/MRM) miktar düşük çözünürlüklü (Rs ~ 1000) tandem kullanarak peptidler, izleme tarafından takip içerir Quadrupole Kütle Spektrometre. Bir bu yaklaşımın sınırlamaları peptid ilgi "aynı" öncü ve parça kütle (m/z değerleri) açısından olarak ortak eluting diğer peptidler örnek (içinde 1-Da pencere) mevcut olduğunda gözlenen girişim olgudur. Başka bir kitle spektrometrik yaklaşım, peptid öncüleri iyon hareketlilik ayrılması yüksek çözünürlüklü (Rs ~ 30.000) ile birleştirir bir yüksek seçicilik (HS) MRM tahlil önerdiğimiz bu fenomen önlemek için MS algılama, peptid parçacıkları. Biz bir Monoklonal antikor (mAb) özetinde çivili ve duyarlılık ve dinamik alan (en az 3 büyüklük) genellikle HCP içinde elde sahip olduğunu göstermiştir düşük-bereket peptid standartları ölçmek için bu yaklaşım yeteneklerini incelemiş analiz. Tüm altı peptid standartları 0.1 düşük konsantrasyonlarda tespit edildi nM (1 femtomole 2.1 mm ID Kromatografik sütun üzerinde yüklü) yüksek-bereket peptid arka plan (mAb yüklenen Özet olarak-sütun 2 µg) huzurunda. Tavşan phosphorylase (97.2 kDa), hangi çivili peptidler elde, MW göz önünde bulundurarak bu tahlil LOQ 50 ppm düşüktür. Göreli standart sapmalar (RSD) en yüksek alanların (n 4 çoğaltır =) % 15'den az araştırılan tüm konsantrasyon aralığında olduğunu (0,1-100 nM veya 1-1000 ppm) Bu çalışmada.

Altı phosphorylase b peptid standartları PHO peptid karışım içinde yer alan bireysel dizisi tablo 1'ile birlikte onların saklama kez gösterilir ve en bol onların öncüleri HDMSE gözlenen deneme. Bir yüksek-seçicilik (HS) MRM tahlil gelişiminde ilk adım bir HDMSE dataset edinimi ile birlikte ilgili en her PHO peptid elüsyon zamanlarında kurmaktır bol habercisi ve üç en bol parçaları. Şekil 2 bir PHO peptidler (Pep 6) infliksimab özetinde çivili için alınan HDMSE spectra görüntüler. 3 en iyi "geçiş" (öncü ve parça kitleler kombinasyonları) her peptid için kurulduktan sonra Tof-MRM deney sinyaller her peptid için üretilen en üst düzeye çıkarmak için optimum çarpışma enerji bulmak için gerçekleştirilir. CE optimization denemenin sonuçları tablo 2'de özetlenmiştir. Son HS-MRM tahlil sadece en iyi "geçiş" her peptid için korur ve tüm çivili örnekleri analiz etmek için kullanılır (bkz. Şekil 4). HS-MRM chromatograms için 4 PHO peptidler araştırıldı konsantrasyonları arasında oluşturulan örnek şekil 7'de sunulmaktadır. Şekil 7'vurgulanmış HS-MRM doruklarına entegrasyon şekil 8'görüntülenir her peptid takip için dört kalibrasyon eğriler elde. Buna ek olarak, en yüksek alan göreli standart sapma, hesaplanan dayalı olarak 4 Çoğalt enjeksiyonları, tablo 3'te gösterilen 4 tabloları özetlenir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Peptid</td>
			<td colspan="2">Peptid</td>
			<td>Saklama</td>
			<td colspan="4">Şarj Birleşik</td>
		</tr>
<tr>
<td>KİMLİĞİ</td>
			<td colspan="2">Sıra</td>
			<td>süresi (dk)</td>
			<td>+ 1</td>
			<td>+ 2</td>
			<td>+ 3</td>
			<td>+ 4</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Moral 1</td>
			<td colspan="2">VLYPNDNFFEGK</td>
			<td>19,4</td>
			<td>1442.6951</td>
			<td>721.8512</td>
			<td>481.5699</td>
			<td>361.4292</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moral 2</td>
			<td colspan="2">TCAYTNHTVLPEALER</td>
			<td>16.0</td>
			<td>1874.9065</td>
			<td>937.9569</td>
			<td>625.6404</td>
			<td>469.4821</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moral 3</td>
			<td colspan="2">IGEEYISDLDQLRK</td>
			<td>18,9</td>
			<td>1678.8646</td>
			<td>839.9360</td>
			<td>560.2931</td>
			<td>420.4716</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moral 4</td>
			<td colspan="2">LLSYVDDEAFIR</td>
			<td>21,1</td>
			<td>1440.7369</td>
			<td>720.8721</td>
			<td>480.9172</td>
			<td>360.9397</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moral 5</td>
			<td colspan="2">LITAIGDVVNHDPVVGDR</td>
			<td>19,7</td>
			<td>1890.0080</td>
			<td>945.5076</td>
			<td>630.6742</td>
			<td>473.2574</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moral 6</td>
			<td colspan="2">VFADYEEYVK</td>
			<td>17,7</td>
			<td>1262.5939</td>
			<td>631.8006</td>
			<td>421.5362</td>
			<td>316.4039</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. İnfliksimab özetinde çivili kitle hazırlık karışımında yer alan PHO peptid standartları. Peptid saklama süreleri ve onların en bol öncüleri (kalın olarak vurgulanan) tablo biçiminde görüntülenir.
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Peptid</td>
			<td colspan="2">Peptid</td>
			<td>Saklama</td>
			<td colspan="2">Peptid habercisi</td>
			<td colspan="3">En bol parçası iyonları/şarj</td>
			<td>Optimum</td>
		</tr>
<tr>
<td>KİMLİĞİ</td>
			<td colspan="2">Sıra</td>
			<td>süresi (dk)</td>
			<td>m/z & şarj</td>
			<td>Drift süresi (ms)</td>
			<td>Ben</td>
			<td>II</td>
			<td>III</td>
			<td>CE (V)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moral 2</td>
			<td colspan="2">TCAYTNHTVLPEALER</td>
			<td>16.0</td>
			<td>625.6404 (+ 3)</td>
			<td>6.2</td>
			<td>714.3781 (+ 1)</td>
			<td>807.4177 (+ 2)</td>
			<td>827.4621 (+ 1)</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moral 4</td>
			<td colspan="2">LLSYVDDEAFIR</td>
			<td>21,1</td>
			<td>720.8721 (+ 2)</td>
			<td>7.5</td>
			<td>865.4050 (+ 1)</td>
			<td>964.4734 (+ 1)</td>
			<td>1214.5688 (+ 1)</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moral 5</td>
			<td colspan="2">LITAIGDVVNHDPVVGDR</td>
			<td>19,7</td>
			<td>630.6742 (+ 3)</td>
			<td>6.3</td>
			<td>642.3570 (+ 1)</td>
			<td>689.8391 (+ 2)</td>
			<td>832.4236 (+ 2)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moral 6</td>
			<td colspan="2">VFADYEEYVK</td>
			<td>17,7</td>
			<td>631.8006 (+ 2)</td>
			<td>7.0</td>
			<td>830.3931 (+ 1)</td>
			<td>945.4200 (+ 2)</td>
			<td>1016.4571 (+ 1)</td>
			<td>24</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2. Tof-MRM optimizasyonu denemenin sonuçları: Bu çalışmada sayısal her PHO peptid üç en bol parçaları, karşılık gelen en iyi duruma getirilmiş çarpışma enerji ile birlikte gösterilir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Konsantrasyon</td>
			<td>Tutar</td>
			<td colspan="6">Moral 2 pik alanları (tablo 3A)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>sütun üzerinde (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Demek</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1</td>
			<td>1</td>
			<td>490</td>
			<td>439</td>
			<td>462</td>
			<td>431</td>
			<td>456</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>5121</td>
			<td>4842</td>
			<td>5198</td>
			<td>4842</td>
			<td>5001</td>
			<td>3.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>63853</td>
			<td>64279</td>
			<td>66111</td>
			<td>62509</td>
			<td>64188</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>612392</td>
			<td>605553</td>
			<td>613229</td>
			<td>611004</td>
			<td>610545</td>
			<td>0,6</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Konsantrasyon</td>
			<td>Tutar</td>
			<td colspan="6">Moral 4 pik alanları (tablo 3B)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>sütun üzerinde (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Demek</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1</td>
			<td>1</td>
			<td>275</td>
			<td>359</td>
			<td>325</td>
			<td>288</td>
			<td>312</td>
			<td>12,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>3559</td>
			<td>3694</td>
			<td>3287</td>
			<td>3754</td>
			<td>3574</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>45259</td>
			<td>45775</td>
			<td>42976</td>
			<td>45548</td>
			<td>44890</td>
			<td>2,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>459374</td>
			<td>467927</td>
			<td>436272</td>
			<td>458994</td>
			<td>455642</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Konsantrasyon</td>
			<td>Tutar</td>
			<td colspan="6">Moral 5 pik alanları (Tablo 3 c)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>sütun üzerinde (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Demek</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1</td>
			<td>1</td>
			<td>3194</td>
			<td>3243</td>
			<td>3202</td>
			<td>3257</td>
			<td>3224</td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>31464</td>
			<td>31150</td>
			<td>31464</td>
			<td>31433</td>
			<td>31378</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>313638</td>
			<td>320712</td>
			<td>311943</td>
			<td>311943</td>
			<td>314559</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>2845736</td>
			<td>2840031</td>
			<td>2882006</td>
			<td>2864052</td>
			<td>2857956</td>
			<td>0,7</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Konsantrasyon</td>
			<td>Tutar</td>
			<td colspan="6">Moral 6 tepe alanları (tablo 3B)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>sütun üzerinde (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Demek</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1</td>
			<td>1</td>
			<td>490</td>
			<td>583</td>
			<td>440</td>
			<td>440</td>
			<td>488</td>
			<td>13,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>6429</td>
			<td>6429</td>
			<td>6848</td>
			<td>6623</td>
			<td>6582</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>71295</td>
			<td>70400</td>
			<td>71563</td>
			<td>70400</td>
			<td>70915</td>
			<td>0,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>707640</td>
			<td>707640</td>
			<td>694461</td>
			<td>729490</td>
			<td>709808</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3. HS-MRM chromatograms pik alanları içeren bir tablo 4 PHO peptidler (Pep 2, 4, 5 ve 6) için her LC/MS enjeksiyon (16 LC/MS çalışır ve 4 konsantrasyonları test) için kaydedildi. Göreli standart sapma araştırıldı tüm konsantrasyon aralığında tüm peptidler için % 15 daha iyiydi.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig1.jpg"> Şekil 1. İş akışı diyagramı bir HS-MRM edinme yöntemini ayarlamak için gerekli üç adım özetleme. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig2.jpg"> Şekil 2. HDMSE veri örneği: (A) düşük enerjili spektrum Pep 6 habercisi iyon gösterilen. (B) Tof-MRM çarpışma enerji optimizasyonu için seçili (Daire içinde) ilk 3 en bol parçası iyonları görüntüleme aynı peptid yüksek enerjili parçalanma spektrum. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig3.jpg"> Şekil 3. Tof-MRM optimizasyonu ayarlamak için kullanılan parametreler deneme. Her geçiş için on çarpışma enerjiler (16-36 V aralığında) test edildi. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig4.jpg"> Şekil 4. Son HS-MRM yöntem örneği. Birkaç parametre "peptid habercisi m/z, şarj durumuna ve iyon hareketlilik drift zaman, m/z en bol parçası iyon, optimum çarpışma enerji ve MS satın alma süresi de dahil olmak üzere her bir geçiş için" gerekli değildir. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig5.jpg"> Şekil 5. HS-MRM veri kümesi analiz etmek için işleme yöntemi tarafından kullanılan ayarlar. Her peptid tek bir "geçiş" peptid habercisi m/z tarafından açıklanan tarafından izlenen, devlet ücret ve tutma zamanı, başından beri en bol parçası ve şarj durumuna m/z ile beklenen. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig6.jpg"> Şekil 6. İyon hareketlilik Kütle Spektrometre diyagramı. HS-MRM satın alma modunda, diğer ortak eluting (müdahale) peptid öncüleri quadrupole tarafından izole ve bir sabit çarpışma enerji ile parçalanmış iyon hareketlilik hücre sayısal peptid öncüleri ayrılır çarpışma hücre. Peptid parçası iyonlar tarafından üretilen sinyal itici frekans ayarlayarak artırılmış ve peptid miktar yüksek-MS-çözünürlük kullanılarak gerçekleştirilir (> 30.000) her peptid en yoğun parçası iyon tarafından üretilen sinyalleri. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig7v2.jpg"> Şekil 7. HS-MRM chromatograms kaydedilen 4 PHO peptidler 3 büyüklük kapsayan 4 farklı konsantrasyonlarda için (0,1, 1, 10 ve 100 nM). (A) pep 2 chromatograms, (B) Pep 4 chromatograms, (C) Pep 5 chromatograms ve (D) Pep 6 chromatograms. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig7v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig8v2.jpg"> Şekil 8. 4 farklı konsantrasyonları arasında 4 PHO peptidler için kalibrasyon eğrileri (0,1, 1, 10 ve 100 nM). Tablolar her eğri altındaki her tablodan ikinci sütun beklenen Dorusal tepki yüzde sapma gösterirken her enjeksiyon için kaydedilen bireysel pik alanları (Y-değerleri) görüntüler. (A) pep 2 kalibrasyon, (B) Pep 4 kalibrasyon, (C) Pep 5 kalibrasyon ve (D) Pep 6 kalibrasyon. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig8v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Burada, yüksek çözünürlüklü (~ 30.000) MS-algılama, peptid parçacıkları Monoklonal antikor çivili peptid standartları miktar için ardından peptid öncüleri iyon hareketlilik ayrılması ile birleştiğinde bir Kromatografik tahlil açıklamak Özet.

Bir HS-MRM tahlil için Protein Biyofarmasötikler sıvı Kromatografi iyon hareketlilik QTOF kütle spektrometresi tarafından Host-hücre proteinleri miktar

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

HS-MRM analizinin genel amacı, peptid öncüllerinin iyon mobilite ayırımını, fragman iyonlarının yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrik tespiti ile birleştirerek, peptid veya protein miktar tayinini etkileyen MRM girişim fenomenini azaltmaktır. Bu yöntem, biyoterapötik karakterizasyon alanındaki temel soruların yanı sıra protein veya peptid biyobelirteç miktar tayini ve kantitatif proteomik konularındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, biyofarmasötik proteinlerde bulunabilecek düşük bolluktaki konak hücre proteinlerinin tespitine olanak tanımasıdır.Öncelikle, veri toplama yazılımında analiz yöntemi oluştur'a (create analysis method) tıklayın ve oluştur, topla ve işle yöntemini (generate and acquire and process method) seçin. Yöntem adını ve açıklamasını yazın, yöntem klasörüne gidin ve ileri'ye (next) tıklayın. Analiz tipi olarak peptit haritası IMS (peptide map IMS) seçeneğini belirleyin ve ileri'ye (next) tıklayın.Ardından mevcut sistem konfigürasyonunu seçin, "next" (ileri) ve "finish" (bitir) butonlarına tıklayın. Yeni oluşturulan yöntemde, "instruments" (enstrümanlar) sekmesine tıklayın, binary solvent manager'ı seçin ve 0,2 milliliters per minute akış hızında peptit ayrımı sağlamak için gradyan ayarlarını düzenleyin. 30 dakikada %1'den %40 solvent B'ye gradyan dilüsyonu, ardından iki dakikalık kolon yıkama ve toplam 45 dakikalık çalışma süresiyle 10 dakikalık bir dengeleme kullanın.Ardından, örnek yöneticisini seçin ve örnek sıcaklığını 10 °C, kolon sıcaklığını ise 60 °C olarak ayarlayın. Enstrümanlar sekmesinden Vion IMS QTof cihazını seçin. Ayarlar bölümünde, analizör modu için duyarlılığı seçin ve kılcal voltaj için 3 kV, kaynak sıcaklığı için 100 °C, desolvasyon sıcaklığı için 250 °C, kon gaz akışı için 50 L/saat ve desolvasyon gaz akışı için 500 L/saat değerlerini girin.Deney sekmesine tıklayın ve mod için yüksek çözünürlüklü MSE'yi seçin. Ardından düşük kütle için 100, yüksek kütle için 2000 ve tarama süresi için 0,4 saniye girin. Çarpışma enerjisi bölümünde, düşük enerji ayarı için altı elektron volt yazın ve 15 ile 40 elektron volt arasında bir yüksek enerji rampası seçin.Kazanım süresi için beş ile 30 dakika arasında özel bir çalışma süresi kullanın. Ardından, seçenekler sekmesine tıklayın ve beş dakikalık otomatik kilit düzeltme aralığına sahip otomatik kilit düzeltme modunu seçin. Daha sonra kilit düzeltme ile devam et seçeneğini belirleyin ve otomatik dedektör kontrolünün devre dışı olduğundan emin olun.Mevcut sistem yapılandırma menüsünde, Vion IMS QTof cihazını seçin ve araçlar (tools) kısmına tıklayın. Kılcal tüp voltajı için 3 kV, örnekleme konisi için 40 V, kaynak ofseti için 100 V, kaynak sıcaklığı için 100 °C, desolvasyon sıcaklığı için 250 °C, koni gaz akışı için 50 L/saat, desolvasyon gaz akışı için 500 L/saat ve referans kılcal tüp voltajı için 3 kV değerlerini girin. Cihaza 10 µL örnek enjekte ederek, az önce açıklanan LC-HDMSE analizi ile önceden hazırlanmış 10 nM sahteleştirilmiş (faux spiked) bir örneği analiz edin.Sahte peptit karışımında bulunan altı fosforilaz B peptit standardının bireysel dizileri, tutunma süreleri ve HDMSE deneyinde gözlemlenen en bol öncülleriyle birlikte burada gösterilmiştir. Infliximab digestine eklenen sahte peptitlerden birine ait elde edilen HDMSE spektrumları burada sunulmaktadır. Veri toplama yazılımında, analiz yöntemi oluştur'a tıklayın ve oluştur, topla ve işle yöntemini seçin.Yöntem adını ve açıklamasını yazın, yöntem klasörüne gidin ve ileriye tıklayın. Analiz tipi için quantify seçeneğini belirleyin, Quantify Assay Tof 2D Chromatographic öğesini seçin ve ileriye tıklayın. Ardından güncel sistem konfigürasyonunu seçin, ileriye ve bitir'e tıklayın.Yeni oluşturulan yöntemdeki araçlar (instruments) sekmesine tıklayın. Binary solvent manager'ı seçin ve 0,2 milliliters per minute akış hızında peptid ayrımı sağlamak için gradyan ayarlarını düzenleyin. 30 dakika boyunca %1'den %40'a solvent B gradyan dilüsyonu uygulayın, ardından iki dakikalık bir kolon yıkama ve 10 dakikalık bir dengeleme yaparak toplam 45 dakikalık bir çalışma süresi belirleyin.Enstrümanlar sekmesinde örnek yöneticisini seçin, örnek sıcaklığını 10 °C ve kolon sıcaklığını 60 °C olarak ayarlayın. Şimdi Vion IMS QTof enstrümanını seçin ve ayarlar bölümünde analizör modu için duyarlılığı seçin. Ardından kapiler voltajı için 3 kV, kaynak sıcaklığı için 100 °C, desolvasyon sıcaklığı için 250 °C, kon gaz akışı için 50 L/h ve desolvasyon gaz akışı için 500 L/h değerlerini girin.Deney sekmesine tıklayın ve deney tipi olarak bir veya daha fazla MS, MSMS veya MRM fonksiyonu içeren fonksiyon tablosunu seçin. Varsayılan kazanım fonksiyonunu silin, artı MRM ekle seçeneğine tıklayın ve çalışma süresi bölümündeki tutulum penceresi parametrelerini düzenleyin. Tof MRM fonksiyon düzenleyicisinde, peptid öncül ana yük oranını girin, öncül çözünürlüğü için düşük seçeneğini belirleyin ve öncül yük durumunu girin.Ardından, başlangıç çarpışma enerjisi için ürün ana yük oranı 16 elektron volt, sabit tarama süresi için 0,1 saniye ve spektrum sütunu için geniş (wide) değerlerini girin. Kopyalama (duplicate) düğmesini kullanarak 10 MRM geçişi daha ekleyin ve 18 ila 36 elektron volt aralığında farklı çarpışma enerjisi değerleri kullanın. Her bir peptit için en iyi üç geçiş belirlendikten sonra, her peptit için üretilen sinyalleri maksimize edecek optimum çarpışma enerjisini bulmak amacıyla bir Tof MRM deneyi gerçekleştirildi.Ardından, her peptit için yalnızca bir fragment iyonu içeren bir HS-MRM yöntemi oluşturun. Tof MRM fonksiyonu yerine HS-MRM fonksiyonunu seçerek daha önce oluşturulan Tof MRM yöntemini modifiye edin. HS-MRM fonksiyon düzenleyicisinde ana yük oranını girin, öncül çözünürlük (precursor resolution) için "düşük" (low) seçeneğini seçin ve öncül yük durumunu girin.Ardından öncül CCS değerini girin ve öncül CCS çözünürlüğü için düşük (low) seçeneğini belirleyin. Ürün iyonu için ana yük oranını girin, optimum çarpışma enerjisini seçin, 0,4 saniyelik bir tarama süresi seçin ve tüm izotoplarını dahil etmek için geniş spektrum ayarını belirleyin. Nihai HS-MRM analizi, her peptid için yalnızca en iyi geçişi tutar ve tüm desteklenmiş (spiked) örneklerin analizi için kullanılır.HS-MRM veri toplama yöntemi için oluşturulan analiz yönteminde, amaç sekmesine tıklayın ve bileşenleri yönet seçeneğini belirleyin. Deney tipi altındaki açılır menüden HS MSMS/HS MRM seçeneğini seçin. Oluştur'a tıklayın ve bileşen adını, beklenen tutunma süresini, ekstraksiyon zaman penceresini ve öncül ana yük oranını girin.XIC ekstraksiyon modunu seçin ve beklenen CCS değerini girin. Fragman iyonu için yük durumunu ve ana yük oranını girin. Ardından HS-MRM analizi tarafından izlenen tüm peptit bileşenlerini girin.Aynı HS-MRM veri toplama yönteminin amaç sekmesinde, varsayılan miktarlara tıklayın ve tüm sahte peptit bileşenleri için 0,1, 1, 10 ve 100 nanomolar değerlerini girin. İlk değeri girdikten sonra, sağ tıklayın ve tüm bileşenler için aynı konsantrasyonu girmek üzere aşağı doldur seçeneğini belirleyin. Aynı prosedürü kalibrasyon eğrisinin dört konsantrasyonu için de tekrarlayın.Şimdi işleme (processing) sekmesine geçin ve ekstraksiyon ayarlarına (extraction settings) tıklayın. Kütle toleransı (mass tolerance) için 10 PPM değerini girin. Ardından, CCS sürüklenme süresi toleransına (CCS drift time tolerance) tıklayın ve CCS toleransı için %5 değerini girin.İşleme (processing) sekmesinde, pik işleme ayarlarını seçin. Yumuşatma (smooth) bölümünde, yumuşatma algoritısı olarak mean'i, yarı genişlik (half width) için one'i ve yinelemeler (iterations) için one'i seçin. Entegrasyon (integrate) bölümünde, otomatik pik genişliği (automatic peak width) ve otomatik tespit (automatic detection) seçeneklerinin her ikisinin de işaretli olduğundan emin olun.Ardından, işleme sekmesinden hedeflenen tarama ayarlarını seçin ve RT penceresindeki RT'ye en yakın seçeneğini belirleyin. Daha sonra, alıkonma süresi toleransı için 0,2 dakika değerini girin. Nicelleştirme ayarlarını seçin ve kalibrasyon menüsünden; kalibrasyon eğrisi uyum tipi için lineer, ağırlık tipi için x kareye bir bölü (one over x squared), bileşen değer tipi için konsantrasyon, bileşen değer birimleri için litre başına milimol ve ortalamayı alarak kalibrasyon noktalarını hesapla seçeneği için hiçbiri'ni seçin.Miktar belirleme (quantify) menüsünde, yanıt değeri olarak alanı (area) seçin. Tüm konsantrasyonlar boyunca sahte peptidler için oluşturulan HS-MRM kromatogram örnekleri burada sunulmuştur. HS-MRM piklerinin integrasyonundan sonra her bir peptid için elde edilen kalibrasyon eğrileri burada gösterilmektedir.Dört tekrarlı enjeksiyona dayalı olarak hesaplanan pik alanına ait göreceli standart sapma burada özetlenmiştir. Yüksek seçicilikli MRM analizi, hem iyon mobilite öncül ayrıştırmasını hem de hedeflenmiş yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrik saptamayı içerdiğinden, biyofarmasötiklerin farklı serileri boyunca çok sayıda konak hücre proteininin izlenmesi için hızlı ve yüksek kapasiteli bir izleme analizi olma potansiyeline sahiptir. Bu videoyu izledikten sonra, bir Vion IMS QTof cihazında yüksek seçicilikli bir MRM analizinin nasıl kurulacağı konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız.

an-hs-mrm-assay-for-quantification-host-cell-proteins-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Kararlı İzotop Standartlar ve Anti-Peptid Antikorlar (SISCAPA) kendi proteinler için vekilleri olarak peptidler kantitatif ölçüm sağlamak için kararlı izotop dilüsyon kütle spektrometresi (MRM-MS) ile peptitler çiftler yakınlık zenginleştirme yakalayın. Burada kısmen otomatik bir biçimde manyetik parçacıklar kullanarak protokol açıklar.

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

Rekombinant insan MHC II molekülleri ile biyokimyasal analizler hızlı, kantitatif immünojenik epitop tanımlaması içine anlayışlar, silme ya da tasarım sağlayabilir. Burada, 384 oyuklu plakalara ölçekli bir peptid MHC-II bağlama deneyi açıklanmıştır. Bu maliyet etkin biçim protein deimmunization ve aşı tasarım ve geliştirme alanlarında yararlı ispatlamak zorundadır.

Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi

Bu protokol, seçilen reaksiyon izleme kullanılarak karmaşık biyolojik numuneler içindeki hedef proteinlerin mutlak miktar tayini testlerinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Fare makrofaj kemotaksisi sinyal yolunun proteinlerini doğru bir şekilde ölçmek için kullanıldı. Hedef peptit seçimi, tahlil geliştirme ve kalitatif ve kantitatif tahliller ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Biz doğru bir şekilde sıvı Kromatografi yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre için arabirim ile proteinler ile izobarik etiketleme, geniş ayırma, Biyoinformatik araçlarını ve kalite kontrol adımları birlikte quantitate için bir protokol mevcut.

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Bu iletişim kuralı bir doğru molar kütle tespiti için protein, protein kompleksleri ve peptidler türdeş olmayan bir örnek yüksek özgüllük iyon değiştirme Kromatografi çok açılı ışık saçılma ile kullanımını açıklar. Bu yöntem kalite değerlendirmesi için de yerli reaksiyonlar, ücret türevleri ve karışık-protein örnekleri karakterizasyonu gelince değerlidir.

Protein ayrımı ve karakterizasyonu için birden fazla açıyla ışık saçılma (MALS) birleştiğinde iyon Kromatografi (IEX)

Protokol, klinik örneklerden elde edilen proteinlerin Çoklu Reaksiyon İzlemesi (MRM) için üçlü dörtlü kütle spektrometresi kullanımını sağlamayı amaçlamaktadır. Alınması gereken tüm önlemlerle klinik numuneler için numune hazırlamadan veri analizine kadar sistematik bir iş akışı sağladık.

İnsan Beyin Dokusundan Proteinlerin Çoklu Reaksiyon İzleme Tabanlı Tespiti Kullanılarak Nicel Proteomik İş Akışı

Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, çoklu biyolojik yolları düzenleyen geniş çaplı bir translasyonel sonrası modifikasyondur. Kütle spektrometresi, modifiye peptid zenginleştirme için biyokimyasal yaklaşımlarla birleştirildiğinde, R-metil-proteomun küresel profilini çıkarmak için en iyi teknolojidir. İnsan hücrelerinde küresel R-metilasyonun yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanan iş akışı burada açıklanmaktadır.

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

İlaç ürünlerinden (DP) konak hücre proteinlerini (HCP'ler) zenginleştirmek ve proteom zenginleştirme boncukları kullanarak peptitleri tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır. Yöntem, performans açısından farklı yöntemleri değerlendirmek ve karşılaştırmak için iyi karakterize edilmiş bir referans materyal olan, kurum içinde üretilmiş bir monoklonal antikor (mAb) ilaç maddesi (DS) kullanılarak gösterilmiştir.

Sınırlı Sindirim ile Birleştirilmiş Zenginleştirme Boncukları Kullanılarak Konak Hücre Protein Analizi

Histon modifikasyonlarının yüksek güvenilirlikli ve yüksek oranda tekrarlanabilir "aşağıdan yukarıya" analizi ve temel parametrelere (alıkonma süresi [RT], çarpışma kesiti [CCS] ve doğru kütle-yük [m/z] oranı) dayalı tanımlama için sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisine (LC-TIMS-ToF MS/MS) dayalı analitik bir iş akışı.

Sıvı Kromatografisi, Sıkışmış İyon Hareketlilik Spektrometrisi ve Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Histon Modifikasyon Taraması

Kütle spektrometresi (UPLC-MS) ile birleştirilmiş ultra performanslı sıvı kromatografisi ile hedeflenmemiş metabolit profili, metabolizmayı araştırmak için güçlü bir tekniktir.  Bu makale, numune organizasyonu ve hazırlama, veri toplama, veri analizi, kalite kontrol ve metabolit tanımlaması dahil olmak üzere serumun hedeflenmemiş metabolit profili için kullanılan tipik bir iş akışını özetlemektedir.

Ultra Performans Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile Serum Büyük Ölçekli Sigara hedefli metabolomik Profilleme

Öğrenin HS-MRM yöntemiyle biyofarmasötiklerdeki düşük yoğunluklu konak hücre proteinlerini iyon hareketlilik ayrımı ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi kullanarak nicel olarak analiz etme. Bu teknik biyoterapötik karakterizasyonu ve proteomik çalışmaları için değerlidir.

Bir HS-MRM tahlil için Protein Biyofarmasötikler sıvı Kromatografi iyon hareketlilik QTOF kütle spektrometresi tarafından Host-hücre proteinleri miktar (Video) | JoVE Journal

Bir HS-MRM tahlil için Protein Biyofarmasötikler sıvı Kromatografi iyon hareketlilik QTOF kütle spektrometresi tarafından Host-hücre proteinleri miktar

Daha fazla video keşfet