Manyetik Rezonans Görüntüleme Kullanarak Deneysel Serebral Sıtma Bir Modelinde Ödem Gelişimi ve Mikrovasküler Patolojinin İn Vivo Takibi

Bu yöntemin genel amacı, deneysel serebral sıtmanın patolojik değişikliklerini in vivo olarak izlemektir. Bu yöntem, deneysel serebral sıtmanın patogenezindeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, çünkü tüm beynin patolojisinin uzayda ve zaman içinde nasıl geliştiğini in vivo olarak görselleştirmemize izin verir. Böylece teknik, beyin patolojisinin ayrıntılı bir değerlendirmesine izin verir ve serebral sıtmada yeni tedavi stratejilerinin etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.

MRG kurulumunu laboratuvar yöneticimiz Manuel Fischer gerçekleştirecektir. Kan yemeğinden 17 ila 22 gün sonra dişi sivrisinekleri kafeslerinden toplayarak başlayın. Bir cam slayta üç ila dört sivrisinek yerleştirmek için forseps kullanın ve bir damla soğuk RPMI ortamı ile birleştirin.

Ardından, slaydı mikroskop altına yerleştirin. Sivrisinekleri forseps ile baş ve vücut arasına dikkatlice gerin ve tükürük bezini izole etmek için bir şırınga ve iğne kullanın. Daha sonra, tükürük bezlerini bir cam pipetle emerek ve 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne aktararak cam slayttan toplayın.

Ardından, sporozoitleri tükürük bezi dokusundan izole etmek için santrifüj tüpü içindeki izole tükürük bezlerini üç dakika boyunca parçalamak için küçük bir plastik çubuk kullanın. Sporozoitleri kalan dokudan arındırmak için 1.000 kez g ve dört santigrat derecede üç dakika santrifüjleyin. Sporozoitleri içeren süpernatanı yeni bir santrifüj tüpüne pipetleyin ve saflaştırılmış sporozoitleri bir Neubauer hemositometresinde sayın.

Sporozoitler tipik bir saat yönünün tersine hareket gösterir. Daha sonra, fosfat tamponlu salin ekleyerek saflaştırılmış sporozoitlerin konsantrasyonunu mililitre başına 10.000'e ayarlayın. Son olarak, bir C57BL/6 fareyi bir sınırlayıcıya yerleştirin ve kuyruk damarını daha iyi görselleştirmek için kuyruğunu ılık suya koyun.

Daha sonra, enfeksiyonu başlatmak için kuyruk damarına toplam 1.000 sporozoit veya 0.1 mililitre enjekte edin. Fareyi, radyo frekansı iletimi için bir ses rezonatörü kullanan 9.4T küçük hayvan Manyetik Rezonans Görüntüleme veya MRI tarayıcısına getirerek başlayın. Ardından, her iki göze dekspantenol göz merhemi uygulayın.

Farenin vücut ısısını korumak için sıcaklık kontrollü su banyosunu 42 santigrat dereceye getirin. Ardından, farenin kuyruk damarına bir kuyruk damarı kateteri yerleştirin. Ardından, fareyi, kafa hareketini en aza indirmek için bir baş kilidi ve diş çubuğu ile donatılmış bir hayvan yatağına yüzüstü ve sırtı burkulmuş bir şekilde yerleştirerek MRI için konumlandırın.

Farenin servikal omurgasını düzleştirmemeye dikkat edin. Kuyruk ven kateterine kilogram başına 0.3 milimol Gd-DTPA ile doldurulmuş bir kontrast madde enjeksiyon sistemi bağlayın. Ardından, 4 Kanallı Aşamalı Dizi Yüzey Alıcısı kafa bobinini farenin kafasına yerleştirin.

Son olarak, farenin arkasına bir solunum pedi yerleştirin ve izleme cihazındaki solunumu kontrol edin. Kontrol panelindeki F2 tuşuna basarak konumsal lazeri açın ve yatay konumsal ışık, farenin başını kaplayan bobinin daha küçük kısmının ortasına gelene kadar fareyi hareket ettirin. Tekrar F2 tuşuna basarak konumsal lazeri kapatın ve ardından kontrol panelindeki F3 tuşuna basarak fareyi son konuma getirin.

Fare beyninin mıknatısın izomerkezinde olduğundan emin olmak için bir yerelleştirme taraması yaparak başlayın. 3D T2 ağırlıklı görüntüleme kullanarak vazojenik ödemi kalitatif olarak değerlendirin. Çok dilimli bir NADİR dizisi seçin ve burundan beyinciğe kadar tüm beynin kaplandığından emin olarak dilim konumunu ayarlayın.

Doygunluk dilimlerini ayarladıktan sonra diziyi başlatın ve görüntüleri elde etmek için 10 dakika 48 saniye bekleyin. Daha sonra, çok kesitli, çok spinli eko dizisini seçerek vazojenik ödemi kantitatif olarak değerlendirmek için T2 relaksometresi gerçekleştirin. Dilim konumunu ayarlayın ve sekiz dakika 53 saniye süren dizinin alımını başlatın.

Hem vazojenik ödemi hem de sitotoksik ödemi kantitatif olarak değerlendirmek için, bir spin-eko EPI difüzyon dizisi seçerek difüzyon ağırlıklı görüntüleme gerçekleştirin. Dilim konumunu ve doygunluk dilimini ayarlayın. Ardından diziyi başlatın ve ham görüntüler elde edilene kadar yedi dakika 56 saniye bekleyin.

Bunu takiben, 3D T2 yıldız ağırlıklı görüntüleme kullanarak mikro kanamaları değerlendirin. Akış telafili bir FLASH dizisi seçin, dilim konumunu ayarlayın ve 15 dakika 40 saniye boyunca çalışan diziyi başlatın. Daha sonra, bir 3D FLASH dizisi seçerek uçuş zamanı anjiyografisini kullanarak arteriyel açıklığı değerlendirin.

Dilim konumunu ayarlayın, diziyi başlatın ve görüntüler elde edilene kadar yedi dakika 16 saniye bekleyin. Son olarak, kan-beyin bariyeri bozulmasını değerlendirin. FLASH sekansı olan 3D T1 ağırlıklı bir görüntüleme seçin, dilim konumunu ayarlayın ve sekansın başlangıcını yapın.

Kontrastsız görüntüler elde edilene kadar bir dakika 14 saniye bekleyin. Ardından, kilogram başına 0,3 milimol kontrast enjekte edin ve ölçümü tekrarlayın. Kan-beyin bariyerinin bozulmasının artması ve sıvının artması, hafif hastalıkta zaten var olan koku soğancığında erken vazojenik ödemi gösterir ve hastalığın şiddeti arttıkça beyin sapına doğru yayılmaya başlar.

T2 haritalarında, vazojenik ödemin şiddeti, ilgilenilen bölgelerin belirli anatomik bölgelere çizilmesiyle ölçülebilir. Her bölge için ödem arttıkça artan bir T2 gevşeme süresi elde edilebilir. Ayrıca, ödemi gösteren beyin hacmi, orta derecede hasta farelerde taban çizgisine kıyasla önemli ölçüde artmaya başlar ve ciddi derecede hasta farelerde daha da artar.

Son olarak, mikrohemorajiler ve damar duyarlılık kontrastının artmasıyla kanıtlanan mikrovasküler patoloji, vazojenik ödemde kan-beyin bariyeri bozulmasının ilk belirtilerinden sonra ortaya çıkar. Bu mikrohemorajlar ağırlıklı olarak koku soğancığında görülür. MR protokolünün tamamı elde edilirse, uygun şekilde yapıldığı takdirde, konumlandırma dahil tüm görüntüler bir saat içinde elde edilebilir.

Minimal protokol, vazojenik ödem, mikrohemmoraj yükü ve mikrovasküler bozukluğun varlığını değerlendirmek için bir T2 ağırlıklı dizi veya T2 relaksometresi ve bir T2 yıldız ağırlıklı dizi içermelidir. Bu videoyu izledikten sonra, ex vivo olarak tespit edilmesi zor olan beyin şişmesi gibi değişiklikler de dahil olmak üzere, tüm beyin MRG'sinin deneysel serebral sıtmadaki patolojik değişiklikleri nasıl görselleştirdiğini iyi anlamış olmalısınız.