Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür
February 24th, 2017
Zebra balığı retina rejenerasyon çoğunlukla sabit retina kullanılarak incelenmiştir. Ancak, bu tür interkinetic nükleer göç gibi dinamik süreçler rejeneratif tepki sırasında meydana gelen ve altında yatan mekanizmaları araştırmak için canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada, biz multiphoton mikroskopi kullanılarak Interkinetic Nükleer Göç (INM) gerçek zamanlı olarak izlemek için kültür ve görüntüleme koşulları açıklar.
Bu izolasyon prosedürünün genel amacı, hasarlı zebra balıklarından retinal eksplant kültürlerinde interkinetik nükleer göç geçiren çoğalan hücrelerin canlı hücre görüntülemesini sağlamaktır. Bu yöntem, retinal rejenerasyonda, interkinetik nükleer göçü hangi mekanizmaların tetiklediği veya renal progenitör hücre interkinetik nükleer göçündeki Muller glia'nın benzer şekilde düzenlenip düzenlenmediği gibi temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, rejenerasyon sırasında interkinetik nükleer göç geçiren çoğalan hücrelerin dinamik davranışının izlenebilmesidir, bu da hücre döngüsü aşamasına özgü mekanizmaların araştırılmasına izin verir.
Bu yöntem interkinetik nükleer göç hakkında bilgi sağlayabilse de, mikroglial davranışın araştırılması veya ölmekte olan nöronların Muller glia fagositozu gibi diğer retinal araştırma alanlarına da uygulanabilir. Zebra balığını kuru bir kağıt havluya aktararak bu işleme başlayın. Ardından, bir çift kavisli forseps ile gözlerden birini çıkarın ve bir FluoroDish üzerine aktarın.
Stereo mikroskop altında, gözün arkasındaki optik sinir görünecek şekilde göz bebeği FluoroDish'in lamel kısmına bakacak şekilde gözü yönlendirin. Ardından, optik siniri gözün arkasına mümkün olduğunca yakın bir yerden çıkarın. Ek olarak, gözün dışındaki bağ dokusunu çıkarın.
Lamina cribrosa'yı bir makas bıçağıyla delerek ve gözün hem nazal hem de temporal taraflarını keserek optik stokta bir kesi yaparken gözü bir çift forseps ile burun ve temporal tarafları arasında tutun. Ardından, retinanın dorsal ve ventral taraflarını ayırın. Retinaya bağlı lensi ikinci bir forseps çifti ile tutarken bir çift forseps ile sklerayı dorsal retinadan çıkarın.
Bunu takiben, retinaya zarar vermeden lensi ve vitreusu çıkarın. Ardından, ganglion hücre tabakası FluoroDish'in lamel kısmına bakacak şekilde retinayı düzleştirin. Daha sonra, retinayı 10 mikrolitre% 1 düşük erime noktalı agaroz ile çevreleyin.
Retinanın sıvı agaroz tarafından kaldırılmadığından emin olun, çünkü hafif bir yükselme bile dokuya odaklanma yeteneğini etkileyebilir. Kaldırma gözlenirse, agarozu çıkarmak için bir pipet kullanın. Agarozun dokuyu lamel den kaldırmaması çok önemlidir, çünkü bu kaliteli görüntüler elde etme yeteneğini azaltır.
Tüm FluoroDish'i kaplamak için %1 düşük erime noktalı agaroz eklemeden önce bu prosedürü birkaç kez tekrarlayın. Agaroz katılaştıktan sonra, dokuya 1.5 mililitre kültür ortamı ekleyin. Görüntü alma yazılımında A1 MP GUI TI pad, A1 kompakt GUI ve ND alma pencerelerini açın.
Çoklu foton görüntüleme için, A1 kompakt GUI penceresinde IRNDD seçeneğinin seçildiğinden emin olun. Ardından, ayar alanında, ilk dikroik ayna için IRDM'yi seçin ve GFP floresansı elde etmek için bant geçiren filtrenin 525 ila 50 olarak ayarlandığını kontrol edin. Ardından, A1 MP GUI penceresindeki IR lazeri açın.
Lazerin hazır olması birkaç dakika sürecektir. Bundan sonra, GFP floresansını uyarmak için dalga boyunu 910 nanometreye ayarlayın ve otomatik hizalama düğmesine tıklayarak lazeri hizalayın. Retina kültürünü çoklu foton mikroskobu aşamasına yerleştirdikten sonra, foto çarpan tüpünün aşırı pozlanmasını önlemek için deklanşörü açmadan önce oda ve ekipman ışıklarının kapalı olduğundan emin olun.
Gürültü seviyelerini azaltmak için mikroskobu karanlık bir ortamda saklayın. Tarama alanı penceresinde ayarlanan iki yakınlaştırmada 300 x 300 piksellik bir görüş alanının ve A1 kompakt GUI penceresinde seçilen piksel başına 4,8 mikrosaniyelik bir piksel bekleme süresinin görüntülerini elde edin. A1 MP GUI penceresindeki alım alanını ve A1 kompakt GUI penceresindeki kazancı değiştirerek lazer gücünü kabaca ayarlayın.
Şimdi, ganglion hücre katmanına odaklanın ve ND edinme penceresi içindeki z alt penceresinde z yığınının üst odak düzlemini ayarlayın. Odak düzlemini, iç nükleer katmandaki muadillerine göre yuvarlak ve genişlemiş loş etiketli GFAP ve GFP pozitif hücrelerin varlığı ile karakterize edilen dış nükleer katmanın seviyesi boyunca hareket ettirin. Bu düzlemi z yığınının en altında ayarlayın.
Ardından, z adım boyutunu 0,7 ila bir mikrometre arasında ayarlayın. Z yoğunluğu düzeltmesini ayarlamak için z yoğunluğu düzeltme penceresini açın ve z yığını aralığını ayarlamak için ND arasından seçim yapın. Ardından, z yoğunluğu düzeltme penceresindeki alt odak düzlemine tıklayın ve lazer yoğunluğunu ve kazancını ayarlayın.
Daha sonra, seçilen odak düzlemi için z yoğunluğu düzeltme penceresindeki cihaz ayarları altında daha sonra gösterilen ayarları onaylamak için z yoğunluk düzeltme penceresindeki z değerlerinin yanındaki oka tıklayın. İşlemi orta ve üst düzlemler için tekrarlayın, lazer gücünü ve kazancını artırın. A1 MP GUI penceresinde çekim alanını ayarlayın ve fotoğraf ağarmasını ve artan gürültü seviyelerini atlatmak için görüntülemenin başlangıcında 15'ten büyük bir çekim alanı ve 126'dan yüksek bir kazanç seçmekten kaçının.
Ardından, z yoğunluk düzeltme penceresinde bağıl yoğunluk düzeltmesini seçin. ND alma penceresinin zaman serisi alt penceresinde, süreyi 8 saat ve aralığı gecikme yok olarak ayarlayın. Ardından, 3B zaman serilerini almak için ND alma penceresinin z yığını alt penceresindeki z düzeltmesini çalıştır'a tıklayın.
Bu prosedürde, bölücü bir GFAP ve GFP pozitif çekirdeği içeren bir bölgeyi kırpın. Bölünen çekirdeğin bazal INL'ye göre göç ettiği mesafeleri daha sonra ölçmek için bir referans noktası belirlemek için INM'ye tabi olmayan en az bir çekirdek içeren kırpılmış bir bölge seçin. 3D rekonstrüksiyon hazırlamaya yardımcı olur.
Dilimleri göster görünümü işlevini kullanarak ortogonal projeksiyonlar oluşturun. Ardından, modu dilimden maksimum yoğunluk projeksiyonuna değiştirin. Ardından, ortogonal maksimum projeksiyonun XY görünümünü kapatın.
Göç eden ve bölünen çekirdeğin en iyi göründüğü yöne bağlı olarak, XZ veya YZ görünümünü de kapatın. Farenin sağ tuşuyla kalan görüntüye tıklayın ve bu görünümden yeni belge oluştur işleviyle XZ veya YZ görüntü serisini çıkarın. Gerekirse, görüntüyü döndürün.
Manuel ölçüm fonksiyonunu kullanarak, bazal INL'de kalan ve INM'ye tabi olmayan çekirdeğin alt seviyesinde görüntü boyunca yatay bir çizgi çizin. Analiz yazılımındaki çizgi ölçüm aracını kullanarak zaman serisi için göç eden çekirdeğin referans çizgisi ile taban noktası arasındaki mesafeyi ölçün. Burada, çoklu foton mikroskobu ile elde edilen zaman atlamalı kaydın farklı zaman noktalarında retinal eksplantların bir z yığını görüntü serisinin maksimum YZ projeksiyonu gösterilmektedir.
Manuel ölçüm fonksiyonu altındaki çizgi aracı kullanılarak, bir yıldızla gösterilen referans hücresinin seviyesine yatay bir çizgi yerleştirildi. Yatay çizgiden başlayarak göç eden GF, AP ve GFP pozitif çekirdeğin bazal konumuna kadar uzanan dikey bir ölçüm çizgisi konumlandırıldı. Önceki şekilde ölçülen hücrenin, F0'ın apikal olarak göç ettiği ve ortaya çıkan yavru hücrelerin, D1 ve D2'nin, çoklu foton zaman atlamalı kayıtta temel olarak göç ettiği mesafe.
Kırmızı çizgi, apikal göç hızının hesaplandığı ölçümleri gösterirken, siyah ve gri çizgiler sırasıyla D1 ve D2 için bazal göç hızlarını hesaplamak için kullanılan ölçümleri gösterir. Mesafe, nükleer zarf parçalanmasından önce apikal göç ve yavru hücre D1 için hızlı bazal göç aşaması için kendi içinde zamana karşı çizildi. Bir kez ustalaştıktan sonra, üç balıktan retina izolasyonu, uygun şekilde yapılırsa 60 ila 90 dakika içinde yapılabilir. Bu süre hazırlık adımlarını içermez.
Bu prosedürü denerken, retina ekstansının canlılığını sağlamak için mümkün olduğunca çabuk çalışmayı unutmamak önemlidir. Daha derin doku katmanlarında görüntülemeyi sağlamak için retinaları mümkün olduğunca düz bir şekilde monte etmek de çok önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı retinalarının nasıl izole edileceğini ve monte edileceğini, interkinetik nükleer göçü izlemek ve göç hızlarını belirlemek için canlı hücre görüntülemenin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, zebra balığı retina eksplant kültürlerinde interkinetik nükleer migrasyonun (INM) canlı hücre görüntülemesine odaklanmaktadır. Çok fotonlu mikroskopi kullanılarak araştırmacılar, retina rejenerasyonunda yer alan dinamik süreçleri gözlemleyebilirler.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Yenileme Biyolojisi
- Canlı Hücre Görüntüleme
Arka Plan
- Zebra balığında retina rejenerasyonu, öncelikle sabit örnekler kullanılarak çalışılmıştır.
- INM gibi dinamik süreçler, rejenerasyonun anlaşılması için kritik öneme sahiptir.
- Canlı görüntüleme teknikleri, sabit örneklerin gösteremediği mekanizmaları ortaya çıkarabilir.
- Müller glial hücreleri retina rejenerasyonunda önemli bir rol oynar.
Çalışmanın Amacı
- Zebra balığı retina kültürlerinde INM'nin gerçek zamanlı gözlemini sağlamak.
- Retina rejenerasyonu sırasında INM'yi yönlendiren mekanizmaları araştırmak.
- Müller glial hücrelerinin INM ile ilgili düzenlenmesini keşfetmek.
Kullanılan Yöntemler
- Zebra balığından retina eksplantlarının izolasyonu.
- Çok fotonlu mikroskopi kullanılarak canlı hücre görüntüleme.
- INM sırasında çoğalan hücrelerin izlenmesi.
- Yöntemin diğer retina araştırma alanlarına uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Gerçek zamanlı olarak INM dinamiklerinin başarılı bir şekilde izlenmesi.
- Retina rejenerasyonu mekanizmalarına dair görüşler.
- Mikrogliyal davranışları incelemek için potansiyel uygulamalar.
- Ölen nöronların Müller glial hücreleri tarafından fagosite edilmesinin anlaşılması.
Sonuçlar
- Canlı hücre görüntüleme, retina rejenerasyonunu incelemek için güçlü bir araçtır.
- Hücrelerin dinamik davranışları gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir.
- Bu yöntem, retina araştırmaları için yeni yollar açar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables real-time visualization of interkinetic nuclear migration in adult zebrafish retinal explants, providing a dynamic model to study cellular mechanisms underlying tissue regeneration. By capturing migratory behaviors of Muller glia and progenitor cells, it supports mechanistic de-risking in target validation for regenerative therapies. The approach offers predictive value by linking nuclear dynamics to cell cycle regulation in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing nuclear migration dynamics in proliferating retinal cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of Muller glia re-entry into the cell cycle and progenitor cell generation.
- Predictive Value: Facilitates assessment of target engagement by correlating interkinetic nuclear migration with regenerative outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes standardized retinal explant cultures viable for live-cell imaging up to 8 hours, enabling consistent compound screening.
- Quantitative Output: Provides measurable apical and basal migration velocities for objective comparison across experimental conditions.
- Scalability: Uses multiphoton microscopy to image z-stacks throughout retinal thickness, supporting high-content analysis of migratory patterns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models adult zebrafish retinal regeneration, a system with conserved mechanisms relevant to human retinal repair.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling longitudinal tracking of progenitor cell behavior post-injury.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying nuclear migration as a functional readout of regenerative capacity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, offering a live-cell readout that complements endpoint assays in regenerative biology workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing real-time monitoring of cell cycle-dependent nuclear movements in response to injury.
- Screening: Enables assay standardization through controlled explant culture and multiphoton imaging parameters for reproducible data collection.
- Analytics: Generates quantitative migration velocity measurements that facilitate comparison of genetic or pharmacological perturbations.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical models by maintaining retinal explant viability for extended imaging sessions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying glial dynamics and progenitor cell behavior across multiple regenerative contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by revealing mechanistic links between nuclear migration and cell cycle progression in regenerating tissue.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized isolation, mounting, and imaging procedures for retinal explants.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing dynamic biomarkers of regenerative response prior to functional recovery assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their influence on interkinetic nuclear migration kinetics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, retinal dissection, and multiphoton microscopy operation.
- Depends on specialized instrumentation including IR laser systems and z-intensity correction capabilities for deep-tissue imaging.
- Necessitates cross-team standardization of explant preparation and imaging protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other retinal cell types or injury models beyond light-induced damage.
- Includes practical limitations such as the 8-hour imaging window and sensitivity to agarose-induced tissue elevation affecting focus stability.
