Dinamik 3D Periton microdevice Modelleme Yumurtalık Kanseri Multisellüler Sfero Davranış

Bu prosedürün genel amacı, yumurtalık kanseri metastazının meydana geldiği hücresel ve mekanik bileşenlerle intraperitoneal ortamı taklit etmek için dinamik bir mikroakışkan tabanlı ko-kültür platformu oluşturmaktır. Bu platform için bu mikroyu kullanarak, peritoneal yayılımın mikro ortamı gibi kanser biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olur. Bu tekniğin ana avantajı, hassas kontrollü serbest akış altında bir 3D ko-kültürün, yumurtalık kanseri hücreleri ile periton boşluğunda meydana gelen metotet hücreleri arasındaki in vivo iletişimi daha iyi taklit etmesidir.

Mikroakışkan kanal desenini tasarlayıp çizdikten ve metin protokolüne göre ürettirdikten sonra, 1800 RPM eğirme hızına sahip silikon gofret üzerine bir SU82075 Photoresist tabakası sıkın. Fotorezist kaplı gofreti doğrudan 65 santigrat derecede sıcak bir tabağa beş dakika pişirin. Ve sonra fazla çözücüyü çıkarmak için 25 dakika boyunca 95 santigrat derecede.

250 mikrometrelik bir son kalınlık için gofret üzerine ikinci bir SU82075 Photoresist tabakası sıkın. Fotorezist kaplı gofret, gofreti yavaşça oda sıcaklığına soğutmadan önce yedi dakika boyunca 65 santigrat derecede ve ardından 30 dakika boyunca 95 santigrat derecede doğrudan bir sıcak plakaya yerleştirin. Ardından, fotoğraf maskesini hizalayın ve doğrudan gofretin üzerine yerleştirin.

Ardından, deseni çapraz uzunlukta geçmek için 20 saniye boyunca UV ışığına maruz bırakın. Sıcak bir tabakta, kaplanmış gofretleri 65 santigrat derecede beş dakika ve 95 santigrat derecede 12 dakika pişirin ve çözücüyü prelimerizasyon için çıkarın. Gofreti 25 dakika boyunca bir SU8 geliştiricisine daldırarak çapraz uzunlukta olmayan Photoresist'i çıkarın.

Daha sonra izopropanal ile gofretleri durulayın ve kurutmak için basınçlı hava kullanın. Polidimetilsiloksan veya PDMS bazını ve kürleme maddesini 10'a bir kütle oranında birleştirin ve çözeltiyi karıştırmak için karıştırma ve gaz giderme işlevi altında santrifüjlü karıştırıcıyı kullanın. PDMS karışımını gofret üzerine yaklaşık beş milimetre yüksekliğe kadar yavaşça dökün.

PDMS'yi bir vakumlu desikatörde 40 dakika boyunca gazdan arındırın. Daha sonra PDMS'yi fırında 65 santigrat derecede iki saat kürleyin. PDMS levhasını master'dan dikkatlice soyun ve PDMS'yi bir cam slayt boyutuna gelene kadar kanallar boyunca kesin.

Daha sonra bir milimetrelik bir biyopsi zımbasıyla, cihazın giriş ve çıkışlarını oluşturmak için PDMS'yi delin. PDMS yüzeyini temizlemek için basınçlı hava kullanın ve ardından yapışkan bantla tozu ve PDMS kalıntılarını temizleyin. Şimdi PDMS levhasını kanal tarafı yukarı bakacak şekilde bir plazma temizleyiciye yerleştirin.

Ardından, PDMS levhasının yanındaki plazma temizleyiciye temiz bir cam sürgü yerleştirin. PDMS'yi ve cam slaytı hava plazması altında bir dakika boyunca yüksek radyo frekansı veya RF seviyesinde işlemden geçirin. Ardından, numuneleri plazma temizleyiciden çıkardıktan sonra, geri dönüşü olmayan bir kovalent bağ oluşturmak için PDMS'yi cam slayta bağlayın.

Yapışma gücünü artırmak ve kullanmadan önce PDMS'nin hidrofobikliğini geri kazandırmak için PDMS çipini bir saat boyunca 150 santigrat derecede sıcak bir plakaya yerleştirin. Mikroakışkan kanalları fibronektin ile kaplamak için, kanalları sterilize etmek için 30 mikro litre% 75 etanol kullanarak başlayın. Etanolü çıkarın ve kanalları iki kez durulamak için PBS kullanın.

Ardından PBS'yi kanallardan iyice aspire edin. 30 mikrolitre solüsyon ile serum içermeyen M199MCDB105 ortamında mililitre fibronektin çözeltisi başına 10 mikrogram hazırlayın, kanalları yavaşça doldurun ve kapatmak için bant kullanın. Ardından çipi gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Primer peritoneal mezoteli hücrelerini veya HPMC'leri mikroakışkan kanallara tohumlamak için, kültürlenmiş hücreleri metin protokolüne göre duruladıktan sonra, HPMC'leri yeniden askıya almak için iki mililitre% 10 FBS kültür ortamı kullanın. Bir hemositometre kullanarak, hücreleri sayın ve hücre konsantrasyonunu mililitre başına 3.5 kez 10 ila altıncı hücreye ayarlayın. Kullanmadan önce fibronektin kaplı mikroakışkan çipi 37 santigrat derece inkübatörde beş dakika

Daha sonra fibronektin çözeltisini tamamen aspire edin ve her kanala 30 mikrolitre HPMC süspansiyonunu yavaşça pipetleyin. Kanalları kapatmak için bant kullanın ve cihazı gece boyunca CO2 inkübatöre yerleştirin. Yumurtalık kanseri sferoid oluşumunu indüklemek için, sterilize edilmiş suda% 0.5 agarozu çözün.

50 mikrolitre agaroz çözeltisini 96 kuyucuklu plakanın kuyucuklarına dağıtın. Önceden kültürlenmiş insan epitel kanseri hücrelerini saydıktan sonra, hücreleri mililitre başına 5.000 hücre yoğunluğunda% 5 FBS kültür ortamında yeniden süspanse edin. Her agaroz kaplı kuyucuğa 200 mikrolitre hücre süspansiyonu aktarın.

Ve hücreleri 48 saat boyunca 37 santigrat derece ve yüzde beş CO2'de kültürleyin. Kanser sferoidlerini, bir mililitre serumsuz ortamla önceden ıslatılmış 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve sferoidleri beş dakika boyunca 750 kez G'de döndürün. Serum içermeyen M199MCDB105 ortamında mililitre başına 2.5 mikrogram CMFDA çözeltisinin hazırlanmasını takiben.

Kanser sferoidlerini çözeltinin bir mililitresinde tekrar süspanse edin ve sferoidleri 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra sferoid sayısını sayın ve konsantrasyonu mililitre başına 2.000 sferoid olarak ayarlamak için serumsuz ortam kullanın. Sferoid yüklemesinden önce, kanalların içindeki yapışmamış mezotelyo hücrelerini yıkamak için 100 mikrolitre serumsuz M199MCDB105 ortamını yavaşça enjekte edin.

Her kanala 30 mikrolitre floresan etiketli küresel süspansiyon yükleyin. Ardından mikroakışkan çipi CO2 inkübatörüne yerleştirin. Bir metre uzunluğundaki bir tüpe taze serumsuz M199MCDB105 ortamı yüklü bir şırınga takarak bir bolluk platformu oluşturun.

Şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin ve pistonu ve şırınganın gövdesini sabitleyin. Ardından şırınga pompasını inkübatörün içindeki mikroakışkan çip ile aynı yükseklikte yatay bir konuma monte edin. Ortam boruda taşana kadar hızlı ileri sarma düğmesini basılı tutarak tüm tüpü hızla orta ile infüze edin.

Ardından enjeksiyonu istenen akış hızında çalıştırın. Boruyu metin protokolüne göre kanalın girişine bağlayın. Ardından, çıkış ortamını toplamak için kanalın çıkışını 50 mililitrelik konik bir tüpe bağlamak için kısa çıkışlı bir tüp kullanın.

Son olarak, HPMC'leri ve kanser sferoidlerini gözlemlemek için parlak bir alan veya floresan mikroskobu kullanın. Bu videoda açıklanan mikroakışkan platform kullanılarak, yumurtalık kanseri sferoidleri hidrodinamik koşullar altında mezotelyal hücrelerle modellendi. Bu şekilde gösterildiği gibi, mikrocihazda 16 saat boyunca kültürlenen mezotelyal hücreler, başarılı bir şekilde tek katmanlı bir HPMC oluşturdu.

Bu deneyde, hasta toplumlarında bulunanlara benzer boyutta olan yaklaşık 100 mikrometre çaplarına sahip çok hücreli sferoidler, yeşil bir floresan boya CMFDA ile etiketlendi. Sferoidler daha sonra HPMC kaplı mikroakışkan kanallara aktarıldı ve süspansiyonda kaldı ve hücre morfolojileri yakalandı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç gün boyunca birkaç saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürde 10'da bir, mikroakışkan kanallara hava kabarcıkları girmekten kaçınmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, introperitoneal mikroçevrenin kanserin ilerlemesi üzerindeki etkisi gibi ek soruları yanıtlamak için ilaç tedavisi, adezyon deneyleri, mezotetik temizleme testleri gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kanser biyolojisi alanındaki araştırmacıların insanlarda peritoneal mezastazı araştırmaları için bir yol açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, periton boşluğunda yumurtalık kanseri davranışını başlatmak için akışkan akışlı bir peritoneal mikrocihazın nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Aseton gibi organik kükürtlerle geliştirici ve silindir olarak çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürü ilk kez gerçekleştirdiğinizde eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek gibi MP uyarıları her zaman alınmalıdır.

Bu ofisle ilgili tüm prosedürler son derece gizli bir şekilde gerçekleştirilmelidir.