Name: Dinamik 3D Periton microdevice Modelleme Yumurtalık Kanseri Multisellüler Sfero Davranış (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Keşfedin, dinamik mikroakışkan tabanlı 3D ortak kültür platformu kullanarak yumurtalık kanserinin peritoneal yayılımını nasıl modelleneceğini. Bu yöntem, kanser hücreleri ve mezotel hücreleri arasındaki iletişimi in vivo koşullarda incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Hong Kong Araştırma Bursu Konseyi tarafından desteklenmiştir (hibe 17.122.014, C1013-15G, 719813E, ve 17304514). AST Wong Croucher Kıdemli Araştırma Bursu bir alıcı.

1. Mikroakışkan Cihaz Tasarımı ve Üretimi <ol><li> Mikroakışkan ana tasarım <ol><li> Tasarım ve herhangi bir bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı ile mikroakışkan kanal deseni çizin. NOT: Normalde, CAD-Çizimi photomask üretmek için bir photomask şirkete gönderilebilir. mikroakışkan tasarımı üç aynı paralel kanal, aşağıdaki boyutlara sahip, her oluşur: 4 mm ile 250 um x 25 mm x (genişlik x yükseklik x uzunluk) ve 2 mm aralıkla konulmuş. Her iki kanal uçları sıvı giriş ve çıkışları (Şekil 1B) kolaylaştırmak için 127 ° açılarla tasarlanmıştır. Bu protokolde kullanılan kanal önceki yayın 13 bildirilmiştir. </li><li> Her biri 15 dakika için aseton, izopropanol ultrasonikasyon (500 W / 42 kHz) ve iyonu giderilmiş su ile silikon gofret yıkayın. basınçlı nitrojen gazı ile gofret kurutun. 15 dakika tamamen kuruyana kadar 250 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerinde silikon gofret Isıo. </li><li> Spin-kaplama 1800 rpm&#39;lik bir eğirme hızında silikon gofret üzerine (125 mikron kalınlığında) SU-8 2075 Fotorezist tabaka. (SU-8 ürün kılavuzuna göre), sırasıyla 5 ve 25 dakika süreyle, fazla çözücüyü yok etmek için, 65 ° C&#39;de ve daha sonra 95 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerinde, doğrudan fotorezist kaplı gofret fırında. </li><li> Adım 3 ve eğirme kat SU-8 2075 Fotorezist bir kat 250 um&#39;lik bir son kalınlığı elde edilmiştir. 7 dakika için 65 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerinde, doğrudan fotorezist kaplı çok ince bisküvi fırınlama ve daha sonra 30 dakika boyunca 95 ° C &#39;de. Yavaş yavaş oda sıcaklığına soğumaya gofret. basınçlı hava ile soğutmak etmeyin. </li><li> Hizalayın ve gofret üstüne doğrudan photomask koydu. desen çapraz bağlanması için 20 saniye süreyle UV ışınlarına maruz kalmaktadır. </li><li> 65 ° C sıcaklıkta fotorezist ile gofret ve 5 ile 12 dakika boyunca bir sıcak plaka üzerinde 95 ° C&#39;de pişirin, sırasıyla (SU-8 ürün kılavuzuna göre) polimerizasyonu için çözücünün ayrılması için. Daha sonra, gofretin soğumayaoda sıcaklığı. </li><li> 25 dakika SU-8 geliştirici gofret daldırarak olmayan çapraz ışığa çıkarın. izopropanol ile gofret durulayın ve basınçlı hava ile kurutun. NOT: izopropanol ile durulama eksik gelişimini gösteren zaman sütlü çözüm gözlendi ise, daha uzun bir geliştirme zamanı için SU-8 geliştirici geri gofret batırmayın. </li><li> 10 dk potansiyel çatlaklardan desen iyileşmesi için 180 ° C&#39;de sıcak bir plaka üzerinde gofret yerleştirin. sıcak plaka kapatın ve yavaş yavaş sıcak plaka üzerinde bırakarak oda sıcaklığına gofret soğumasını. </li><li> Bir şişe kapağı trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktil) silan, bir kaç damla ekleyin. Vakum desikatörde flakon kap koyun. 10 dakika için gofret Silanize flakon kapağının yanında gofret yerleştirin. </li></ol></li><li> PDMS çip üretim <ol><li> Bir tutucu oluşturmak için alüminyum folyo ile gofret sarın. </li><li> 1 kütle oranına: 10 de polidimetilsiloksan (PDMS) taban ve sertleştirici karıştırınkarıştırma ve gazını fonksiyon altında bir santrifüj mikser ile. yaklaşık 5 mm yüksekliğe kadar gofret üzerine yavaş yavaş PDMS karışımı dökün. 40 dakika boyunca vakum altında PDMS gazdan arındırın. 2 saat boyunca 65 ° C&#39;de bir fırın içinde PDMS Cure. </li><li> Dikkatle ana kapalı PDMS levha soyma ve bir cam slayt boyutu kadar kanallar boyunca PDMS kırpın. Cihazın giriş ve çıkışlarının oluşturmak için 1 mm biyopsi yumruk PDMS yumruk. </li><li> toz ve PDMS enkaz kaldırmak için basınçlı hava ve yapışkan bant ile PDMS yüzeyi temizleyin. </li><li> Kanal tarafı plazma süpürge içine, yukarı bakacak şekilde, PDMS levha yerleştirin. PDMS levha yanında plazma süpürge içine temiz bir cam slayt yerleştirin. </li><li> 1 dakika boyunca yüksek RF düzeyinde hava plazması altında PDMS ve cam slayt davranın. geri dönüşü olmayan bir kovalent bağ oluşturmak için cam slayt PDMS bağlayın. </li><li> yapışma gücünü artırmak için, 1 saat boyunca 150 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerinde PDMS çip yerleştirilir ve hydrop dönmekKullanmadan önce PDMS hobicity. </li></ol></li></ol> 2. Tohumlama Primer Periton Mezotelyal Hücreleri ile mikroakışkan Chip (HPMCs) <ol><li> mikroakışkan kanalların Fibronektin kaplama <ol><li> % 75 etanol içinde 30 uL mikroakışkan kanal sterilize edin. etanolü ortadan kaldırmak ve bir pipet ucu kullanılarak steril fosfat tamponlu tuz, 30 uL (PBS) ile iki kez yıkayın. İyice kanallarda PBS aspire. NOT: kirlenmesini en aza indirmek için, mikroakışkan hücre kültürü dikkatli bir laminar akış başlığı aracılığıyla tamamen aseptik koşullar altında gerçekleştirilmelidir. </li><li> MCDB105 (1: 1) ortamı, serumsuz M199 bir 10 ug / ml fibronektin çözeltisi hazırlayın. kabarcık oluşumunu önlemek için özel bakım ile, yukarı ve aşağı çözüm pipetle. vorteks etmeyin. </li><li> Yavaşça fibronektin solüsyonu 30 uL ile her kanalı doldurmak. bant ile kanal kapatılır ve 4 ° C&#39;de bir gece inkübe çip. </li></ol></li><li&gt; Mikroakışkan kanallar içine Tohum HPMCs <ol><li> % 10 fetal sığır serumu (FBS) kültür ortamı içinde kültürü HPMCs:% 80 konflüense kadar 37 ° C &#39;de% 5 CO2 altında (M199 MCDB105% 10 FBS ve 100 U / ml penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir). </li><li> 3 mL PBS ile durulayın HPMCs ve% 0.05 tripsin, 2 mL / 30 sn için,% 0.01 EDTA (TE) çözeltisi ile tripsinize edin. % 10 FBS kültür ortamının 4 ml ile nötralize edildi ve 5 dakika 1000 xg&#39;de hücreleri aşağı doğru döndürün. </li><li> % 10 FBS kültür ortamı 2 mL HPMCs yeniden süspanse edin. Bir hemasitometre ile hücre sayısını ve 3.5 × 10 6 / mL hücre konsantrasyonunu ayarlamak. </li><li> kullanımdan önce 5 dakika için 37 ° C kuluçka makinesi içinde fibronektin kaplı mikroakışkan çip ısıtın. Tamamen fibronektin çözüm aspire. </li><li> Yavaş yavaş her kanal içine HPMC süspansiyonu 30 mcL pipetle. Bant ile kanal Seal ve bir gecede CO 2 inkübatör cihazları yerleştirin. </li></ol></li></ol><ol><li> Yumurtalık kanseri sfero oluşumu <ol><li> Deney yapılmadan önce 37 ° C &#39;de% 5 CO2 altında: (% 5 FBS ve 100 U / ml penisilin / streptomisin ile MCDB105 M199)% 5 FBS kültür ortamı insan epitelyal yumurtalık kanseri hücre çizgisi SKOV-3 korur. </li><li> kaynatılarak steril su içinde% 0.5 agaroz içinde çözülür. 96 oyuklu plakalar, her kuyuya agaroz çözeltisi 50 uL koyun. Agaroz katılaşmaya izin 20 dakika kaputu plakaları bırakın; kuyu hücre yapışmasını önlemek ve yapabilirsiniz kaplama katılaşmış agaroz plakalar kullanıma hazır olduğunu gösterir. </li><li> 3 mL PBS ile SKOV-3 hücreleri durulayın. 3 dakika için TE çözeltisi 2 mL ile tripsinize edin. % 5 FBS kültür ortamının 4 ml ile nötralize edildi ve 5 dakika 1000 xg&#39;de hücreleri aşağı doğru döndürün. </li><li> hemositometre ile SKOV-3 hücre sayısını ve 5000 hücre / ml bir yoğunlukta% 5 FBS kültür ortamında tekrar süspansiyon hücreleri. TrHer bir hücre süspansiyonu ansfer 200 uL 48 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 de altında kültür agaroz kaplanabilir. </li></ol></li><li> Kanser sfero yükleme <ol><li> 50 mL&#39;lik bir santrifüj tüpüne serumsuz ortam 1 ml ile ön ıslatmaya tabi kanser parçacıklarının aktarın ve 5 dakika boyunca 750 x g&#39;de aşağı doğru döndürün. NOT: pipet uçları Önceden ıslatılmış ve santrifüj tüpleri santrifüj tüplerine üzerine istenmeyen sfero eki önleyebilir. </li><li> serumsuz M199 5-chloromethylfluorescein diasetat (CMFDA) çözeltisi 2.5 ug / mL hazırlayın: MCDB105 ortam. CMFDA çözeltisi 1 mL içinde süspanse kanseri sferoidler ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. 5 dakika boyunca 750 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 750 x g&#39;de serumsuz ortam ve santrifüj 2 mL kanser sferoidler durulayın. ortamdan kalan floresan boya kaldırmak için iki kez bu adımı yineleyin. Not: flüoresan sinyal fazla 96 saat parçacıklarının muhafaza edilebilir. </li><li> kanser yeniden süspanseSerum serbest M199 içinde sferoidler: MCDB105 orta ve hemasitometre ile sfero sayısını. serumsuz ortam ile 2.000 sferoidler / ml konsantrasyon ayarlayın. </li><li> kanallar içinde olmayan yapışık mezotel hücreleri yıkayacak MCDB105 orta: yavaş yavaş, yükleme Sfero serum serbest M199 100 mcL enjekte önce. NOT: Hızlı bir enjeksiyon, aspirasyon veya kabarcık oluşumu mezotel tek tabaka dekolmanı yol açacaktır. </li><li> Her kanal içine floresan etiketli sfero süspansiyonu yük 30 uL. CO 2 kuvöz içine mikroakışkan çipi yerleştirin. </li></ol></li><li> Perfüzyon platformu montaj ve ko-kültür <ol><li> 1 m uzunluğunda tüp MCDB105 ortam taze, serumsuz M199 ile yüklenen bir şırınga takın. </li><li> şırınga pompası şırınga yerleştirin ve pistonu ve şırınga gövdesini sabitleyin. inkübatör içinde mikroakışkan çip ile aynı yükseklikte yatay konumda şırınga pompasını takın. NOT: numarası ve şırınga büyüklüğü kullanılan kanal sayısı ve deney süresine bağlıdır. </li><li> Hızla basarak ve orta boru taşmaları kadar hızlı ileri düğmesini basılı tutarak orta ile tüm tüp demlenmeye. </li><li> İstenen akış hızında enjekte çalıştırın. aşağıdaki denklem kullanılarak duvar kayma gerilmesi tahmin: <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/55337/eq1.jpg" /> τ duvar kayma odasının,, ∈ = akış hızı içinde stres, μ = viskozitesi (0.01 gr cm -1) temsil eder; h = akış odasının yüksekliği ve w = akış odası genişliği. </li><li> kanal girişine boru bağlayın. Orta önce kanal içine enjekte edilen ılıtılır sağlamak için inkübatör fazla giriş boru yerleştirin. boru ve kanal arasındaki bağlantı sağlamak için, uygun bağlayıcılar seçilebilir. NOT: enjektörler herhangi kabarcık tanıtmak için dikkatge, boru ve bağlantıları. </li><li> Kısa bir çıkış borusu ile çıkış ortamı toplamak için bir 50-ml konik tüp kanalın çıkışını bağlayın. NOT: Tüm dinamik ko-kültür sistemi Şekil 1D gösterilmiştir. </li></ol></li></ol> Perfüzyondan sonra HPMCs ve Kanser küremsi 4. Gözlem <ol><li> parlak-alan veya floresan mikroskop ile HPMCs ve kanser parçacıklarının gözlemlemek ve perfüzyon 1 saat sonra fotoğraf çekmek. </li></ol>

<ol><li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21296855">Global cancer statistics.</a> CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).</li>
<li>Burleson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).</li>
<li>Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Kit+mediates+chemoresistance+and+tumor-initiating+capacity+of+ovarian+cancer+cells+through+activation+of+Wnt%2Fbeta-catenin-ATP-binding+cassette+G2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">c-Kit mediates chemoresistance and tumor-initiating capacity of ovarian cancer cells through activation of Wnt/beta-catenin-ATP-binding cassette G2 signaling.</a> Oncogene. 32, 2767-2781 (2013).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+ovarian+cancer-initiating+cells+from+primary+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors.</a> Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).</li>
<li>Tang, M. K. S., Zhou, H. Y., Yam, J. W. P., Wong, A. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Met+overexpression+contributes+to+the+acquired+apoptotic+resistance+of+nonadherent+ovarian+cancer+cells+through+a+cross+talk+mediated+by+phosphatidylinositol+3-kinase+and+extracellular+signal-regulated+kinase+1%2F2%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2.</a> Neoplasia. 12, 128-144 (2010).</li>
<li>Ksiazek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+peritoneal+mesothelial+cells+promote+ovarian+cancer+cell+adhesion%3A+the+role+of+oxidative+stress-induced+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin.</a> Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).</li>
<li>Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinked+Fibrin+Derivatives+and+Fibronectin+in+Ascitic+Fluid+from+Patients+with+Ovarian-Cancer+Compared+to+Ascitic+Fluid+in+Liver-Cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis.</a> Thromb Res. 35, 53-64 (1984).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesothelial+cells+promote+early+ovarian+cancer+metastasis+through+fibronectin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion.</a> J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).</li>
<li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+tumor+vasculature%3A+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307, 58-62 (2005).</li>
<li>Chang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+cycle+arrest+induced+by+shear+stress%3A+Roles+of+integrins+and+Smad%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).</li>
<li>Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+driving+force+for+change%3A+interstitial+flow+as+a+morphoregulator%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator.</a> Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).</li>
<li>Rizvi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+induces+epithelial-mesenchymal+transition%2C+cellular+heterogeneity+and+biomarker+modulation+in+3D+ovarian+cancer+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).</li>
<li>Ip, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemness+and+chemoresistance+in+epithelial+ovarian+carcinoma+cells+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress.</a> Sci. Rep. 6, 26788(2016).</li>
<li>Avraham-Chakim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid-flow+induced+wall+shear+stress+and+epithelial+ovarian+cancer+peritoneal+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading.</a> PloS one. 8, e60965(2013).</li>
<li>Burkhalter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.fasebj.org/content/26/1_Supplement/656.11">Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer.</a> Faseb Journal. 26, (2012).</li>
<li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li>
<li>Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+assessment+of+three-dimensional+cell+aggregation+in+rotating+wall+vessel+bioreactors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro.</a> Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).</li>
<li>Ismadi, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+characterization+of+a+spinner+flask+for+induced+pluripotent+stem+cell+culture+application%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application.</a> PloS one. 9, e106493(2014).</li>
<li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic-based+multi-shear+device+for+investigating+the+effects+of+low+fluid-induced+stresses+on+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one.+9%22%5BJournal%5D)">A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts.</a> PloS one. 9. 9, e89966(2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu deney, yapışma tahlilleri, mezotel klirensi deneyleri, ve bunların ilaç tarama, bunlarla sınırlı olmamak üzere, çeşitli biyokimyasal ve hücre bazlı deneyler, ile dahil, ancak esnek bir ve fizyolojik açıdan ilgili bir model sunmaktadır. Bu kanser oluşumunu intraperitonal mikro etkisinin değerlendirilmesi için uygulanabilir. Ancak, birkaç deneysel koşullar projenin amaçları bağlı optimize edilmesi gerekebilir (örneğin, kanal, ko-kültür zaman, vb başına ekildi HPMCs ve kanser sferoidler sayısı). fibrob...

<html> Yumurtalık kanseri en ölümcül jinekolojik kanser ve yaygın periton yaygınlaştırılması ve malign asit 1 oluşumu ile karakterizedir. Bu geniş periton metastazı önemli bir klinik zorluk temsil eder ve kötü klinik sonuçlarla ilişkilidir. kan yoluyla metastaz en sağlam karsinom aksine, yumurtalık kanseri başta periton boşluğuna içinde yaymaktadır. Tümör hücreleri metastaz 2 sürecinde olduğu gibi çok hücreli agrega / parçacıklarının var. Süspansiyon kültürü yumurtalık kanseri kök / tümör başlatılması hücreleri zenginleştirmek gerçeği ayrıca bu sferoidler iki tümörün agresif oluş ile ilişkili olan ve kemoterapi direncinin 3, 4 gelişmiş olabileceğini düşündürmektedir. Muhtemelen farklı moleküler mekanizmaları 5 var 2D ve 3D kültürler arasındaki ilaç yanıt farklılıklar vardır. _content &quot;&gt; mesothelium ile temel etkileşim yumurtalık tümörü ilerlemesi için temel mikro oluşturur. Bu mezotel hücre fibronektin bir yerde kurucu olan bir hücre dışı matriks (ECM), üzerinde yalan. artan mezotel hücre kaynaklı fibronektin ifadesi arasındaki bir bağlantıyı tümör ilerlemesi gösterilmiştir. fibronektin malign asit 6, 7 bol miktarda mevcuttur. yumurtalık kanseri hücreleri, erken yumurtalık kanseri metastazı 8 teşvik etmek için mezotel hücreleri fibronektin salgılanmasını uyarabildiği. Kanıtlar ortaya çıkan kesme stresi dahil olmak üzere, mekanik uyarı, hücre morfolojisi, gen ekspresyonunu modüle eden ve bu nedenle, tümör hücresi 9, 10, 11 fenotipleri göstermektedir. malign asit gibi geliştirmek ve t sırasında birikirumor ilerlemesi, yumurtalık tümör hücreleri sıvı akışı ve ortaya çıkan kesme stresine maruz kalır. Bir çok grup,, bizim dahil hücre iskeleti modifikasyonlar, epitelyal-to-mezenkimal geçişler ve kanser stemness 12, 13, 14, 15 dahil olmak üzere, yumurtalık kanser oluşumunu kesme stresi etkilerini göstermiştir. Böylece, fizyolojik olarak ilgili mikro-tümör periton metastazı araştırmak için önemlidir. Bununla birlikte, mevcut in vitro hidrodinamik kültür sistemleri sürekli, düşük, fizyolojik ilgili kayma gerilmesi 16, 17, 18, 19 taklit ve kontrol sınırlamalar var. Vitro geleneksel hala sınırlıdır hücresel veya mekanik çevre ya odaklanan yaklaşımlarUygun fizyolojik alaka ile intraperitoneal mikroçevresinin karmaşıklığını taklit. Burada, geleneksel stratejilerin sınırlamaları aşmak için ve kanser metastazı intraperitoneal bölmesinin çalışma ilerlemek için periton yeni bir model mühendisi için, kontrollü sıvı akışı ile 3D mikroakışkan tabanlı bir platform dizayn edilmiştir. Bu modelde, yumurtalık kanseri sferoidler, sürekli akışkan akışı (Şekil 1A) altında mikroakışkan fiş primer insan periton mezotel hücreleri ile birlikte kültürlendi. mezotel hücreleri fibronektin ekildi. Yapışkan olmayan yumurtalık kanseri sferoidler bir şırınga pompası ile perfüze sürekli akış ortamı ile mikroakışkan kanal içine ekilmiştir. 3D çevre ve dinamik mekanik kuvvetlerin hem metastatik kaskad çok önemli faktörlerdir. Bu platform, karmaşık cel açısından intraperitonal mikro-araştırmak için kullanılabiliryanı sıra, dinamik mekanik işaretlere ilişkin lular ve ortak kültürlenme etkileşimi.

<table><tbody><tr><td>Silikon gofret</td><td>Üniversite gofret</td> <td># 1196</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>SU-8 2075 fotorezist;</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 geliştiricisi&nbsp;</td><td>Microchem</td><td>108-65-6</td><td></td></tr><tr><td>Trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktil) silan</td><td>Sigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td>Polidimetilsiloksan (PDMS) + kürleme maddesi kiti</td></tr><tr><td>Biyopsi yumruğu ve nbsp;</td><td>Miltex</td><td>33-31AA</td><td>1 mm çap</td></tr><tr><td>Plazma temizleyici</td><td>Harrick Plazma</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen boru</td><td>SCI</td><td>BB31695-PE / 5</td><td>0,86 mm (iç çap)</td></tr> <tr><td>Şırınga</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Daha uzun hassas pompa&nbsp;</td><td>&nbsp; LSP01-2A</td><td></td></tr><tr><td>Orta 199</td><td>Invitrogen</td><td>31100-035</td><td>2.2 g / L sodyum bikarbonat</td></tr><tr><td>MCDB 105 Orta</td><td>Sigma</td><td>M6395</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Hidroksin</td><td>SH30068.02</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin ve nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin EDTA çözeltisi&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>%0.05 Tripsin - %0.01 EDTA, fenol kırmızısı</td></tr><tr><td>Fibronektin insan</td><td>BD</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>5-klorometilfloresein diasetat</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>C7025</td><td>Yeşil CMFDA</td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Hitachi</td><td>CT15RE</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Modeli: 80i veya ECLIPSE Ti; yazılım: SPOT</td></tr><tr><td>SKOV-3 & nbsp;</td><td></td><td></td><td>Dr. N Auersperg'den (British Columbia Üniversitesi) Hediye</td></tr></tbody></table>

dinamik 3d periton microdevice modelleme yumurtalık kanseri multisellüler sfero davranış

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Yumurtalık kanseri sık malign asit bulunan tümör küreler ile geniş periton metastazı ile karakterizedir. Bu kötü klinik sonuçlarla ilişkili ve halen etkin bir tedavi yoksun. Hem üç boyutlu (3D) çevre ve dinamik mekanik kuvvetler bu metastatik kaskad çok önemli faktörlerdir. Ancak, geleneksel hücre kültürleri bu doğal tümör mikro özetlemek için başarısız. Böylece, periton ortamı taklit in vivo benzeri modeller belirgin öneme sahiptir. Bu çalışmada, periton yeni bir mikroakışkan platformu metastaz sırasında periton boşluğuna yumurtalık kanseri sferoidler durumu taklit etmek için kurulmuştur. Bir yapışkan olmayan koşullar altında üretilen Yumurtalık kanseri sferoidler fizyolojik olarak ilgili kesme stresine maruz periton mezotel hücreleri ile kaplanmış mikroakışkan kanal kültürlenmiştir. Özetle, bu dinamik 3D yumurtalık kanseri-Mesothelium mikrofonrofluidic platformu temel kanser biyolojisi üzerine yeni bilgi vermek ve potansiyel ilaç tarama ve geliştirme için bir platform olarak hizmet verebilir.

Bu protokolü kullanarak, bir mikroakışkan platformu hidrodinamik koşullar altında mezotel hücreleri ile yumurtalık kanseri sferoidler modellemek için kurulmuştur. Primer insan periton mezotel hücreleri 16 saat microdevice kültürlendi ve parlak alan mikroskop altında gözlemlenmiştir. Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi, kanal alt başarılı HPMCs bir tek tabaka ile kaplandı. Kanal kaplama yetmezliğine yol açacaktır fibronektin veya HPMC desen sırasında kabarcık oluşumunu dikk...

fizyolojik olarak ilgili model yumurtalık tümör progresyonunu incelemek için, çok hücreli küreler simüle sıvı akışı altında microdevice kültürlenmiştir. Bu dinamik 3D modeli yumurtalık kanseri metastazı meydana hücresel ve mekanik bileşenleri ile intraperitoneal ortamı benzetilmiştir.

Dinamik 3D Periton microdevice Modelleme Yumurtalık Kanseri Multisellüler Sfero Davranış

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Bu prosedürün genel amacı, yumurtalık kanseri metastazının meydana geldiği hücresel ve mekanik bileşenlerle intraperitoneal ortamı taklit eden, dinamik mikroakışkan tabanlı bir ko-kültür platformu oluşturmaktır. Bu platform için mikroakışkan sistemlerin kullanılması, periton yayılımının mikroçevresi gibi kanser biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, hassas kontrollü serbest akış altındaki 3D ko-kültürün, periton boşluğunda meydana gelen yumurtalık kanseri hücreleri ve mezotelyal hücreler arasındaki in vivo iletişimi daha iyi taklit etmesidir.Mikroakışkan kanal deseni tasarlanıp çizildikten ve metin protokolüne uygun olarak üretildikten sonra, silikon plak üzerine 1800 RPM dönme hızıyla bir tabaka SU82075 Fotoresist spin kaplama yöntemiyle uygulayın. Fotoresist ile kaplanmış plakayı doğrudan bir ısıtıcı plaka üzerinde beş dakika boyunca 65 °C'de pişirin. Ardından, fazla çözücüyü uzaklaştırmak için 25 dakika boyunca 95 °C'de pişirin.250 mikrometre nihai kalınlık elde etmek için gofret üzerine ikinci bir SU82075 Fotoresist tabakası spin kaplama yöntemiyle uygulayın. Fotoresist kaplı gofreti doğrudan 65 °C'deki bir ısıtıcı plaka

modeling-ovarian-cancer-multicellular-spheroid-behavior-dynamic-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada anlatılan mezotel klirensi tayini floresan ile işaretlenmiş hücreler ve zaman atlamalı video mikroskopi görselleştirmek ve kantitatif yumurtalık kanseri çok hücreli sferoidler ve mezotel hücre tek katmanlarının etkileşimleri ölçmek için yararlanır. Bu test yumurtalık kanseri metastaz erken adımları modeller.

In vitro Mezotelyal Gümrükleme Assay o Yumurtalık Kanseri Metastaz Erken Adımlar modeller

Üç boyutlu heterotipik<em&gt; In Vitro</emYumurtalık Kanseri Başlatma ve İlerleme sırasında Stromal-Epitel Etkileşimleri&gt; Modelleme

Bu videoda, periton boşluğunun astarının in vitro üç boyutlu bir modelinin geliştirilmesini gösteriyoruz. Bu organotipik kültür, yumurtalık kanseri hücresi adezyonunu, invazyonunu ve proliferasyonunu araştırmaya yardımcı olabilir.

Periton Boşluğu Astarında Yumurtalık Kanseri Metastazının Modellenmesi: Periton Astarının İn Vitro 3D Modelini Oluşturmak İçin Bir Yöntem

Bu videoda, omental eksplant içinde yumurtalık kanseri kolonizasyonunu incelemek için GFP eksprese eden yumurtalık kanseri hücreleri ile kaplanmış bir ex vivo omental organ kültürü oluşturuyoruz. Bu protokol, metastazı teşvik eden sütlü lekeler olarak bilinen omentum içindeki bağışıklık hücresi yapılarını analiz eder.

Omentumun Yumurtalık Kanseri Hücre Kolonizasyonunun Modellenmesi: Murin Omentum Eksplantlarında Floresan Etiketli Yumurtalık Kanseri Hücrelerinin Sütlü Nokta Kolonizasyonunu Oluşturmak İçin Ex Vivo Bir Yöntem

Periton mezotel zarının içine yumurtalık kanseri hücre işgali zamanla dinamik bir süreçtir. Gerçek zamanlı analiz kullanarak, bir küremsi-mezotel hücresi eş-kültür modelinde, yumurtalık kanseri hücrelerinin invaziv kapasitesi metastatik işlemini düzenleyen faktörleri bakış açıları sağlayan, uzun süreler boyunca ölçülebilir.

Real Time Mezotelyal Hücrelerinin Yumurtalık Kanseri Sferoid Ek ve Invasion Değerlendirilmesi

Burada, yumurtalık kanseri hücresi adezyonunu, invazyonunu ve proliferasyonunu araştırmak için bir araç olarak, birincil insan mezotelyal hücreleri ve hücre dışı matris ile katmanlanmış fibroblastlardan oluşan periton boşluğunun astarının üç boyutlu bir in vitro modelini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

İnsan periton boşluğuna bir Organotipik Kültür Yumurtalık Kanseri Yaygınlaştırılması Erken Adımlar Modelleme

Bu protokol, ilacın belirlenmesi için, hastanın türetildiği kürlerin oluşumunu, proliferasyonun ölçülmesi, sitotoksisite testi, akış sitometri, immünofluoresesans boyama ve konfoksel görüntüleme gibi aşağı akış analizini açıklar. anti-neoplastik terapötik olarak adayların potansiyeli. Bu protokol her hasta ve hastalığın aşaması için spesifik ilaçların tanımlanması ile hassas ilacı destekler.

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

Bu protokolün amacı, immünofluorescence, transkripsiyon gibi farklı analiz sistemlerinde ele alınabilir bir tümör toplu benzeri ortamda, kanserle ilişkili fibroblastların (CAFs) farklılaşmasını incelemek için bir 3D in vitro modeli kurmaktır analiz ve yaşam hücresi görüntüleme.

Kanser Ilişkili fibroblastlar farklılaşma ve Invazyon In vitro etütler için daha fizyolojik bir sistem olarak bir 3D Küroid modeli

İlgili insan hastalığını sadakatle nükseden kapsamlı in vitro modeller eksiktir. Mevcut çalışma, insan hepatosellüler karsinomunda tümör-stromal etkileşimi incelemek için güvenilir bir in vitro araç olan üç boyutlu (3D) tümör sferoid oluşturma ve kültürü ssunuyor.

Hepatosellüler Karsinomdaki Tümör-Stromal Etkileşimi Araştırmak İçin Üç Boyutlu Sferoid Modeli

Bu protokol, kanser hücresi-omentum etkileşiminin üç boyutlu (3D) ex vivo modelinin kurulmasını açıklar. Model, yağ nişi içindeki pro-tümör mekanizmalarını aydınlatmak ve yeni tedavileri test etmek için bir platform sağlar.

İnsan Omentumu Kullanılarak Over Kanseri Periton Metastazının Ex Vivo Modeli

Kanser metastazını incelemek için heteroselüler karışmayı yakalayan 3D kanser modellerine kritik bir ihtiyaç vardır. Çalışmamız, invazyon ve hücresel mekansal dağılımları incelemek için kullanılabilecek iskele ve iskelesiz bir ortamda heteromultisellüler stromal-epitel oluşumunu sunmaktadır.

İstilayı Yönlendirmek İçin Epitelyal Kanser Hücrelerinin İskelesiz 3D Kültürlerinde Heteromultihücreli Stromal Hücreler

Keşfedin, dinamik mikroakışkan tabanlı 3D ortak kültür platformu kullanarak yumurtalık kanserinin peritoneal yayılımını nasıl modelleneceğini. Bu yöntem, kanser hücreleri ve mezotel hücreleri arasındaki iletişimi in vivo koşullarda incelemeyi sağlar.

Dinamik 3D Periton microdevice Modelleme Yumurtalık Kanseri Multisellüler Sfero Davranış

Daha fazla video keşfet