Egzersiz Koşullandırılmış Serum İle Ligament Yapılarının Tedavisi: Bir Translasyonel Doku Mühendisliği Modeli

Bu modelin genel amacı, egzersiz ve beslenmenin bağ dokusu sentezi ve fonksiyonu üzerindeki etkisini belirlemektir. Bu teknik, 3D dokuları tedavi etmek için egzersizden önce ve sonra alınan insan serumunu kullanır, böylece egzersizin bağların ve tendonların işlevini nasıl etkilediğini anlayabiliriz. 3D doku sağlama, iyi karakterize edilmiş in vitro testlerin faydalarını in vivo dokuların işlevi, morfolojisi ve biyokimyasal özellikleri ile birleştirir.

Silikon kaplı 35 milimetrelik plakaları metin protokolüne göre önceden hazırladıktan sonra, kalıplardaki her silindirik kuyunun ortasına bir adet minutyen pimi yerleştirerek ankraj kalıplarını hazırlayın. Beta trikalsiyum fosfat ve ortofosforik sitrik asit çözeltisini mililitre başına bir ila üç gram arasında buz üzerinde plastik bir tartı teknesinde birleştirin. Çimentoyu kuvvetlice karıştırmak için plastik bir hücre sıyırıcı kullanın.

Karıştırmaya devam etmek için çimentoyu ezin ve karışımı kalıplara pipetleyin, ardından doldurulmuş kalıbı beş dakika boyunca 2.250 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemenin ardından, fırçalı çimento ankrajlarının gece boyunca oda sıcaklığında ayarlanmasına izin verin. Ertesi sabah, ankrajları kalıptan çıkarın ve her silikon kaplı plakaya 12 milimetre aralıklarla iki ankraj sabitleyin.

Sabitlenmiş plakaları %70 etanol püskürterek, hem plakaları hem de kapakları doldurarak sterilize edin, ardından plakaları bir biyolojik güvenlik kabinine veya BSC'ye yerleştirin. En az 30 dakika sonra plakaları aspire edin ve BSC'de denemelerine izin verin. Kapakları değiştirin ve ihtiyaç duyulana kadar BSC'de saklayın.

Biyolojik olarak tehlikeli maddelerin uygun kullanımı ve imhası için yerel biyolojik tehlike düzenlemelerine uyun. Steriliteyi koruyun ve yapı oluşturma adımlarını bir biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirin. Birincil fibroblastları, reaktifleri ve silikon kaplı plakaları iğnelenmiş fırça ankrajları ile hazırladıktan sonra, metin protokolüne göre, hücreleri 15 santimetrelik plakalarda% 70 birleşmeye kadar kültürleyin.

Daha sonra, hücre süspansiyonu başına 681 mikrolitre, trombin yapısı başına 29 mikrolitre, aprotinin yapısı başına iki mikrolitre ve aminoheksanoik asit yapısı başına iki mikrolitre aşağıdakilerden oluşan bir ana karışım hazırlayın. Çözeltiyi iyice karıştırdıktan sonra, fırçalı çimento ankrajlarının etrafına sekiz şeklinde bir desende her bir sabitlenmiş plakaya 714 mikrolitre ekleyin ve ana karışımın ankrajların kenarlarına doğrudan temas etmesini sağlayın. Karışımı eşit şekilde dağıtmak için her bir plakaya hafifçe vurun.

En kritik adım, hücreye oturmuş fibrin jelinin oluşturulmasıdır. Hücre oturma ana karışımının ankrajlara doğrudan temas ettiğinden emin olun ve karışımı eşit şekilde dağıtmak için plakaya hafifçe vurun. Her seferinde bir tabak, plakanın üzerine eşit şekilde damla damla şeklinde 286 mikrolitre fibrinojen ekleyin.

Hücreye gömülü fibrin jellerini oluşturmak üzere fibrinojeni dağıtmak için plakayı hemen ileri geri ve yan yana kaydırın, ardından bir sonraki plakaya geçin. Yapıları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte tutulan steril bir inkübatöre yerleştirin ve fibrinojenin polimerizasyonuna izin vermek için en az 15 dakika inkübe edin. Büyüme ortamını 200 mikromol askorbik asit, 50 mikromol Prolene ve mililitre başına beş nanogram TGF beta 1 ile takviye ederek besleme ortamı başına iki mililitre hazırlayın.

Her bir yapıyı kaplamak için iki mililitre besleme ortamı kullanın ve yapıları, toplam 14 gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte tutulan steril bir inkübatörde veya istenen son noktaya kadar kültürleyin ve ortamı her iki mililitre besleme ortamı ile yenileyin. İnsan serumu toplamak için, metin protokolüne göre bir dinlenme kan örneği çizin, ardından katılımcılardan araştırma hedefinize uygun bir egzersiz modu gerçekleştirmelerini sağlayın. Burada 30 dakikalık bir yüksek yoğunluklu direnç egzersizi gösterilmektedir.

Egzersiz seansından 15 dakika sonra bir kan örneği alın, daha sonra kanın pıhtılaşmasına izin verdikten sonra, örneği 10 dakika boyunca 1.500 kez g'de döndürün. Steril koşullar altında, serum hazırlığı için serumu steril tüplere aktarın. Ligament yapılarının hazırlanmasını takiben, kuvvet dönüştürücüsüne bağlı ters kalıplanmış kulplara sahip bir PBS banyosunda bir çekme test cihazı kullanarak çekme testi yapın.

Bu, test sırasında fırçalı çimento ankrajlarını yerinde tutar. Dijital kumpasları kullanarak, bağ yapılarının uzunluğunu ve uzunluğunu belirleyin ve dokunun kesit alanını hesaplayın. Ligament yapısını plakadan sökün ve ankrajları ters kalıplanmış tutamaklara yerleştirin, yapının PBS'ye daldırıldığından emin olun, ardından yapının uzunluğunu ilk uzunluğuna ayarlayarak tutamaklar arasındaki mesafeyi ayarlayın.

Teste başlayın ve yapıyı saniyede 0,4 milimetre veya saniyede %3'lük bir gerinim hızında arızaya kadar zorlayın. Testin ardından, dokuyu işleyin ve metin protokolüne göre tasarlanmış ligamentlerin kollajen miktar tayinini gerçekleştirin. Kültürde bir ila iki gün sonra, ACL fibroblastları fibrin jeline bağlanmış, hücre süreçlerini uzatmış ve çekiş kuvvetleri uygulamaya başlamıştır.

İki ankraj noktası arasında gerilim oluşur ve hücreler bu eksene paralel olarak hizalanır ve kollajen biriktirmeye başlar. Burada, arızaya karşı test edilmiş bir bağ için temsili bir gerilme gerinim grafiği gösterilmektedir. Bu deneylerde, egzersiz öncesi ve sonrası kan örneklerinden insan serumu izole edildi ve egzersizin neden olduğu biyokimyasal ortamla zenginleştirilmiş ortam oluşturmak için FBS yerine kullanıldı.

Bu grafikte gösterildiği gibi, 14 günlük bir kültür periyodundan sonra ligament yapıları, egzersiz sonrası seruma yanıt olarak hem maksimum gerilme yükünde hem de kollajen içeriğinde önemli bir artış göstermiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, ligament yapıları iki gün boyunca yapılabilir ve iki hafta içinde gerilme testi, kollajen içeriği ölçümü ve diğer biyokimyasal analizler için hazır olacaktır. Bu translasyonel in vitro in vivo model, egzersizin bağların, tendonların ve aslında vücuttaki hemen hemen her dokunun işlevini nasıl geliştirdiğini anlamak için daha geniş bir misyonun parçasıdır.

Yani bu, egzersiz, beslenme, yükleme, her türlü büyüme faktörü, insanlarda veya hayvanlarda yapabileceğimiz her türlü farklı müdahale ile tedavileri takiben kollajen içeriğini ve bağ dokusu fonksiyonunu belirleyebileceğimiz gerçekten sağlam ve güçlü bir tekniktir.