Name: Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Öğrenin, doku lizatlarından yerel protein komplekslerini yakalamak ve analiz etmek için Multimer-PAGE yöntemini. Bu teknik, labil protein ilişkilerini stabilize ederek biyokimya araştırmalarında kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

NIH / NİDA DA034783 tarafından desteklenir. Biz multimeir-PAGE ile teknik yardım için Bryan A. Killinger teşekkür ederim.

1. Doku Hazırlanması <ol><li> 4x BN-PAGE numune tampon maddesi (200 mM Bis (2-hidroksietil) amino-tris (hidroksimetil) metan (Bis-Tris), 200 mM NaCI,% 40 a / h gliserol,% 0.004 Ponceau S, pH 7.2, 10 mL hazırlanması ). NOT: Bu stok solüsyon önceden yapılmış ve 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> 1x ticari proteaz inhibitörü kokteyli içeren 750 uL dH 2 O 4x numune tamponu 250 uL seyreltin. Girdap ve buz üzerinde soğuk. </li><li> Temiz bir Dounce homojenleştirici 30 vuruş 1 mL 1x buz soğukluğunda BN-PAGE numune tampon maddesi içinde, hedef doku, 20 mg homojenize edilir. NOT: Bu gösteri deneme için, hedef doku bütün sıçan beyni dokudur. Homojenleştirmeden sonra, numuneler çözünür ve zar proteinlerinin elektroforezi izin vermek üzere hafif bir deterjan gibi% 2 digitonin ile muamele edilebilir. </li><li> 30 dakika çözünmeyen hücre içeriği: pelet 14,000 x g&#39;de bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne Homojenat, ve santrifüj aktarın. AfteR santrifüj, buz üzerinde temiz bir tüp içine süpernatant süzün. </li><li> bisinkoninik asit (BCA) ya da benzer protein kantitatif analizi kullanılarak Üst faz, protein konsantrasyonunu ölçmek için üretici talimatları takip edin. </li><li> Homojenat örnek (ler) deterjan ihtiva ise,% 0.25 Coomassie için homojenat çözüm getirmek için yeterli bir sulu çözelti içinde% 5, Coomassie Mavi G-250, bir miktar ilave edin. </li></ol> 2. BN-PAGE <ol><li> 25 ml 20x mavi yerli seyreltin (BN) içine tampon stok (1.0 M Bis-Tris, 1.0 M Trişin, pH 6.8) elektroforez 475 ml dH 1x çalışan tampon 500 mL olmak üzere% 0.002 Coomassie Blue ihtiva eden 2 O. <ol><li> Numuneler deterjan ihtiva bunun yerine% 0.02 Coomassie içeren 1x çalışan tampon 250 mL ve hiçbiri içeren başka bir 250 mL olun. </li></ol></li><li> 4 ° C&#39;ye soğutma tamponu (ler). </li><li> Temizleyin ve üretici talimatlarına göre kaset dökme bir poliakrilamid jel toplayın. </li><li&gt; Bir standart tarif 7&#39;ye göre BN poliakrilamid jeli (% 3, T istifleme katman,% 6, T çözme tabakası) dökün ve iyi tarak. </li><li> Jeller polimerize sonra, DH 2 O ile kaseti yıkayın ve üretici talimatlarına göre elektroforez aygıtı monte edin. </li><li> Kuyucuklu bir tarak çıkarın ve 1x BN-PAGE çalışma tamponu ile kuyu doldurun. Numuneler yüklenene kadar tampon ile bütün iç odasının doldurulması kaçının. <ol><li> Numuneler deterjan ihtiva ise,% 0.02 Coomassie Blue içeren tampon ile kuyu doldurun. NOT: 4 ° C&#39;de adımları 2.7-2.9 gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Jel yükleme ipuçları kullanarak, arzu edilen kuyulara proteinin 20 ug içeren homojenat bir hacim pipetle. kullanılmayan herhangi bir kuyulara 1x BN-PAGE numune tampon maddesi eşdeğer bir hacmi Pipet. Not: eklemek için homojenat uygun hacmi hesaplamak için bir BCA aracıyla tespit protein konsantrasyonunu kullanmakuyu. </li><li> Örnekler yüklendikten sonra, 1 x BN-PAGE çalışma tamponu ile iç bölmeyi doldurmak. Jel tamamen tampon altında olduğundan emin olun. Daha sonra, üretici tarafından belirtilen seviyeye 1x çalışma tamponu ile dış oda doldurun. <ol><li> Numuneler deterjan ihtiva ise,% 0.02 Coomassie mavisi içeren 1 x tampon ve boya içermeyen 1x çalışan tamponu ile dış hücre iç bölmeyi doldurmak. </li></ol></li><li> güç kaynağına Elektrotlar ve boya bant katmanı çözme içine ~ 2 cm ilerler kadar 150 V&#39;de jelde proteinleri Electrophorese. Dur ve güç kaynağını kesin. </li></ol> 3. Çapraz bağlanma NOT: 4 ° C&#39;de Adımları 3.1-3.6&#39;da gerçekleştirin. <ol><li> elektroforez aygıtı sökün ve jel kasetinin cam levhaların ayrılması. Çıkarın ve yığma tabakasını atın. </li><li> Dikkatle boya ön alt kenarının altında jel kesti. almakBu kesim olarak yumuşak ve düz bir şekilde mümkün kılmak için bakım ve daha sonra jel kullanılmamış parça atılır. Bu homojenat, numunedeki tüm protein içerecektir geniş bir ~ 2 cm, poliakrilamid jel yatay şerit bırakacaktır. </li><li> Jel şeridin kenarları boyunca kullanılmamış herhangi bir kısmı Trim. </li><li> Dikkatli bir şekilde küçük bir kap içinde 10 ml fosfat tamponlu salin (PBS) içine şerit yerleştirin, yavaşça dengelenmeye 30 dakika nutation karıştırın. </li><li> Dengelemeden sonra, atmak ve başka bir 10 mL PBS ile değiştirin. Pipet 500 uL 25 mM DSP PBS içine dimetil sülfoksit içerisinde çözündürüldü ve 30 dakika boyunca, yukarıdaki (aşama 3.4) karıştırın. </li><li> DSP çözümü kapalı dökün. Reaksiyona girmemiş DSP gidermek için% 2 sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren 0.375 M tris (hidroksimetil) aminometan hidroklorür (tris-HCl), pH 8.8, 10 ml ekleyin. 15 dakika üğrüm devam edin. </li></ol> 4. SDS-PAGE <ol><li> Jel şerit söndürme iken, SDS-PA hazırlanmasıStandart yöntemler 9&#39;a göre GE jel çözeltileri. Polimerizasyon reaktif eklemeyin. </li><li> Söndürüldükten sonra, oda sıcaklığına kadar ΒΝ jel şeridi dönmek ve yeni bir jel kasetine şerit dökme. <ol><li> Bunu yapmak için, dikkatle jel alıp temiz bir jel kaset boşluk tabağa yerleştirin. </li><li> Orient boya ön alt yani BN-PAGE sırasında en uzak tarafında yeni bir kaset üstüne yakın gereken yeni kasetinin üst (en yakın olan ve şerit, jel şeridi, önceden gelen çevrilmiş olmalıdır oryantasyon). Şekil 3&#39;e bakınız. </li><li> Üst kenarı da kapak plakasının üst kenarı olacak burada ile yer alacağı şekilde şerit yerleştirin (yani, yeni bir jel üstünde olacaktır). boya ön cam levha yatay kenarlarına paralel olduğundan emin olun. </li><li> t yer bırakarak ara duvarların birine karşı kesilmiş şeridin bir yan itinjel o diğer tarafı dökülecek ve bir protein standardı veya merdiven yüklenmesine olanak sağlamaktadır. </li><li> Jel bandın alt kenarı bir tırtıklı veya alanlar varsa, dikkatli bir şekilde kesilmiş. Eğer mevcut ise, bunlar jel sırasında tuzak kabarcıklar dökme olacaktır. </li><li> Jel şerit doğru bir biçimde pozisyonlandığı zaman, ara plaka üzerinde kapak plakası yerleştirin. sıkışan hava kabarcıklarını dışarı itmek için hafif bir baskı uygulayın. </li><li> Üretici talimatlarına göre jel-dökme aygıtı monte devam edin. </li></ol></li><li> çözündürücü jel tamponuna polimerizasyon reaktifleri ekleyin ve serolojik bir pipet kullanarak hazırlanan jel kaset içine dökün. istif tabakası için oda bırakmak için, kesilmiş BN-PAGE jel şeridin altında yaklaşık 2 cm jel kaseti doldurun. </li><li> döküldü jel üst üzerinde 100 uL butanol ekleyin ve çözme tabakasının polimerizasyonu için 30 dakika izin verir. butonalün kapalı dökün. </li><li> Istifleme jeli çözeltisine polimerizasyon reaktifleri ekleyin. Bir serolog kullanmaik pipet, jel kasetinde kalan boş alanı doldurmak için istifleme tabaka dökülür. <ol><li> bu jel bir şeridin altında alanı doldurur ve hava kabarcıklarının değildir bu nedenle yığın tabaka dökülür gibi jel kaseti yatırın. </li><li> istifleme jeli tamponu jel şeridin altında boş alanı doldurur, giderek düzeyde bir taban üzerine jel kaseti döndürür. </li><li> yaklaşık taşmaları o kadar bir sonraki istifleme jeli tamponu ile kesilmiş jel şerit boş alanı doldurmak için devam edin. </li></ol></li><li> istifleme tabaka 30 dakika boyunca polimerize olmaya bırakın. Not: jel polimerize ise 10 x SDS-PAGE çalışma tamponu (250 mM tris (hidroksimetil) aminometan (tris), 1.9 M glisin,% 1 SDS) konur. Bu aynı zamanda önceden yapılmış ve oda sıcaklığında saklanabilir. </li><li> 1x çalışma tamponu yapmak için 450 ml dH 2 O içine 50 ml 10X SDS-PAGE çalışma tamponu stokunu. </li><li> istifleme tabaka polimerize sonra, dökme elde edilen jel kaseti çıkarmakcihaz, dH 2 O ile durulayın ve üretici talimatlarına göre elektroforez aygıtı monte edin. </li><li> Bundan sonra, imalatçı tarafından belirtilen seviyeye dış bölmeyi doldurmak, 1 x SDS-PAGE çalışma tamponu ile tamamen iç bölme doldurun. </li><li> Bir sonraki bir molekül ağırlığı merdiven ya da uygun protein standardı ile kesilmiş jel şeride yer yükleyin. </li><li> güç kaynağına elektrotları takın ve Coomassie boyası jel kapalı çalışır zaman 120 V&#39;ta örnekleri Electrophorese, dur ve güç kaynağı ayırın. </li><li> 10 bağlayıcı antikor tarafından elektrobeneklenme ile ve protein saptaması standart yöntemler kullanılarak jel analiz edin. </li></ol>

<ol><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+as+a+collection+of+protein+machines%3A+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li>
<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).</li>
<li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%3A+methods+for+detection+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions: methods for detection and analysis.</a> Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).</li>
<li>Ho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+protein+complexes+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry.</a> Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Beisiegel, U. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/elps.1150070102/abstract">Protein Blotting.</a> Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).</li>
<li>Killinger, B. A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+alpha-Synuclein+Multimer+Stoichiometry+in+Complex+Biological+Samples+by+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis.</a> Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).</li>
<li>Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein.</a> PLoS One. 8 (11), e81314(2013).</li>
<li>Wong, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWong%2C+SS+%22Chemistry+of+protein+conjugation+and+cross-linking%22">Chemistry of protein conjugation and cross-linking</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1991).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+membrane+proteins+in+detergent+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characterization of membrane proteins in detergent solutions.</a> Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).</li>
<li>Peters, K., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking%3A+reagents+and+problems+in+studies+of+membrane+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure.</a> Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).</li>
<li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+of+extended+biological+structures%3A+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+%5B35S%5Ddithiobis%28succinimidyl+propionate%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate).</a> J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).</li>
<li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+mitochondrial+respiratory+membrane+protein+complex+II%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II.</a> Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Protein-protein etkileşimleri canlılar yürütmek her görev için önemlidir. Bu nedenle, bunlar yoğun inceleme ve araştırma konusudur. Multimer-PAGE yakalama ayrılması ve protein kompleksleri çok çeşitli analiz etmek için bir yeni yöntemdir. Daha önce hastalıkla bağlantılı protein α-sinüklein 11 oligimerization okuyan uygulanabilirliğini ortaya koymuştur. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi Bununla birlikte, pek çok protein kompleksleri için uzatılabilir. protein kompleksleri okuyan di...

<html> Normal hücre fonksiyonlarını protein-protein etkileşimleri, 1, 2 bağlıdır. Bunun bir sonucu olarak, insan hastalıkları genellikle çeşitli protein kompleksleri 3 montajı ve davranış düzensizlik tarafından işaretlenir. Böyle etkileşimleri karakterize yeteneği dolayısıyla çok önemlidir. Bu etkileşimlerin tespit Mevcut araçları genellikle etkileşim ortakları çekme-aşağı ve ardından hedef proteinler, saflaştırılmasını gerektirir. Geleneksel saflaştırma diferansiyel santrifüj, çökeltme ve / veya kromatografi 4 ile gerçekleştirilir. Bu yöntemler zaman alıcıdır, her bir hedef protein için değiştirilmesi gerekir, ve genellikle düşük verimlerle sonuçlanabilir. Modern saflaştırma yöntemleri, bir yakalama molekülü 5 bağlanmış boncuklarıyla yüklenmiş sütunlar üzerinde bağışıklık çökeltmesi ya da ekstre proteinleri hedef peptid etiketleri kaynaşmasını içerenBu, bir çok proteinin şekilde uzatılabilir da &quot;&gt; 6., Potansiyel olarak her zamanki bağlanma partnerleri için afinite açısından farklılık yapılarda ortaya çıkan hedef sekansı, bir modifikasyonunu gerektirir. Bazı protein-protein etkileşimleri, hassas doğası, bu yöntem uygulanabilir olmayabilir demektir birçok senaryolara. Ayrıca, protein-protein etkileşimleri eşleştirmek için kullanılan açılan tahliller nedeniyle özgürlük ve yem proteinin yerli olmayan seviyelerinin kısıtlı derecelerde, doğru bir hücresel resim toplayamaz. İdeal olarak, protein kompleksleri saflaştırma veya çekme aşağı gerek kalmadan, doğal hallerine tespit edilebilir. Mavi doğal poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE), sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) için daha az denatüre alternatif olarak geliştirilen ve biyolojik örnekler 7 bazı proteinler ve komplekslerin ayrılması için izin veriliyordu. Bununla birlikte, BN-PAGE&#39;de proteinler lar göre ayırmakdiğer moleküllerle boyut, yük ve üç boyutlu yapı ve birlikte dahil olmak üzere değişkenlerin ge sayısı. Bu faktörlerin etkileşimler genellikle proteinlerin eş ayrılması, agregat oluşumu ve kötü protein bandı çözünürlüğü ile sonuçlanır. İki boyutlu yerli-poliakrilamid jel elektroforezi bu sorunların 8, hepsi bir giderir, ama. Doğal ayrılması ile ortaya çıkan komplikasyonları aşmak için, bazı yazarlar, doku lysate&#39;lerin 4 protein kompleksleri yakalamak için bu ditiyobis (süksinimidil propionat) gibi amin-reaktif çapraz bağlama reaktifleri, (DSP) kullanır. Bu muamele edilmiş Lizatlar daha sonra denatüre edilmiş ve protein kompleksleri doğal boyutu ve makyaj korurken, SDS-PAGE ile ayrılabilir. çapraz bağlama reaktifleri, doku lizatlarında başka bir molekülün yakınlığı ve proteinlere dayalı tepki Bununla birlikte, çok serbestlik derecelerine sahip ve stokastik, spesifik olmayan arka plan çapraz etkileşim-linking özellikle konsantre örneklerinde, yüksek olabilir. Bu zor-yorumlama sonuçlara yol açabilir. Burada, bir hibrid BN-PAGE / SDS-PAGE yöntemiyle kullanımını gösteren, ayrı ve kompleks karışımlar protein derlemeleri tespit etmek için, multimeri-poliakrilamid jel elektroforezi (multimer-PAGE) olarak adlandırılır. Başlangıçta, hücre lizatı, BN-PAGE ile poliakrilamid jel içinde süspansiyon haline getirilir. lizat içeren Jel daha sonra çapraz bağlama reaktifi DSP ile reaksiyona sokulur. Sözde hareketsiz ve biraz jeli üzerinde ayrıldı, proteinler arka çapraz bağlayıcı tepkime azalır, yani daha az spesifik olmayan bir tepki muhtemeldir. Çapraz bağlanma sonrası, jel, bantlar kesilir ve SDS-PAGE ile ayrılmıştır. Elde edilen jel daha sonra, tipik olarak poliakrilamid jel elektroforezi ile ilişkili herhangi bir yolla analiz edilebilir. Bu yöntem, ilave saflaştırma veya çekme Dow gerek kalmadan, modifiye edilmemiş doku lizatındaki doğal protein komplekslerinin ayrıştırılması ve algılanması amacıyla sağlarn.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Kimyasallar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ve epsilon; -Aminokaproik asit</td><td>Sigma</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid</td><td>Akros Organikler</td><td>164855000</td><td>Toksik.</td></tr><tr><td>Akrilamid / bisakrilamid 37.5: 1 (% 40 T stok çözeltisi)</td> <td>BioRad</td><td>161-0148</td><td>Toksik.</td></tr><tr><td>Amonyum persülfat</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr>Keçi <td>Santa Cruz'dan</td><td>anti tavşan IgG-HRP</td><td>Biyoteknoloji sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Bikinkoninik asit test kiti</td><td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris</td><td>Sigma</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Bütanol</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>A399-1</td><td></td></tr><tr><td>Kemilüminesans substrat kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>24078</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie mavisi G-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Toksik.</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>Ditiobis (süksinimidilpropiyonat)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>22585</td><td></td></tr><tr><td>Kuru yağsız süt</td><td>LabScientific</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Halt Proteaz İnhibitörü Kokteyli</td><td>Thermofisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td>Titrasyon için. Kostik.</td></tr><tr><td>PVDF</td> membran aktivasyonu için metanol <td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>. Zehirli.</td></tr><tr>Tavşan <td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-7011-R</td><td></td>N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamin Sigma T9281<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>N, N'-metilenbisakrilamid</td><td>Acros Organics</td><td>16479</td><td>Toksik'ten</td></tr> monoklonal anti alfa; -sinüklein IgG.<tr><td>NP40</td><td>Boston Biyoürünleri</td><td>P-872</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbat 20 (ara-20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Poliviniliden florür transfer membranları</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Thermo Scientific</td><td>88265</td><td></td></tr><tr><td>SDS çözeltisi (%10 a/h)</td><td>BioRad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Sigma</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (0,5 M tampon, pH 6,8)</td><td>BioRad</td><td>161-0799</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1,5 M tampon, pH 8,8)</td><td>BioRad</td><td>161-0798</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td> Katalog Numarası</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE Imagequant LAS 4000</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9558-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ yazılımı</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 mikroplaka okuyucu</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jel Şekillendirici + Stand</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrofüj 22R santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL dounce homojenizatör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik doku homojenizatör</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120220</td><td></td></tr></tbody></table>

multimer-page: biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

arındırıcı ve tek proteinler ve peptidler çalışmak için pek iyi gelişmiş yöntemler vardır. Bununla birlikte, en çok hücresel işlev, sıklıkla, kovalent olmayan ve kolay bir saflaştırma teknikleri ile bozulmuş olan bir bağlanma araştırılması için zor olan etkileşimli protein komplekslerinin ağlar tarafından gerçekleştirilmektedir. Bu çalışma, stabilize edici ve iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez ile modifiye edilmemiş dokusundan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem tarif eder. Doku lisatı, protein jel içine kısa bir mesafede yer değiştirmektedir kadar sonra bir elektrik akımı uygulandığında, bir denatüre edici olmayan mavi doğal poliakrilamid jel üzerine yüklenir. Taşınan protein ihtiva eden jel şeridi daha sonra kesilmiş ve kovalent protein kompleksleri stabilize amin reaktif çapraz bağlama reaktifi ditiobis (sukinimidil propionat) ile inkübe edilir. çapraz bağlı kompleksler ihtiva eden jel şeridi daha sonra bir sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel içine dökülür, ve t,O kompleksleri tamamen ayrılır. yöntem ucuz ve öğrenmesi kolay, yani teknikleri ve en moleküler biyologlar için tanıdık malzemelere dayanır. yeterince aşırı büyük kompleksleri ayırmak için yeteneği sınırlıdır ve evrensel başarılı olmamıştır da, yöntem iyi çalışılmış komplekslerinin çeşitli yakalamak başardı ve ilgi birçok sistemde muhtemelen geçerlidir.

Bu gösteri deneyinde, multimeir-PAGE bütün sıçan beyni lizatının gerçekleştirildi. Elde edilen ayrılan proteinler poliviniliden diflouride (PVDF) membran üzerinde lekelenir ve sonra kompleksler oluşturmak üzere bilinen proteinlere karşı antikorlar ile problanmıştır. Şekil 1, iki ile protokolünün bir doğrulama gösterir. İlk olarak, çapraz bağlanmış proteinler, çapraz bağlama reaktifi ile oluşturulmaktadır gözlenen daha yüksek molekül ağırlıklı türlerin, yani bir indirgeyi...

stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Bu protokolün genel amacı, araştırmacıların doku lizatlarından ekstrakte edilen doğal protein komplekslerini poliakrilamid jel elektroforezi kullanarak yakalamalarını, ayırmalarını ve analiz etmelerini sağlamaktır. Bu yöntem, normalde labil olan protein etkileşimlerini doğal koşullara yakın şartlarda stabilize edebildiği için proteinler üzerine çalışan araştırmacılara yardımcı olabilir ve bu komplekslerin tanımlanmasına ve ardından analiz edilmesine olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, yaygın biyolojik yöntemler kullanması nedeniyle geniş bir uygulama alanına sahip olması ve bireysel araştırmacının hedeflerine göre uyarlanabilmesidir.Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde açıklandığı şekilde mavi doğal poliakrilamid jel elektroforezi için hazırlık yapın. Elektrotları güç kaynağına bağlayın ve boya bandı ayırma tabakasında yaklaşık iki santimetre ilerleyene kadar jeldeki proteinleri 150 volt ile elektroforezleyin. Bu noktada işlemi durdurun ve güç kaynağının bağlantısını kesin.Elektroforez düzeneğini söktükten sonra, jel kasetinin cam plakalarını ayırın. İstifleme tabakasını çıkarın ve atın. Boya cephesinin alt kenarisinin hemen altından, kesimi mümkün olduğunca düz ve

multimer-page-method-for-capturing-resolving-protein-complexes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Hücre geçirgen çapraz bağlayıcı DSP [dithiobis-(succinimidyl propiyonat)] stabilize geçici ve labil...

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

Bu video, mavi yerli poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE) multiprotein kompleksler (MPCs) karakterizasyonu açıklar. Birinci boyut, diyaliz hücresel lizatları bireysel MPCs tanımlamak için BN-PAGE ile ayrılır. Ikinci bir boyut SDS-PAGE, faiz MPCs daha immün bileşenleri analiz alt gruba ayrılır.

Hücresel lizatları Multiprotein Kompleksleri Analizi Mavi Native Poliakrilamid Jel Elektroforez (BN-PAGE)

Bu videoda, doğal protein komplekslerini doku homojenatlarından ayırmak için multimerik PAGE açıklanmaktadır. Teknik, mavi yerel PAGE ve SDS-PAGE tekniklerinin bir karışımıdır. Ayrılan kompleksler, hücre işleyişindeki rolleri için karakterize edilebilir ve incelenebilir.

Doğal protein komplekslerini ayırmak için Multimer-PAGE: bozulmamış multimerik proteinleri doku lizatından ayırmak için Blue Native-PAGE ve SDS-PAGE'den oluşan hibrit bir ayırma tekniği

Protein kompleksleri önemli hücre fonksiyonlarını katalize eder. Birçok temel komplekslerinin detaylı fonksiyonel ve yapısal karakterizasyonu rekombinant üretimi gerektirir. MultiBac özellikle ökaryotik protein ve kompleksleri ifade etmek için özel bir bakülovirüs / böcek hücre sistemidir. MultiBac açık erişim platformu ve faydayı maksimize için geliştirilmiş standart çalışma prosedürleri olarak uygulanmıştır.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Protein kompleksleri onların fonksiyonu için temel bir mimaridir. Çeşitli kitle spektrometrik teknikleri birleştirerek kendi derleme çalışması için güçlü olduğunu kanıtladı. Biz kimyasal cross-linking ve yerel kütle spektrometresi protokolleri sağlamak ve nasıl çoklu alt birim protein derlemeler mimarisini aydınlatmak için tamamlayıcı bu teknikleri yardımcı göstermek.

Kimyasal Cross-linking ve çoklu alt birim Protein derlemeler mimarlık okumak için olduğu gibi Protein kompleksleri kütle spektrometresi birleştirme

Bu el yazması Bimolecular uluslara benzeşme arıtma (BiCAP) protokolünü açıklar. BM complexed bireysel proteinler hem de konut projeleri hariç rakip bağlama ortaklarıyla oluşan iken bu roman yöntemi belirli yalıtım ve aşağı akım proteomik karakterizasyonu herhangi bir iki etkileşen proteinlerin kolaylaştırır.

Bimolecular tamamlayıcı benzeşme arıtma (BiCAP) tarafından parçalanmış çok protein sinyal kompleksleri

Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Yüksek çözünürlüklü complexome profilleme için mikrotom kullanan çok yönlü bir kriyoliking BN-MS protokolü sunulur.

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Öğrenin, doku lizatlarından yerel protein komplekslerini yakalamak ve analiz etmek için Multimer-PAGE yöntemini. Bu teknik, labil protein ilişkilerini stabilize ederek biyokimya araştırmalarında kullanılabilir.

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

Daha fazla video keşfet