Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri
5 Mayıs 2017
stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.
Bu protokolün genel amacı, araştırmacıların poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak doku lizatlarından ekstrakte edilen doğal protein komplekslerini yakalamalarını, ayırmalarını ve analiz etmelerini sağlamaktır. Bu yöntem, proteinleri inceleyen araştırmacılara yardımcı olabilir, çünkü aksi takdirde kararsız protein ilişkilerini doğal koşullar altında stabilize edebilir, bunların tanımlanmasına ve sonraki analizlerine izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, yaygın biyolojik yöntemler kullanmasıdır, bu nedenle yaygın olarak uygulanabilir olması ve bireysel araştırmacının hedeflerine göre uyarlanabilmesidir.
Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi mavi doğal poliakrilamid jel elektroforezi için hazırlanın. Elektrotları güç kaynağına bağlayın ve jel içindeki proteinleri 150 voltta, boya bandı çözme tabakasına yaklaşık iki santimetre ilerleyene kadar elektroforez. Bu noktada, güç kaynağını durdurun ve bağlantısını kesin.
Elektroforez aparatını söktükten sonra jel kasetinin cam panellerini ayırın. İstifleme katmanını çıkarın ve atın. Jeli, boya ön kısmının alt kenarının hemen altından dikkatlice kesin ve bu kesimin mümkün olduğunca pürüzsüz ve düz olmasına özen gösterin.
Ardından, kullanılmayan jel parçasını atın. Jel şeridin kenarları boyunca kullanılmayan kısımları kesin. Şeridi dikkatlice küçük bir kapta 10 mililitre fosfat tamponlu tuzlu su içine yerleştirin ve dengelemek için 30 dakika boyunca notasyonla hafifçe karıştırın.
Dengelemeden sonra, PBS'yi atın ve başka bir 10 mililitre ile değiştirin. Dimetil sülfoksit içinde çözülmüş 500 mikrolitre 25 milimolar DSP'yi PBS'ye pipetleyin ve 30 dakika boyunca daha önce olduğu gibi karıştırmaya devam edin. 30 dakika sonra DSP çözeltisini dökün.
10 mililitre 0.375 molar HSCL'de, pH 8.8, reaksiyona girmemiş DSP'yi söndürmek için% 2 sodyum dodesil sülfat içerir. Notasyona 15 dakika devam edin. Jel şeridi su verirken, SDS-PAGE jel solüsyonlarını standart yöntemlere göre hazırlayın.
Polimerizasyon reaktiflerini eklemeyin. Su verme işleminden sonra, mavi doğal jel şeridi oda sıcaklığına geri getirin ve şeridi yeni bir jel kasete atın. Bunu yapmak için, jeli dikkatlice alın ve temiz bir jel kaset ara plakasına yerleştirin.
Şeridi, önceki yönünden ters çevrilecek ve boya ön kısmının alt kısmı yeni kasetin üst kısmına en yakın olacak şekilde yönlendirin. Şeridi, üst kenarı, kapak plakasının üst kenarının olacağı yerle aynı hizada olacak şekilde yerleştirin. Boya ön yüzünün cam plakanın yatay kenarlarına paralel olduğundan emin olun.
Eksize edilen şeridin bir tarafını ara duvarlardan birine doğru itin, diğer tarafta jelin dökülmesi ve bir protein standardı veya merdivenin yüklenmesi için yer bırakın. Jel şeridin alt kenarında pürüzlü veya pürüzlü alanlar varsa, bunları dikkatlice kesin. Jel şerit doğru şekilde yerleştirildikten sonra, kapak plakasını ara plakanın üzerine yerleştirin.
Sıkışan hava kabarcıklarını dışarı itmek için hafif baskı uygulayın. Jel dökme aparatını üreticinin talimatlarına göre monte etmeye devam edin. Jel şerit bazen üst plaka yerleştirilirken kayar.
Şeridin üst plakanın kenarından biraz sarkmasına yardımcı olur, böylece herhangi bir kaymayı düzeltmek için bir spatula ile ayarlanabilir. Polimerizasyon reaktiflerini çözünen jel tamponuna ekleyin ve serolojik bir pipet kullanarak hazırlanan jel kasetine dökün. İstifleme tabakasına yer bırakmak için jel kasetini, eksize edilen mavi yerel PAGE jel şeridinin yaklaşık iki santimetre altına kadar doldurun.
Daha sonra, dökülen jelin üzerine 100 mikrolitre bütanol ekleyin ve bütanolü dökmeden önce çözünen tabakanın polimerizasyonu için 30 dakika bekleyin. Daha sonra, polimerizasyon reaktiflerini istifleme jeli çözeltisine ekleyin. Serolojik bir pipet kullanarak, jel kasetinde kalan tüm boş alanı doldurmak için istifleme katmanını dökün.
İstifleme tabakası dökülürken jel kasetini, jel şeridinin altındaki boşluğu dolduracak ve hava kabarcıkları sıkışmayacak şekilde eğin. İstifleme jeli tamponu jel şeridin altındaki boş alanı doldururken, jel kasetini kademeli olarak düz bir zemine getirin. Eksize edilen jel şeridin yanındaki boş alanı, neredeyse taşana kadar istifleme jeli tamponu ile doldurmaya devam edin.
Ardından, istifleme tabakasının 30 dakika polimerize olmasına izin verin. İstifleme tabakası polimerize olduktan sonra, jel kasetini dökme aparatından çıkarın, damıtılmış su ile durulayın ve elektroforez aparatını üreticinin talimatlarına göre monte edin. İç hazneyi 1x SDS-PAGE çalışma arabelleği ile tamamen doldurun.
Ardından, dış hazneyi üretici tarafından belirtilen seviyeye kadar doldurun. Eksize edilen jel şeridinin yanındaki boşluğu bir moleküler ağırlık merdiveni veya uygun protein standardı ile yükleyin. Elektrotları güç kaynağına takın ve numuneleri 120 voltta elektroforez edin.
Coomassie boyası jelden aktığında, çalışmayı durdurun ve güç kaynağının bağlantısını kesin. Standart elektroblotlama ve antikor bazlı protein tespiti yöntemlerini kullanarak jeli analiz edin. Multimer-PAGE'in validasyonu burada immünoblot aracılığıyla gösterilmektedir.
Yakalanan kinesin kompleksi, diphyo-3-itol ile bölünür, bu da yüksek moleküler ağırlıklı agregatların daha küçük ikame edicilerin çapraz bağlanmasıyla oluşturulduğunu gösterir. Burada tasvir edilmiştir, artan SDS veya Triton konsantrasyonları ile tedavi edilen beyin lizatları, çözünür oligomer tetromerinin tespitini azaltırken monomerik alfa-sinüklein tespitini arttırmıştır. Burada, sıçan beyin lizatındaki çözünür kompleksleri yakalamak için kullanılan multimer-PAGE'in temsili sonuçları gösterilmektedir.
Proteinler immünoblot yoluyla tespit edildi. Her proteinin beklenen monomerik ağırlığı, şeritlerin altında gösterilmiştir. Benzer şekilde, zara bağlı komplekslerin yakalanması burada gösterilmiştir.
Multimer-PAGE, SDHA solunum kompleksi iki lekesinde gösterildiği gibi, bazen bir kompleksi yakalayamaz. Bunun için olası açıklamaların bir tartışması metin protokolünde bulunabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa yaklaşık sekiz saat içinde yapılabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, doğal protein komplekslerinin jel içi çapraz bağlanmasının ardından jelin yeniden dökümünün ve ikincil SDS-PAGE ile ayrılmasının nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Akrilamid ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve jeli dökerken kişisel koruyucu ekipman giyilmesi gerektiğini unutmayın. Bu prosedürü takiben, ayrılan stabilize kompleksler jelden ayrıştırılabilir veya kesilebilir ve araştırmacının ihtiyaçlarına bağlı olarak immünodetection veya kütle spektrometresi dahil olmak üzere birçok yolla analiz edilebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, doku lizatlarından nativ protein komplekslerini stabilize etmek ve ayırmak için yeni bir iki boyutlu poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) sistemi kullanan bir yöntem sunar. Bu, neredeyse nativ koşullar altında protein ilişkilerinin analizini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Proteomik
- Elektroforez
Arka Plan
- Protein komplekslerini anlamak, birçok biyolojik çalışma için kritiktir.
- Nativ protein ilişkileri kararsız olabilir ve analiz edilmesi zordur.
- Yaygın biyolojik yöntemler bu tekniğin uygulanmasını kolaylaştırır.
- Bu yöntem, protein analizi için özelleştirilmiş yaklaşımlar sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Doku lizatlarından nativ protein komplekslerini yakalamak ve analiz etmek.
- Protein ilişkilerini daha iyi tanımlamak için stabilize etmek.
- Araştırmacılar için yaygın bir uygulama yöntemi sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Mavi nativ poliakrilamid jel elektroforezi için hazırlık.
- 150 volt'ta proteinlerin elektroforezi.
- Jelde boya bandının ilerlemesinin izlenmesi.
- Amin reaktif protein çapraz bağlayıcısının kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Nativ protein komplekslerinin başarılı bir şekilde stabilize edilmesi.
- Doku lizatlarında proteinlerin etkili ayrılması.
- Neredeyse nativ koşullar altında protein ilişkilerinin tanımlanması.
Sonuçlar
- Bu yöntem, protein komplekslerinin analizinin geliştirilmesini sağlar.
- Çeşitli araştırma hedeflerine uyarlanabilir.
- Yaygın yöntemlerin kullanılması, araştırmacılar için erişilebilirliği artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Multimer-PAGE enables biopharma R&D teams to stabilize and resolve native protein complexes from tissue lysates under near-native conditions, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By preserving labile protein associations that are often lost in conventional purification, the method improves predictive confidence in pathway analysis and complex-based drug target identification. This approach enhances translational continuity from discovery through preclinical evaluation by providing reproducible, quantitative readouts of complex formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing native protein interactions without perturbing non-covalent bindings.
- Operational Value: Uses accessible blue-native and SDS-PAGE techniques familiar to most molecular biology teams, reducing specialized training needs.
- Predictive Value: Supports functional target validation by stabilizing complexes for downstream identification via immunoblot or mass spectrometry.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates resolved complex profiles that can serve as quantitative biomarkers for assay standardization across screening campaigns.
- Operational Value: Relies on inexpensive, widely available reagents and equipment, enabling scalable implementation in core facilities.
- Assay Readiness: Produces SDS-PAGE-separated complexes compatible with downstream detection methods like immunodetection, supporting high-content screening integration.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by preserving complex integrity for validation in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of complex formation under varying conditions (e.g., detergent or SDS exposure), informing target robustness.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on complex stability and abundance, reducing late-stage attrition due to mechanistic uncertainty.
Pipeline & Workflow Integration
Multimer-PAGE fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, providing a mechanistic bridge to preclinical validation by enabling analysis of native protein complexes in tissue-derived samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by capturing endogenous complexes from unmodified tissue lysates.
- Screening: Enables assay development through reproducible complex separation and detection, facilitating compound effect evaluation on target engagement.
- Analytics: Delivers quantitative separation of protein complexes via secondary SDS-PAGE, allowing comparison of conditions or treatments.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining complex stability for validation in disease models, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability rather than a single-use assay, adaptable across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein interaction networks.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through standardized gel-based workflows and familiar electrophoresis techniques.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets, minimizing investment in poorly validated mechanisms.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of complex formation and stability in native contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native PAGE and SDS-PAGE techniques, including gel casting and electrophoretic separation.
- Depends on access to electrophoresis apparatus, power supplies, and standard reagents such as DSP crosslinker and SDS.
- Necessitates cross-team standardization for consistent complex capture and detection across discovery and preclinical groups.
- Involves adaptation considerations for different tissue types and complex sizes, as separation efficiency may vary with molecular weight.
- Limited by challenges in resolving extremely large complexes and potential variability in crosslinking efficiency, as noted in source material.
