Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri
5 Mayıs 2017
stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.
Bu protokolün genel amacı, araştırmacıların doku lizatlarından ekstrakte edilen doğal protein komplekslerini poliakrilamid jel elektroforezi kullanarak yakalamalarını, ayırmalarını ve analiz etmelerini sağlamaktır. Bu yöntem, normalde labil olan protein etkileşimlerini doğal koşullara yakın şartlarda stabilize edebildiği için proteinler üzerine çalışan araştırmacılara yardımcı olabilir ve bu komplekslerin tanımlanmasına ve ardından analiz edilmesine olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, yaygın biyolojik yöntemler kullanması nedeniyle geniş bir uygulama alanına sahip olması ve bireysel araştırmacının hedeflerine göre uyarlanabilmesidir.
Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde açıklandığı şekilde mavi doğal poliakrilamid jel elektroforezi için hazırlık yapın. Elektrotları güç kaynağına bağlayın ve boya bandı ayırma tabakasında yaklaşık iki santimetre ilerleyene kadar jeldeki proteinleri 150 volt ile elektroforezleyin. Bu noktada işlemi durdurun ve güç kaynağının bağlantısını kesin.
Elektroforez düzeneğini söktükten sonra, jel kasetinin cam plakalarını ayırın. İstifleme tabakasını çıkarın ve atın. Boya cephesinin alt kenarisinin hemen altından, kesimi mümkün olduğunca düz ve pürüzsüz yapmaya özen göstererek jeli dikkatlice kesin.
Ardından, jelden kalan kullanılmayan parçayı atın. Jel şeridinin kenarlarındaki tüm kullanılmayan kısımları kesin. Şeridi, küçük bir kap içindeki 10 milliliters fosfat tamponlu saline dikkatlice yerleştirin ve dengelemek için 30 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak karıştırın.
Dengeleme işleminden sonra, PBS'yi boşaltın ve yerine 10 mililitre taze PBS ekleyin. Dimetil sülfoksitte çözülmüş 25 milimolar DSP'den 500 mikrolitre PBS içine pipetleyin ve daha önce olduğu gibi 30 dakika boyunca karıştırmaya devam edin. 30 dakika sonra, DSP çözeltisini dökün.
Tepkimeye girmemiş DSP'yi söndürmek için %2 sodyum dodesil sülfat içeren 10 mililitre 0,375 molar HSCL, pH 8,8 ekleyin. İşleme 15 dakika boyunca devam edin. Jel şerit söndürülürken, SDS-PAGE jel solüsyonlarını standart yöntemlere göre hazırlayın.
Polimerizasyon reaktiflerini eklemeyin. Söndürme işleminden sonra, mavi doğal jel şeridini oda sıcaklığına getirin ve şeridi yeni bir jel kasetine dökün. Bunu yapmak için jeli dikkatlice alın ve temiz bir jel kaseti ara plakası üzerine yerleştirin.
Şeridi, önceki yöneliminin tersine dönecek ve boya cephesinin alt kısmı yeni kasetin üst kısmına en yakın olacak şekilde yönlendirin. Şeridi, üst kenarı örtü plakasının üst kenarının geleceği hiza ile aynı seviyeye gelecek şekilde yerleştirin. Boya cephesinin cam plakanın yatay kenarlarına paralel olduğundan emin olun.
Kesilen şeridin bir yanını ara parçanın duvarlarından birine yaslayın; diğer tarafta jel dökümü ve protein standartı veya marker yüklemesi için boşluk bırakın. Jel şeridinin alt kenarında pürüzlü veya düzensiz alanlar varsa, bunları dikkatlice kesin. Jel şeridi doğru şekilde konumlandırıldıktan sonra, kapak plakasını ara parça plakasının üzerine yerleştirin.
Hapsolmuş hava kabarcıklarını dışarı itmek için hafifçe baskı uygulayın. Jel dökme düzeneğini üretici talimatlarına göre kurmaya devam edin. Üst plaka yerleştirilirken jel şeridi bazen kayabilir.
Herhangi bir kaymayı düzeltmek için spatula ile ayarlanabilmesi adına, şeridin üst plakanın kenarından biraz sarkması faydalı olur. Polimerizasyon reaktiflerini ayırıcı jel tamponuna ekleyin ve serolojik bir pipet kullanarak hazırlanan jel kasetine dökün. İstifleme tabakasına yer kalması için jel kasetini, kesilmiş blue native PAGE jel şeridinin yaklaşık iki santimetre altına kadar doldurun.
Ardından, dökülen jelin üzerine 100 µL butanol ekleyin ve butanolü boşaltmadan önce ayırıcı tabakanın polimerizasyonu için 30 dakika bekleyin. Sonrasında, polimerizasyon reaktiflerini yığma jeli çözeltisine ekleyin. Bir serolojik pipet kullanarak, jel kasetindeki tüm kalan boş alanları dolduracak şekilde yığma tabakasını dökün.
Yığınlama katmanı dökülürken, jel şeridinin altındaki boşluğun dolması ve hava kabarcıklarının hapsolmaması için jel kasetini eğik tutun. Yığınlama jeli tamponu jel şeridinin altındaki boşluğu doldurdukça, jel kasetini kademeli olarak düz konuma getirin. Kesilmiş jel şeridinin yanındaki boşluğu, neredeyse taşana kadar yığınlama jeli tamponu ile doldurmaya devam edin.
Ardından, yığma tabakasının 30 dakika boyunca polimerleşmesini bekleyin. Yığma tabakası polimerleştikten sonra, jel kasetini dökme aparatından çıkarın, distile su ile durulayın ve elektroforez aparatını üretici talimatlarına göre monte edin. İç hazneyi tamamen 1x SDS-PAGE çalışma tamponu ile doldurun.
Ardından, dış hazneyi üretici tarafından belirtilen seviyeye kadar doldurun. Kesilmiş jel şeridinin yanındaki boşluğu bir moleküler ağırlık marker'ı veya uygun protein standardı ile yükleyin. Elektrotları güç kaynağına bağlayın ve örnekleri 120 volt değerinde elektroforezleyin.
Coomassie boyası jelden dışarı çıktığında, çalışmayı durdurun ve güç kaynağının bağlantısını kesin. Jeli, standart elektroblotting ve antikor tabanlı protein tespit yöntemlerini kullanarak analiz edin. Multimer-PAGE'in doğrulanması burada immunoblot aracılığıyla gösterilmiştir.
Yakalanan kinesin kompleksi diphyo-3-itol ile parçalanarak, yüksek moleküler ağırlıklı agregatların daha küçük substituentlerin çapraz bağlanmasıyla oluştuğunu göstermektedir. Burada gösterildiği üzere, artan SDS veya Triton konsantrasyonları ile işlem gören beyin lizatları, çözünür oligomer tetramerinin tespitini azaltırken monomerik alfa-sinükleinin tespitini artırmıştır. Burada, sıçan beyin lizatındaki çözünür kompleksleri yakalamak için kullanılan multimer-PAGE'in temsili sonuçları gösterilmektedir.
Proteinler immunoblot aracılığıyla tespit edildi. Her bir proteinin beklenen monomerik ağırlığı şeritlerin altında gösterilmiştir. Benzer şekilde, membrana bağlı komplekslerin yakalanması burada gösterilmiştir.
SDHA solunum kompleksi iki blotunda gösterildiği üzere, Multimer-PAGE bazen bir kompleksi yakalamada başarısız olabilir. Bunun olası açıklamalarına ilişkin bir tartışma metin protokolünde bulunabilir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde yaklaşık sekiz saatte tamamlanabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, doğal protein komplekslerinin jel içi çapraz bağlanmasının gerçekleştirilmesi, ardından jelin yeniden dökülmesi ve ikincil SDS-PAGE ile ayrıştırılması süreçlerini iyi bir şekilde kavramış olmalısınız. Akrilamid ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve jel dökümü sırasında kişisel koruyucu ekipman kullanılması gerektiğini unutmayın. Bu prosedürün ardından, ayrıştırılmış stabilize kompleksler jelden elüe edilebilir veya jelden kesilebilir ve araştırmacının ihtiyaçlarına bağlı olarak immünodeteksiyon veya kütle spektrometrisi dahil birçok yöntemle analiz edilebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, yeni bir iki boyutlu poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) sistemi kullanarak doku lizatlarındaki doğal protein komplekslerinin stabilize edilmesi ve ayrıştırılması için bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, protein etkileşimlerinin doğal koşullara yakın şartlarda analiz edilmesine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Proteomik
- Elektroforez
Arka Plan
- Protein komplekslerinin anlaşılması birçok biyolojik çalışma için kritik öneme sahiptir.
- Doğal protein etkileşimleri labil olabilir ve analiz edilmesi zor olabilir.
- Yaygın biyolojik yöntemler bu tekniğin uygulanmasını kolaylaştırır.
- Bu yöntem, protein analizine yönelik özelleştirilmiş yaklaşımlara olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Doku lizatlarından doğal protein komplekslerini yakalamak ve analiz etmek.
- Daha iyi tanımlama için protein etkileşimlerini stabilize etmek.
- Araştırmacılar için yaygın olarak uygulanabilir bir yöntem sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Mavi doğal poliakrilamid jel elektroforezi için hazırlık.
- Proteinlerin 150 volt altında elektroforezi.
- Jeldeki boya bandının ilerleyişinin izlenmesi.
- Amin-reaktif bir protein çapraz bağlayıcının kullanımı.
Temel Sonuçlar
- Doğal protein komplekslerinin başarılı stabilizasyonu.
- Doku lizatlarındaki proteinlerin etkili ayrıştırılması.
- Doğala yakın koşullar altında protein etkileşimlerinin tanımlanması.
Sonuçlar
- Bu yöntem, protein komplekslerinin analizini geliştirmektedir.
- Çeşitli araştırma hedeflerine uyarlanabilirdir.
- Yaygın yöntemlerin kullanılması, araştırmacılar için erişilebilirliği artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Multimer-PAGE, biyofarma Ar-Ge ekiplerinin doku lizatlarından doğal protein komplekslerini doğal koşullara yakın şartlarda stabilize etmesine ve çözümlemesine olanak tanıyarak, erken keşim aşamasındaki hedef doğrulamayı ve mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler. Geleneksel saflaştırma yöntemlerinde sıklıkla kaybolan labil protein etkileşimlerini koruyan bu yöntem, yolak analizlerinde ve kompleks tabanlı ilaç hedefi belirlemede öngörüsel güvenilirliği artırır. Bu yaklaşım, kompleks oluşumuna dair tekrarlanabilir ve kantitatif okumalar sağlayarak, keşif aşamasından preklinik değerlendirmeye kadar olan translasyonel sürekliliği güçlendirir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Kovalent olmayan bağları bozmadan doğal protein etkileşimlerini yakalayarak terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Çoğu moleküler biyoloji ekibinin aşina olduğu, erişilebilir mavi-doğal ve SDS-PAGE tekniklerini kullanarak uzmanlık eğitimi ihtiyacını azaltır.
- Öngörücü Değer: Kompleksleri stabilize ederek immunoblot veya kütle spektrometrisi yoluyla alt akış tanımlamalarını destekler ve böylece fonksiyonel hedef doğrulamasını kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tarama kampanyaları boyunca analiz standardizasyonu için kantitatif biyobelirteçler olarak hizmet edebilecek çözünürlüklü kompleks profilleri oluşturur.
- Operasyonel Değer: Ucuz ve yaygın olarak erişilebilen reaktiflere ve ekipmanlara dayanır; bu da merkezi tesislerde ölçeklenebilir uygulamayı mümkün kılar.
- Analiz Hazırlığı: İmmünodeteksiyon gibi alt saptama yöntemleriyle uyumlu, SDS-PAGE ile ayrıştırılmış kompleksler üretir ve böylece yüksek içerikli tarama entegrasyonunu destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Hastalıkla ilişkili sistemlerde validasyon için kompleks bütünlüğünü koruyarak, keşif ve preklinik iş akışları arasında köprü kurar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Kompleks oluşumunun farklı koşullar altında (örneğin, deterjan veya SDS maruziyeti) değerlendirilmesine olanak tanıyarak hedef sağlamlığı hakkında bilgi sağlar.
- Risk Ayarlı İlerleme: Kompleks stabilitesi ve bolluğuna dayalı olarak "devam/tamam" kararlarının verilmesini sağlar ve mekanistik belirsizlikten kaynaklanan geç aşama kayıplarını azaltır.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Multimer-PAGE, hedef belirlemeden öncü bileşik optimizasyonuna kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlar ve doku kaynaklı örneklerde doğal protein komplekslerinin analizine olanak tanıyarak preklinik doğrulamaya mekanistik bir köprü kurar.
- Keşif Biyolojisi: Modifiye edilmemiş doku lizatlarından endojen kompleksleri yakalayarak hipotez testlerini ve yolak aydınlatılmasını destekler.
- Tarama: Tekrarlanabilir kompleks ayrıştırma ve tespiti yoluyla assay geliştirmeye olanak tanıyarak, bileşiklerin hedef etkileşimi üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesini kolaylaştırır.
- Analitik: Sekonder SDS-PAGE aracılığıyla protein komplekslerinin kantitatif ayrıştırmasını sağlayarak, farklı koşulların veya tedavilerin karşılaştırılmasına imkan tanır.
- Translasyonel Araştırma: Hastalık modellerindeki validasyon için kompleks stabilitesini koruyarak preklinik süreklilikle bağlantı kurar ve biyobelirteç uyumunu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Tek kullanımlık bir assay yerine, birden fazla hedef ve hastalık alanına uyarlanabilen yeniden kullanılabilir bir platform kapasitesi olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Protein etkileşim ağlarındaki mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış jel tabanlı iş akışları ve tanıdık elektroforez teknikleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Hedeflerin erken aşamada riskten arındırılmasını sağlayarak, yetersiz doğrulanmış mekanizmalara yapılan yatırımı minimize eder ve sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Yerel bağlamlarda kompleks oluşumuna ve stabilitesine dair doğrudan kanıtlar sunarak, riske göre ayarlanmış önceliklendirmeye temel oluşturur.
Uygulama Hususları
- Jel dökümü ve elektroforetik ayrıştırma dahil olmak üzere, native PAGE ve SDS-PAGE tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Elektroforez cihazına, güç kaynaklarına ve DSP çapraz bağlayıcı ile SDS gibi standart reaktiflere erişime bağlıdır.
- Keşif ve preklinik grupları arasında tutarlı kompleks yakalama ve tespiti için ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Ayrıştırma verimliliği moleküler ağırlığa göre değişebileceğinden, farklı doku türleri ve kompleks boyutları için adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Kaynak materyalde belirtildiği üzere, çok büyük komplekslerin çözümlenmesindeki zorluklar ve çapraz bağlama verimliliğindeki potansiyel değişkenliklerle sınırlıdır.
