Yalıtımlı ve Akış Sitometrisi ile Pankreas mezenkim ve Hücreler Analizi

Bu prosedürün genel amacı, gen ve yüzey belirteç ekspresyon analizi için pankreas mezenkimal hücrelerini izole etmektir. Bu yöntem, mezenkimal hücreler tarafından hangi ipuçlarının ifade edildiği ve epitel gelişimini nasıl etkilediği gibi pankreas gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, nispeten basit ve hızlı olması ve sıralanmış hücrelerin iyi bir şekilde verimine izin vermesidir.

İç organları HBSS içeren bir kültür kabına koyarak ve çanağı bir stereo mikroskop altına yerleştirerek başlayın. Pankreası mide, duodenum ve dalaktan çıkarmak için ince forseps kullanarak pankreası ortaya çıkarmak için karaciğeri ve böbrekleri ayırın. Her pankreas toplanırken, dokuyu taze hazırlanmış sindirim tamponu içeren konik bir tüpe aktarın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.

Tüm pankreata hasat edildiğinde, dokuları 700 RPM'de çalkalama ile 30 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir ısıtma bloğuna aktarın ve tüpleri 15 dakika sonra üç ila dört kez manuel olarak ters çevirin. Sindirimin ilk yarısından sonra hala büyük pankreas parçaları mevcutsa, son 15 dakika boyunca her beş dakikada bir tüpü ters çevirin ve dokuyu gerektiği kadar beş ila 10 dakika daha inkübe edin. Sindirimin sonunda, tüpleri buzun üzerine yerleştirin ve her numuneye 10 mililitre soğuk HBSS ekleyin.

Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri iki mililitre taze PBS'de yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri 35 mikronluk süzgeçlerden beş mililitrelik yuvarlak tabanlı polistiren toplama tüplerine süzün ve sindirim tüplerini iki mililitre taze PBS ile yıkayın ve yıkamaları karşılık gelen toplama tüplerine süzün. Daha sonra hücreleri tekrar santrifüjleyin ve peletleri rahatsız etmeden süpernatanları dikkatlice aspire edin.

Hücreleri, hayvanların yaşına göre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin ve bunları yeni 35 mikron hücre süzgeçlerinden yeni beş mililitrelik toplama tüplerine süzün. 50 ila 100 mikrolitre hacimli hücreleri, her florofor için bir tüp, canlılık boyası, floresan proteinler ve boyanmamış bir kontrol dahil olmak üzere boyama kontrolleri için yeni FACS tüplerine ekleyin. Her tüpü dört mililitreye kadar ayırma tamponu ve ardından santrifüj ile yıkayın.

Daha sonra, peletleri hayvanların yaşına göre taze ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri canlılık boyası ile boyayın. RNA ekstraksiyonundan önce hücre sıralaması için, sıralamanın başlangıcından hemen önce, steril bir 1.5 mililitrelik toplama tüpünü RNAse inhibitörü içeren bir mililitre ayırma tamponu ile kaplayın.

Beş dakika sonra, toplama tüpünü girdap haline getirin ve sıvıyı çıkarın. İlk boyama kontrolünü girdaplayın ve sıralama parametrelerini belirlemeye başlamak için tüpü akış sitometresine yükleyin. Tüm sıralama parametreleri ayarlandığında, numuneleri yükleyin ve hücreleri 1,5 mililitrelik toplama tüplerine sıralayın.

Daha sonra sıralanan hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Süpernatanı pelete kadar aspire edin ve RNA'yı standart RNA ekstraksiyon protokollerine göre çıkarın. Burada, embriyonik gün 15.5 embriyosu ve doğum sonrası dördüncü gün yavrusunun mide, dalak, bağırsak ve pankreas dahil olmak üzere izole edilmiş tüm gastrointestinal sistem gösterilmektedir.

Az önce gösterildiği gibi izole edilen embriyonik, yenidoğan ve yetişkin pankreas dokularından tek hücrelerin akış sitometrik analizi, analiz edilen tüm yaşlardan transgenik pankreas dokularının farklı YFP etiketli hücre popülasyonları içerdiğini ortaya koymaktadır. Sıralamadan sonra, bu mezenkimal hücreler, en az beş geçiş için bir hücre hattı oluşturmak üzere kültürlenebilir. Mezenkimal hücrelere özgü kültürlenmiş hücrelerin fibrotik morfolojisine dikkat edin.

Sıralanan hücreler, RNA ekstraksiyonu ve cDNA sentezinden sonra qPCR ile analiz edildiği gibi panmezenkimal belirteç vementini eksprese eder. Ayrıca, izole edilmiş pankreas hücre yüzeyi işaretleyici ifadesi, transgenik YFP pankreasındaki floresan etiketli hücrelerin tümünün, fibroblastlar tarafından eksprese edildiği bildirilen bir hücre yüzeyi glikoproteini olan CD9'u eksprese ettiğini gösterir. Bu prosedürü takiben, mezenkimal hücre gen ekspresyonu ile ilgili ek soruları yanıtlamak için RNA dizilimi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.