Name: Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Öğrenin, insan T hücreleri ve antijen sunan hücreler arasındaki bağışıklık sinapslarını görüntüleme akış sitometresi ile analiz etme yöntemini. Bu teknik, ekz vivo analiz için hızlı ve verimli bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

İşi Alman Araştırma Konseyi (DFG) tarafından hibe ile No finanse edildi SFB-938-M ve SA 393/3-4.

1. Pan-lökosit hazırlanması
<ol><li>1 mL periferik kan heparinized bir şırıngada bir sağlıklı donör (veya hasta) çizin. Kan bağışı için sorumlu Etik Komitesi tarafından onay emin olun.</li>
	<li>İnsan periferik Mix 1 mL 30 mL ACK lizis arabellek (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3ve 0,1 mM EDTA, pH 7,0) 50 mL tüp ile kan ve oda sıcaklığında 8 min için kuluçkaya.</li>
	<li>PBS ve 6 dk. aspiratı süpernatant 300 x g , santrifüj tüpleri doldurun ve Pelet ACK lizis arabellek 30 mL resuspend.</li>
	<li>Süpernatant temiz 1.2 ve 1.3 tamamlayana dek. Son olarak, PBS, oda sıcaklığında 6 min için 300 x g , santrifüj hücrelerde yıkama ve hücre Pelet kültür orta (RPMI1640 + % 10 FCS) 2 mL resuspend. 60 dk 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
</ol>2. yükleme Raji SEB ile hücreleri
<ol><li>İki 15 mL Falcon tüp 1.5 x 10 ile tüp başına6 Raji hücreleri hazırlayın. Spin aşağı hücreleri (300 x g için oda sıcaklığında 6 dk) ve süpernatant atın.</li>
	<li>Kalan orta hücrelerde resuspend (yaklaşık 50-100 µL), 1,9 µL (1.9 µG) eklemek SEB ve 15 dakika süreyle Ekle 5 mL kültür orta oda sıcaklığında kuluçkaya, hücreleri (300 x g için oda sıcaklığında 6 dk) aşağı spin ve Pelet kültür orta (RPMI resuspend 1640 + %10 FCS), 1 x 106 hücre/mL yoğunluğu.</li>
</ol>3. indüksiyon bağışıklık sinapslarda ve protokol boyama
<ol><li>Tüp bir FACS hücrelere Raji SEB-yüklü hazırlanması ve boş Raji hücreleri hazırlık başka bir FACS tüp içine 500 µL 500 µL pipet. Pan-lökositlerin 650 µL her tüp ve (oda sıcaklığında 10 dakika 300 x g) hücreleri aşağı spin ekleyin. Süpernatant atın ve Pelet kültür orta (RPMI1640 + % 10 FCS) 150 µL içinde resuspend. (Genellikle için 45 dk) 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Yavaşça girdap hücreleri (10 s 1000 rpm) ve paraformaldehyde (% 1.5) 1,5 mL hücreleri düzeltmek için girdap sırasında ekleyin. Fiksasyonun PBS + % 1 BSA 1 mL ekleyerek durdurmak. Cips hücreleri (300 x g için oda sıcaklığında ve resuspension hücre Pelet PBS + 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka sonra % 1 BSA 1 ml 10 dak.</li>
	<li>Cips (300 x g için oda sıcaklığında 10 dakika) ve PBS + % 1 BSA + %0,1 saponin 15 dakika oda sıcaklığında hücreleri permeabilize için 100 µL hücrelerde resuspend (96-şey plaka, U şeklinde).</li>
	<li>PBS + % 1 BSA + %0,1 saponin Santrifüjü (300 x g için oda sıcaklığında 10 dk) ile hücrelerde yıkama ve hücre Pelet PBS + % 1 BSA + %0,1 saponin fluorophore etiketli antikorlar veya bileşikler (CD3-PE-TxRed (1:30), içeren 50 µL resuspend Phalloidin-AF647 (1:150) ve DAPI (1:3, 000)).</li>
	<li>Hücreleri, oda sıcaklığında 30 dakika yıkama için karanlıkta hücreleri PBS + % 1 BSA + %0,1 saponin 1 mL ekleyerek 3 kez kuluçkaya. Vasıl 300 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi. Re-resuspend PBS 60 µL görüntüleme akış sitometresi için hücrelerinde.</li>
</ol>4. akış sitometresi kullanarak resim alma
Not: Aşağıdaki görüntü edinme prosedürü ve veri analizi gibi imagestream (IS100), ilham ve fikir yazılımı kullanarak akış sitometresi Imaging üzerinde temel alır. Ancak, diğer akış cytometers ve analiz yazılım de kullanılabilir.
<ol><li>Açık analiz yazılımı bilgisayarda görüntüleme akış sitometresi ve tıkırtı üstünde belgili tanımlık alet yemek listesi, akışkanlar başlatmak için bağlı. Boncuk bunu yapmak isteyip istemediğiniz sorulduğunda doğru bağlantı noktası üzerinde uygulayın.</li>
	<li>Dosya menüsünden varsayılan şablonunu yükleme ve çalıştırma/kurulum üzerinde tıklatın. Boncuk görünümü açılır menüden seçin.</li>
	<li>Belirtilen değer 200 altında ise ayarla yoğunluğu üzerinde tıklatarak alan parlak ışığı ayarlayın.</li>
	<li>Ve başlamak tüm üzerinde tıklatarak yardımcı sekmede rutin test kalibrasyon çalıştırabilirsiniz.</li>
	<li>Flush/kilit/Yükle'yi tıklatın ve bunu yapmak isteyip istemediğiniz sorulduğunda sol bağlantı noktası örneklerinde uygulayın. Akış Sitometresi hücrelerde yükleme sonra hücre Sınıflandırıcısı açın ve değerlerini aşağıdaki gibi ayarlayın: 1,022 her kanal, Kanal 2 için 50 en yüksek yoğunluk alt sınırı (DAPI) ve Kanal 5 (CD3-Pe-TxR), 50 için alan alt limitte için en yüksek yoğunluk üst limitte Kanal 1 (yan dağılım) ve 1.500 üst sınırı.</li>
	<li>Uyarma lazer güç değiştirmek için 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW) ve 647 nm (90 mW) Kur sekmesinde.</li>
	<li>Görünüm açılır menü hücreleri ve boncuk hücre Sınıflandırıcısı ve lazer güç ayarlamaları değerlendirmek için arasında geçiş yapar. Not: Tüm hücreleri ve hücre çiftler hücre görünümü bulunur ve hücre kümeleri, enkaz ve doymuş pikseli olan görüntüler enkaz görünümünde hücre sınıflandırıcıları ve/veya uyarma lazer güçler değiştirerek bulduğu emin olun.</li>
	<li>Örnek adı ve (örnekler için 15.000-25.000) ve 500 tazminat denetimler için elde etmek için çekilen fotoğraf sayısının da Kur sekmesini tıklayın satın başlatmak için Çalıştır/kurulum tanımlamak için.</li>
</ol>5. veri analizi
<ol><li>Raw resim dosyaları (.rif) veri analizi bilgisayara aktarın ve analiz yazılımı açın.</li>
	<li>Talimatları tazminat açılan tazminat matris üretmek. Tazminat matris comp_Date.ctm kaydedin.</li>
	<li>Örnek bir raw resim dosyası (.rif) açın ve telafi görüntü dosyaları (.cif) ve varsayılan veri çözümleme dosyası (.daf) üretmek için görünen penceresinde comp_Date.ctm uygulayın.</li>
	<li>Telafi görüntü dosyasını açın. Görüntüleri renk moduna dönüştürün ve arama tabloları resim galerisi özellikleri araç çubuğunda en iyi görünür renkler elde etmek için ayarlayın. Resim galeri özellikleri araç çubuğu bileşik sekmesini kullanarak RGB birleştirilen görüntüyü elde etmek.</li>
	<li>
Maske Yöneticisi Analysis açılan listeden açın. T hücreleri ve bağışıklık synapse aşağıdaki gibi tanımlamak için maskeler oluşturun:
	<ol>
<li>T-hücre maske seçin: "(dolgu (Threshold_Ch05, 60)." Vadi maske seçin: "Valley(Ch02,3)." T-hücre synapse maske seçin: "T-hücre maskesi ve Valley (M02, Ch02, 3)."</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Özellik Yöneticisi Analysis açılan listeden açın. Aşağıdaki özellikler hesaplamak:
	<ol>
<li>T hücreleri içinde toplam CD3 ifade için seçin "Intensity_T-cells_Ch5." F-aktin T hücreleri içinde toplam tutarı için "Intensity_T-cells_Ch6." seçin CD3 ifade bağışıklık synapse için seçin "Intensity_T hücreli synapse_Ch5." F-aktin miktarı için bağışıklık synapse içinde "Intensity_T-hücre synapse_Ch6." seçin</li>
		<li>T-hücre alanını hesaplamak için "Area_T-hücreleri." seçin T-hücre bağışıklık synapse alanını hesaplamak için "Area_T-hücre synapse." seçin</li>
	</ol>
</li>
	<li>F-aktin ve bağışıklık synapse CD3 zenginleştirme Özellik Yöneticisi'nde denklemi kullanarak belirleyin: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/55345/55345eq1.jpg">
</li>
	<li>
Çubuk grafikler kullanarak aşağıdaki gating strateji uygulamak ve analiz alanı (daha fazla bilgi, bkz. başvuruları 17 ve 19 için) gelen nokta çizer:
	<ol>
<li>Bir çubuk grafik; "degrade RMS_M2_Ch2" komplo tarafından odak hücreleri sil 15, eşik ayarlayın.</li>
		<li>Bir nokta Arsa CD3 şiddeti karşı SSC arsa. Bir kapı CD3 pozitif olayları üzerinde ayarlayın.</li>
		<li>"En/boy oranı" M02 Arsa (DAPI leke) M02 alan karşı (DAPI leke). T-hücre gömlek ve hücre kapısı buna göre çiftler. Synapse maskesi alan17,19daha önce açıklandığı gibi kullanarak gerçek hücre çiftler için düzeltin.</li>
		<li>F-aktin T hücreli gömlek ve T hücreleri T-hücre/APC çiftlerin miktarı ve F-aktin yüzdesi olarak bağışıklık synapse belirler.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+Costimulation%3A+From+Mechanism+to+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy.</a> Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).</li>
<li>Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeletal+dynamics+in+T+lymphocyte+activation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration.</a> Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).</li>
<li>Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin%3A+a+redox+sensitive+mediator+of+actin+dynamics+during+T-cell+activation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration.</a> Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).</li>
<li>Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+and+Traction%3A+Cytoskeletal+Control+of+Receptor+Triggering+at+the+Immunological+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse.</a> Front Immunol. 7, 68(2016).</li>
<li>Piragyte, I., Jun, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+engine+in+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immune+Netw%22%5BJournal%5D)">Actin engine in immunological synapse.</a> Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).</li>
<li>Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy of the immunological synapse.</a> Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+%28STED%29+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-actin+flow+drives+affinity+maturation+and+spatial+organization+of+LFA-1+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse.</a> J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).</li>
<li>Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+immunological+synapse+between+dendritic+cells+and+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells.</a> J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).</li>
<li>Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiskott-Aldrich+Syndrome%3A+Immunodeficiency+resulting+from+defective+cell+migration+and+impaired+immunostimulatory+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation.</a> Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Dustin, M. L., Depoil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+T+cell+synapse+from+single+molecule+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">New insights into the T cell synapse from single molecule techniques.</a> Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse%3A+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front Immunol. 3, 421(2012).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+LFA-1+cluster+formation+in+the+immune+synapse+requires+the+combined+activities+of+L-plastin+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin.</a> European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+phosphorylation%3A+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li>
<li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InFlow+microscopy+of+human+leukocytes%3A+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li>
<li>Basiji, D., O'Gorman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).</li>
<li>Wabnitz, G. H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+Characterization+of+Human+T-Cell+Immune+Synapses+by+InFlow+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).</li>
<li>Balta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+analysis+of+PMN%2FT-cell+interactions+by+InFlow+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy.</a> Methods. , (2016).</li>
<li>Hochweller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+control+T+cell+tonic+signaling+required+for+responsiveness+to+foreign+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada sunulan iş akışı insan T hücreleri (ex vivo) ve ZPT arasında bağışıklık sinapslarda miktar sağlar. Özellikle, eritrosit lysed pan-lökosit T hücreli arıtma adımları gereksiz yapma T-hücre kaynağı olarak kullanıldı. B hücreli lenfoma hücre kültürünü Raji ZPT vekil olarak görev yaptı. Kan bağış bağışıklık synapse T hücreli tarafı arasında karşılaştırma yapmayı sağlar beri bu önemli avantajları, ayılar. Ayrıca, otolog DCs doğrudan periferik kan grubundan pek mevcuttur. Dendritik hücreler (moDCs) monosit kaynaklı üreti...

T hücreleri edinilmiş bağışıklık sisteminin ana düzenleyiciler edilir ve MHC kompleksi (MHC) kapsamında sunulan antijenik peptidler aracılığıyla etkinleştirilir. Tam T Hücre aktivasyonu gerektirir iki sinyal, antijen spesifik T-hücre reseptör (TCR) üzerinden yetkinlik sinyal / CD3 kompleksi ve costimulatory sinyal aksesuar reseptörleri üzerinden. Her iki sinyali antijen sunma ile T hücrelerinin etkileşimi doğrudan aracılığıyla oluşturulan hücreler (ZPT). Olgun ZPT yetkinlik sinyal MHC-peptid kompleksi ile T Hücre aktivasyonu için sağlamak ve costimulatory ligandlar express (örneğin, CD80 veya CD86) T-hücre harekete geçirmek1ilerlemesini sağlamak için. Bir önemli costimulation düzenlenmesi aktin sitoiskeleti2,3,4fonksiyonudur. Kortikal F-aktin T hücreleri dinlenme nispeten statiktir. T-hücre stimülasyon aracılığıyla antijen-ZPT taşıyan aktin sitoiskeleti derin bir düzenlenmesi için yol açar. Aktin dynamics (yani, hızlı aktin polimerizasyon/bozulumu daireler) proteinler veya organelleri, örneğin taşıma için kullanılan kuvvetler oluşturmak T hücreleri etkinleştirin. Ayrıca, aktin sitoiskeleti T hücreleri ve bağışıklık sinaps denilen ZPT, arasında özel bir iletişim bölge geliştirmek için önemlidir. Aktin sitoiskeleti bağışıklık synapse için önemi nedeniyle, bu aktin sitoiskeleti T hücreleri5,6,7,8 değişiklikleri ölçmek için yöntemler geliştirmek için gerekli hale geldi , 9.
Aktin hücre iskeleti yardım sayesinde, bağışıklık synapse içinde (SMACs) supramolecular harekete geçirmek kümelerdeki yüzey reseptörlerinin ve sinyal proteinleri ayrılmış. Bağışıklık synapse kararlılığını reseptörleri aktin sitoiskeleti esnekliğini artırmak F-aktin paketler için bağlama tarafından güvence altına alınmıştır. Edinilmiş bağışıklık yanıtı oluşturmak için kritik olmak bağışıklık synapse oluşumu gösterilmiştir. Arızalı bağışıklık synapse oluşumu içinde vivo zararlı etkilerini ilk Wiskott Aldrich sendromu (WAS), hangi aktin polimerizasyon hastalığında gelen acı hastalarda fark ve kullanılazlar, bağışıklık synapse oluşumu rahatsız10 . Hastalar egzama, şiddetli tekrarlayan enfeksiyonlar, otoimmün hastalıklar ve melanomlar muzdarip yapıldı. Bu bulgu rağmen Şu anda sağlıklı bireyler ve hastaların acı bağışıklık kusurları veya otoimmün hastalıklar T hücrelerinde farklı bağışıklık synapse oluşumu bilinmemektedir.
Floresans mikroskobu, confocal de dahil olmak üzere, TIRF ve süper çözünürlük mikroskobu, bağışıklık synapse11,12,13,14mimarisini ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. Bu sistemlerin yüksek çözünürlüklü ve canlı hücre görüntüleme gerçekleştirme imkanı aktin sitoiskeleti ve bağışıklık synapse yüzey veya hücre içi proteinlerin hakkında tam ve kendisinin zamansal bilgi toplama sağlar. Fazla sonuç, ancak, yalnızca birkaç on T hücrelerinin analizine dayanır. Ayrıca, T hücreleri floresan mikroskopi bu tür için saf olmalı. Ancak, birçok araştırma soruları için mümkün en yüksek çözünürlük yerine unpurified hücreleri kullanımı son derece önemlidir. Bu hastalarda T hücreleri, bağışlanan kan miktarı sınırlıdır ve paralel olarak pek çok örnekleri işlemek için gereken olabilir analiz edilir uygundur.
İnsan sistemi15,16,17bağışıklık synapse aktin sitoiskeleti analizine izin mikroskobik yöntemleri kurduk. Bu yöntemler akış sitometresi akış denetimli mikroskobu18olarak da bilinir, Imaging üzerinde temel alır. Spektral akış sitometresi ve floresan mikroskopi arasında bir melez akış sitometresi Imaging'in morfolojik parametreleri ve pan-lökosit gibi türdeş olmayan hücre popülasyonlarının protein yerelleşme analiz onun güçlü vardır periferik kan. T-hücre/APC conjugates tam kan örneklerinden, zaman alıcı ve pahalı arıtma adımları17, gerek kalmadan insan T hücrelerinin içinde F-aktin ölçmek sağlar bir metodoloji tanıttı. Burada sunulan teknik F-aktin miktar olarak bağışıklık synapse için kan örneği almak tüm iş akışı, oluşmaktadır.

<table><tbody><tr><td>>Multifuge 3 SR</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>LifeTechnologies</td><td>#11875085</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Pan Biotech#3302-P101102</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polistiren Yuvarlak Alt Boru</td><td>Şahin</td><td>#352054</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Kulturflasche</td><td>Thermo Scientific</td><td>#178883</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Roth</td> <td># 8076.3</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma Aldrich</td> <td># 16005</td><td></td></tr><tr><td>FACS Yıkama Saponin</td><td></td><td>PBS% 1 BSA 0.15 Saponin</td><td></td></tr><tr><td>ReaktiosgefaB</td><td>Sarstedt</td><td>72.699.002</td><td>0.5 mL</td></tr><tr><td>Hız Boncuk</td><td>Amnis</td><td>#400041</td><td></td></tr><tr><td>Minishaker MS1</td><td>IKA İşleri</td><td>&nbsp; MS1</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatte</td><td>Greiner Bio One</td> <td># 650101</td><td>96U</td></tr><tr><td>Enterotoksin SEB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4881</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>1:3000</td></tr><tr><td>CD3-PeTxR</td><td>Invitrogen</td><td>MHCD0317</td><td>1:30</td></tr><tr><td>Phalloidin-AF647</td><td>Moleküler Problar</td><td>A22287</td><td>1:150</td></tr><tr><td>IS100</td><td>Amnis</td><td></td><td>Görüntüleme akış sitometresi</td></tr><tr><td>IDEAS</td><td>Amnis</td><td></td><td>Yazılımı</td></tr><tr><td>INSPIRE</td><td>Amnis</td><td></td><td>Yazılımı</td></tr></tbody></table>

akış sitometresi imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık synapse nitel ve nicel analiz

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Bağışıklık synapse T hücreleri ve antijen sunan hücreler (ZPT) arasındaki iletişimi alanıdır. T hücre yüzey reseptörlerinin ve proteinler istikrarlı bir bağlama temin ve Satım sinyal için bağışıklık synapse doğru kutuplaştırmaya. Klasik confocal, TIRF veya Süper çözünürlük mikroskobu bağışıklık synapse eğitim için kullanılmıştır. El ile resim alma ve zaman alıcı miktar bu yöntemler gerektiren bu yana, nadir olayları görüntüleme meydan okuyor. Burada, on binlerce hücre morfolojik analiz sağlayan bir iş akışı açıklanmaktadır. Bağışıklık sinapslarda pan-lökosit müstahzarları birincil insan T hücreleri ve Staphylococcus aureus enterotoxin B SEB-yüklü Raji hücreleri arasında ZPT indüklenen vardır. Resim alma akış sitometresi özelliklerini barındıran bir akış sitometresi ve floresan mikroskop akış denetimli mikroskobu olarak da bilinir, Imaging ile gerçekleştirilir. T hücre/APC çiftler belirlenmesi ve bağışıklık sinapslarda analiz tam bir perdeleme strateji sağlanır. Bu iş akışı bağışıklık Analizi synapses unpurified pan-lökosit hazırlıkları ve dolayısıyla kan sadece küçük bir birim gerektiriyor verdiğinden (yani, 1 mL), Bu hastalardan örnekleri için uygulanabilir. Önemlisi, çeşitli örnekleri hazır, ölçülebilir ve buna paralel olarak analiz.

Protein zenginleştirme miktar önemli hedefidir burada açıklanan yöntemi (örneğin, F-aktin) arasında bağışıklık synapse içinde ZPT (Raji hücreleri) ve T hücrelerinin unpurified pan-lökosit düşük hacimli (1 mL) insan kanı örnekleri alınan vekil. Ekran görüntüsü Şekil 1 ' deki kritik gating strateji bu yöntemin genel bir bakış verir. Sol ve sağ (Şekil 1) analiz alanı resim galerisi gösterir. Resim galerisi "Odak" kapıyı gösterir. Görülen başlıca gra...

Burada, biz birincil insan T hücreleri ve antijen sunan hücreler arasındaki bağışıklık sinapslarda nitel ve nicel analizi için tam bir iş akışı tanımlamak. Yöntem alma ve nispeten kısa bir süre içinde birkaç bin hücre görüntülerin değerlendirme sağlar görüntüleme akış sitometresi temel alır.

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Bu yöntem, lökositler arasındaki iletişimin moleküler ve hücresel düzeyde nasıl oluştuğu gibi insan immünolojik alanındaki temel soruların yanıtlatIlmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, saflaştırılmamış insan T hücrelerinin nispeten kısa bir süre içinde ex vivo analiz edilebilmektedir. Bu prosedürü gösteren Henning Kirchgessner, bizim laboratuvar bir teknisyen olacaktır.50 mililitrelik konik tüp içinde 30 mililitre ACK lysis tampon ile taze çekilmiş insan periferik kan bir mililitre karıştırarak başlayın. Oda sıcaklığında sekiz dakika sonra, bir santrifüj yıkama için PBS ile tüp doldurun ve 37 santigrat derece 60 dakikalık kuluçka için kültür orta iki mililitre pelet resuspend. Kuluçka sonunda, beş kez 10 beşinci Staphylococcus aureus enterotoxin B veya SEB yüklü veya boşraji hücreleri kültür ortamının 500 mikrolitre bireysel FACS tüpleriçine ekleyin, pan-lökosit 650 mikrolitre takip.Ortak kültürlerden aşağı dön ve 150 mikrolitre taze kültür ortamındaki peletleri 37 santigrat derecede 45 dakikalık bir kuluçka için yeniden askıya alın. Daha sonra, 100 rpm'de 10 saniye boyunca hücreleri hafifçe girdap ederken 1,5 mililitre lik 1,5 paraformaldehit ekleyin. Oda sıca

qualitative-quantitative-analysis-immune-synapse-human-system-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu protokol, ayrışmış nöronal kültür ve immünsitokimya kullanarak beyin bölümlerinde de sinaps sayısını ölçmek için nasıl ayrıntıları. Kompartman-spesifik antikorların kullanarak, presinaptik terminalleri yanı sıra postsinaptik uzmanlık siteleri etiket. Biz bu belirteçler tarafından oluşturulan sinyaller arasındaki sinaps ko noktaları olarak tanımlar.

Sinapslar miktarının: Synapse Numarası ölçmek için bir İmmünositokimya tabanlı Testi

Biz (ImageStream teknolojinin kullanıldığını...

Monositler ve İnsan Kan Küçük Örneklerden Dendritik Hücrelerde Lineage özgü Toll-like reseptör-aracılı Sinyali Kantitatif Görüntüleme

Bu video, saflaştırılmamış pan-lökosit preparatlarındaki T hücreleri ile Staphylococcus aureus enterotoksin B, SEB yüklü Raji hücreleri arasındaki immün sinaps oluşumunu analiz eder. Görüntüleme akış sitometrisi kullanılarak immün sinapsta CD3 ve F-aktin zenginleşmesi gözlenir.

İnsan T Hücreleri ile SEB Yüklü Raji Hücreleri Arasındaki İmmün Sinapsların Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak Analizi

Kaynak: Hidmark, A. S.,  et al. {{}}Tek Bir Siyatik Sinirlerde ve Dorsal Kök Ganglionunda İmmün Hücrelerin Flow Sitometri Kullanılarak Analizi. J. Vis. Uzm. {{TAG_ 27}} (2017).  Bu video, fare siyatik sinirlerinde ve dorsal kök gangliyonlarında (DRG'ler) bağışıklık hücrelerini analiz etmek için akış sitometrisinin kullanımını göstermektedir. İşlem, bağışıklık hücrelerinin florofor ve biyotin etiketli antikorlarla etiketlenmesini, hücrelerin stabilize edilmesini ve geçirgenleştirilmesini ve...

Fare Sinir Dokularındaki İmmün Hücrelerin Flow Sitometri Kullanılarak Analizi

İnflamasyon, iskemik inme patogenezinde merkezi bir rol oynar. Artan kanıtlar, erken beyin hasarını şiddetlendiren iki ucu keskin bir kılıç gibi davrandığını, ancak aynı zamanda daha sonraki onarıma da katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bu protokol, immün hücrelerin iskemik beyinden izolasyonunu ve müteakip akış sitometrik fenotiplemesini tanımlar.

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

T hücresi immünolojik sinapsında filamentli aktinin akış hızlarını ve yönlülüğünü araştırmak için, canlı hücre süper çözünürlüklü görüntüleme, toplam iç yansıma floresansı ile birleştirilir ve uzaysal-zamansal görüntü korelasyon spektroskopisi ile ölçülür.

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Bu protokol hem immünolojik sinaps oluşumunu hem de sonraki polarize salgı trafiğini immünolojik sinapsa doğru görüntüler. Hücresel konjugates bir süperantijen-darbeli Raji hücre (bir antijen sunan hücre olarak hareket) ve Jurkat klonu (bir efektör yardımcı T lenfosit olarak hareket) arasında kuruldu.

İnsan İmmünolojik Sinaps Görüntüleme

Diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi ile karakterizasyonu, implantlara karşı immün yanıt paterninin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu makale, diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrik analizi için boyanması için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

Burada, akış sitometrisi kullanarak vGLUT1 pozitif sinapsların ve pHRodo Red etiketli ham sinaptozomların mikroglial yutulmasını ölçmek için iki protokol sunuyoruz.

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini

Burada açıklanan, immünofloresan mikroskobu ile beş veya daha fazla floresan parametreyi görüntülemek için kullanılabilecek bir yöntemdir. Bu görüntülerden tek hücrelerin çıkarılması ve doku bölümlerindeki hücre alt kümelerini tanımlayabilen akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri yoluyla tek hücre analizi yapmak için bir analiz boru hattı ana hatlarıyla belirtilmiştir.

Histoflow Sitometri ile Yüksek Parametreli Histoloji Görüntülerinin Oluşturulması ve Analiz Edilmesi

Öğrenin, insan T hücreleri ve antijen sunan hücreler arasındaki bağışıklık sinapslarını görüntüleme akış sitometresi ile analiz etme yöntemini. Bu teknik, ekz vivo analiz için hızlı ve verimli bir yaklaşım sunar.

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

Daha fazla video keşfet