Hipokampal disfonksiyon Fetal alkol spektrum bozuklukları, fare modeli değerlendirmek için izleme Eyeblink Klasik koşullanma kullanımı

Bu deneyin genel amacı, bir ilişkisel öğrenme biçimi olan iz göz kırpma klasik koşullandırmasının, fetal alkol spektrum bozukluklarının bir sıçan modelinde hipokampal disfonksiyonu tespit etmeye nasıl yardımcı olabileceğini göstermektir. Yenidoğan sıçan yavruları, yüksek dozda alkol, hacim hacminde% 11.9 alkol konsantrasyonu ile aşırı bir şekilde zorlanır. Beyin büyümesi ile ilgili olarak insanlarda üçüncü bir trimestere eşdeğer sürede.

Bu alkol maruziyeti ve doz paterni, insan FASD vakalarını taklit eden yaşam süresi boyunca beyin açıkları üretmede kilit faktörlerdir. Erken alkol maruziyeti ile tehlikeye giren önemli bir beyin bölgesi hipokampustur. Sıçanlar yetişkin olarak büyüdükten sonra, iz göz kırpma klasik koşullandırması kullanılarak hipokampal disfonksiyon açısından incelenirler.

Bu, hipokampusun bütünlüğüne dayanan yüksek dereceli bir ilişkisel öğrenme şeklidir. Doğum sonrası dört ila dokuz gün boyunca, sıçan yavruları her sabah tartılır ve ağırlıkları kaydedilir. Besleme hacimleri daha sonra vücut ağırlığına göre önceden basılmış bir masadan elde edilir.

Sıçan yavrularına% 11.9 hacimce bir alkol çözeltisi, iki saat arayla ayrılmış iki besleme boyunca verilir. Toplam günlük alkol dozu günde kilogram başına 5.25 gramdır. Bu tıkınırcasına maruz kalma paradigması, süt çözeltisinde besleme başına gram vücut ağırlığı başına 0278 mil alkol sağlar.

Steril bir mililitrelik şırınga kullanarak alkol içeren sütü çıkarın. Ardından, gereken tam miktarı elde etmek için fazla çözeltiyi dışarı itin. PE-10 tüpünün ucunu taze mısır yağına batırın.

Bu, yerleştirmeyi kolaylaştırır. PE-10 tüpünün yavrunun ağzından midesine kadar olan uzunluğunu ölçün. Gerekirse, PE-50 durdurucuyu durma noktası için görsel bir kılavuz görevi görecek şekilde ayarlayın.

PE-10 tüpünü dikkatlice yavrunun ağzına yerleştirin. Uç boğazla buluştuğunda genellikle bir miktar dirençle karşılaşırsınız. Uç yemek borusunun girişine doğru bükülene kadar tüpü manevra yapın.

Yağ ile kaygan olabileceğinden tüpün geriye doğru kaymasına izin vermemeye çalışın. Yemek borusundan aşağı doğru ilerleyin ve uç gastroözofageal sfinkteri geçerken midesine girecektir. Bu noktada durun, pompayı stabilize edin ve çözümü verin.

Bu yavaş bir hızda yapılmalıdır. PE-10 hortumunu dikkatlice çıkarın ve yavruyu solüsyonun geri yıkaması, kan veya fiziksel yaralanma açısından inceleyin. Yavru köpeği iyiyse çöp arkadaşlarıyla değiştirin.

Göz kapağı ameliyatı prosedüründe kullanılan belirli aletler için yazılı protokole ve malzeme listesine bakın. Cerrahi alanı onaylı bir dezenfektanla sterilize edin ve tüm cerrahi aletleri ve malzemeleri önceden otoklavlayın. Sıçanda izofluran ile uygun anestezi uygulandıktan sonra, insizyon bölgesi ve sol göz kapağı için yeterli miktarda cildi açığa çıkaran bir kürk düzeltici kullanarak başını tıraş edin.

Derisi, %70 izopropil alkol ve povidon iyot içeren üç alternatif ovma yapılarak sterilize edilir. Fareyi kulak çubuklarıyla stereotaksik cihaza sabitlemek için standart prosedürü izleyin. Sıçan uygun anestezik düzlem sergilediğinde ameliyata devam edin.

Orta hatta ön arka kesi yapmak için neşter bıçağını kullanın. Bu kesi, gözlerin önünde ve lambda sütoral çizgisinin biraz arkasında yeterli alanı açığa çıkarmalıdır. Aşırı kanamaya neden olmamak için kafatasının üstündeki periosteuumu dikkatlice kazımak için neşter bıçağını kullanın.

Fazla bağ dokusunu ve kanı pamuk uçlu bir çubukla silin ve sıyrıklar arasında bölgeyi steril tuzlu su ile durulayın. Bir parietal kemik üzerinde koronal sütürün hemen arkasından başlayan bir delik açın. Pamuk uçlu bir çubukla kan ve kemik kalıntılarını temizleyin.

0 80 vidayı kavramak için kıymık forseps kullanın. Vidayı deliğe sabitlemek için bir kuyumcu tornavidası kullanın, vidayı kortikal beyin dokusuna zarar vermeden yeterince sıkın, genellikle üç ila dört tam tur. Kalan vidaları sabitlemek için aynı prosedürü izleyin.

Koronal sütürün arkasında bilateral olarak ve lambda sütürün önünde sağ parietal kemikte bir vida olmak üzere iki vida olmalıdır. Dört inçlik pansuman forseps ile sol gözünün kesi yerinde üst deriyi kavrayın ve üç inçlik pansuman forsepslerini bu gözün köşesine doğru yönlendirin. 26 gauge 3/8 inçlik bir iğne alın ve göz kapağının köşesinden geçirin.

İğneyi, eğimli taraf yukarı bakacak şekilde döndürün. İkinci iğneyi göz kapağının ortasına yerleştirin. Bir 3T teli kavramak için ince forseps kullanın ve iğnelerden birine yerleştirin.

Tamamen yerleştirmenize gerek yok. İkinci 3T tel için de aynı prosedürü izleyin. Bir elinizle her iki iğneyi de kavrarken, diğer elinizle baş aşamasını kavrayın.

Tek bir sürekli hareketle, baş aşamasını aynı yönde yönlendirirken iğneleri göz kapağından uzaklaştırın. EMG kafa aşamasını bir elinizle tutarken, 10T telini sağ taraftaki bir veya her iki vidanın etrafına sarmak için diğer elinizle üç inçlik pansuman forsepslerini kullanın. Bu teli vidalardan çıkıntı yapmayacak şekilde sıkıştırın.

Bir sonraki adıma geçmeden önce EMG kafa aşaması ortalanmalıdır. Cildi, yani yüzeysel fasyayı temporalis kasından ayırarak küçük bir cep oluşturmak için dört inçlik pansuman forsepslerini kullanın. Cep oluşturulduktan sonra, sol gözün köşesine doğru çalışarak daha fazla bağ dokusunu kesmek için iris makasını kullanın.

Çok derine girmemeye veya herhangi bir kan damarını kesmemeye dikkat edin. Bipolar bir elektrot alın ve tel ucunu temporalis kasının eğriliği boyunca takılabilecek şekilde şekillendirin. İki çatal sol gözün arkasına yerleştirilecek ve bipolar elektrotun alt ucu kafatasının tam üzerine yerleştirilecektir.

Sıvı kıvamı elde etmek için Ortho Jet tozunu sıvı bileşenlerde karıştırın. Macunu bir mikro spatula ile kesi bölgesinin her yerine uygulayın. Farenin gözlerine herhangi bir macun düşürmemeye dikkat edin ve onu kapalı tutun.

Ortho Jet'in yarı kuru bir duruma gelmesine izin verin, ardından EMG kafa aşamasındaki fazla akriliği çıkarmak için kıymık forsepslerini kullanın. Ve bipolar elektrotun dişleri. Çalışmak için birkaç santimetre bırakarak fazla 3T kabloyu kesin.

Mikro diseksiyon forsepslerini kullanarak PTFE korumasını her bir 3T telden dikkatlice çıkarın. Bu, orbicularis oculi kası ile temas kurmalarını sağlar. 3T tellerin her iki ucunda kancalar oluşturmak için mikro diseksiyon forsepslerini kullanın.

Kalan tel göz kapağına geri çekilecek kadar çok kesmemeye dikkat ederek fazla teli kesin. Kablolama evde yapılır. Önce beyaz bipolar tıkaç bağlanır ve bu, şok ABD uyaranının iletilmesine izin verir.

Turuncu EMG kafa aşaması fişi daha sonra bağlanır. Sıçan yanıp sönerken elektro miyografik aktiviteyi kaydeder. Her iki fiş de kolun üst kısmında, sıçan serbestçe hareket ederken sinyal sürekliliğini koruyan yuvarlak bir komütatöre yol açar.

Uyaran izolatörü açılır ve son donanım kontrolleri yapılır. Bu, EMG taban çizgisinin bilgisayar ekranında görülebilen bir seviyeye ayarlanmasını içerir. Birinci seansta, şok yoğunluğu ilk olarak 4 mili amper olarak ayarlanır ve her iki denemede bir 4 mil amper birimlerinde artırılır.

Prosedürdeki bu aşama, bir farenin şok uyaranına alışmasını sağlar. Sekizinci denemede, şok yoğunluğu bu seans ve sonraki tüm seanslar boyunca 1.6 mili amperde tutulur. Ayrı bir bilgisayar, gerçek zamanlı sinyal teşhisi yapmamızı sağlayan dört kanallı bir dijital osiloskop çalıştırır.

Birinci kutudaki sıçan tarafından yayılan göz kırpmasına dikkat edin. Osiloskop ayrıca temel EMG sinyalinin düşük gürültü ile nispeten temiz olduğunu gösterir. Web kameraları, her fareyi de izlememize izin verir.

Bu, 1400 milisaniye süren bir deneme dönemini gösteren yanıp sönme yazılımı sürüm 4.0'dan bir ekran görüntüsüdür. İlk 280 milisaniyede, temel EMG aktivitesinin bir ölçüsünü elde etmek için hiçbir uyaran sunulmaz. Sarı çizgi, ortalama CS öncesi başlangıç değerinin 4 voltunu aşan herhangi bir EMG yanıtının göz kırpma yanıtı olarak uygun olacağı eşik çizgisini gösterir.

85 desibellik ton koşulu uyarıcısı, 280 milisaniye zaman noktasında iletilir. Ton, 660 milisaniyelik zaman noktasına karşılık gelen 380 milisaniye boyunca açık kalır. Kapandıktan sonra, hiçbir uyaranın sunulmadığı 500 milisaniyelik bir aralık vardır Bu, sıçanın, hala 1160 milisaniye işaretinde iletilecek olan şok US'nin başlangıcı ile CS tonunun ofsetini çözmesi gereken izleme periyodu olarak adlandırılır.

US şoku 100 milisaniye sürer. Doğal olarak, şok ABD, koşulsuz yanıt veya 140 milisaniyelik bir zaman penceresinde ölçülen UR olarak bilinen bir savunma göz kırpma tepkisi ortaya çıkarır. Bir eğitim seansı 100 denemeden oluşmaktadır.

CS ve US'nin eşleştirildiği 90 deneme vardır ve her onuncu denemede sadece CS verilir. Oturum başına yalnızca 10 CS denemesi vardır. Bu denemeler, CS US derneğinin öğrenilip öğrenilmediğini araştırmamıza izin veriyor.

Durum yanıtları şeklinde veya CR'ler, şok US mevcut olmadığında ifade edilir. Denemeler arası aralığın ortalaması 30 saniye olarak belirlenir, böylece her denemenin başlangıcı tahmin edilemez. Herhangi bir denemede, bir sıçan herhangi bir zaman noktasında yanıp sönebilir ve EMG'si yazılım tarafından kaydedilecektir.

Eşik çizgisini aşan herhangi bir gizli göz kırpma, ne zaman meydana geldiklerine ve deneme dönemine bağlı olarak dört kategoriden birinde bir yanıt olarak kabul edilecektir. Sıçan, CS tonunun başlamasından sonraki ilk 80 milisaniye boyunca yanıp sönerse, yanıt bir irkilme tepkisi veya SR olarak kabul edilir. Bu, duyusal motor performansın göstergesi olan, ancak CS US ilişkisini kendi başına öğrenmeyen, ilişkisel olmayan bir tepkidir. SR periyodundan sonra ancak şok US verilmeden önce yanıp sönüyorsa, şartlı bir yanıt yaymıştır.

Daha önce de belirtildiği gibi, CR, ilişkisel öğrenmenin birincil ölçüsüdür. CR'nin eğitimin erken aşamalarında gelişmesi beklenmez, ancak eğitim birçok deneme ve oturumda ilerledikçe, bu tür yanıtlar daha sık, genliği daha yüksek hale gelir ve daha iyi zamanlanabilir. CR'leri toplam CR'ler ve uyarlanabilir CR'ler olmak üzere iki türe ayırıyoruz.

Toplam CR'ler genel öğrenme yeteneğini yansıtırken, uyarlanabilir CR'ler hayvanın göz kırpmasını iyi zamanlama yeteneğini yansıtır. Şokun başlamasından hemen önce, kendini desteklemenin bir yolu olarak, adaptif CR periyodu, şok US başlangıcından 200 milisaniye öncedir. Sağlam bir hipokampusu olan memelilerde, adaptif CR'lerin ifadesi, iki uyaranın iletilmesi ile ilgili olarak göz kırpmanın doğru bir şekilde zamanlanmasında yüksek düzeyde hipokampal katılımı yansıtır.

Doğası gereği, iz göz kırpma klasik koşullandırmasını elde etmek, CS tonunun ve şok US'nin zaman içinde örtüştüğü gecikmeli göz kırpma klasik koşullandırmasından çok daha zordur. CR'lerin ekspresyonu konudan konuya değişebilse ve gizli beyin devrelerine yönelik zorluklardan ciddi şekilde etkilenebilse de, UR'nin her eşleştirilmiş CS US denemesi sırasında yayılması beklenmektedir. Bu nedenle, bu ölçüm duyusal motor performansı yansıtır ve irkilme tepkileri gibi, kendi başına CS US ilişkisinin öğrenildiğinin bir göstergesi değildir.

Aşağıdaki video klip serisinde, yazılım kurulumunu ve göz kırpma eğitiminin başladığını göreceksiniz. Yanıp sönme yazılımı etkinleştirilir ve ilgili iki dosya işe alınır. Konu verilerini içeren bir sıçan dosyası ve izleme göz kırpma koşullandırma dosyası.

Program, eğitim başlayana kadar devam eder. Egzersiz başladığında, ekranın sağ alt kısmında bir sonraki deneme için geri sayım yapan bir zamanlayıcı olduğuna dikkat edin. İşte birinci oturumun, deneme 15'in, bir UR'nin yayıldığı ancak henüz hiçbir CR'nin gelişmediği canlı bir video kaydı.

İşte hızın üçte birinde bir tekrar. Aşağıdaki klip serisinde, altı seanslık eğitimde ilerlerken aynı entübe edilmemiş kontrol faresinin ekran görüntülerini göreceksiniz. Sonunda hem toplam CR'leri hem de uyarlanabilir CR'leri yayar.

İşte altıncı oturumun, deneme 96'nın canlı bir video klibi, burada biri uyarlanabilir CR ve diğeri UR olmak üzere iki göz kırpma yayılıyor. İşte hızın üçte birinde bir tekrar. Bu son klipte, alkol entübe edilmiş bir farenin altıncı oturumun son denemesinde, yalnızca CS denemesinde canlı bir videosunu göreceksiniz, 600 eğitim denemesinden sonra bile, güvenilir bir şekilde uyarlanabilir bir CR yaymıyor. Veriler toplandıktan sonra, aykırı değerleri tespit etmek için yerleşik bir hata algoritması kullanılarak yüksek gürültülü artefaktlardan ve olağandışı CS öncesi temel EMG aktivitesinden oluşan kötü denemeler için taranır.

Tutulan iyi denemeler, SR'ler, UR'ler, toplam CR'ler ve uyarlanabilir CR'ler için yanıt yüzdesi, genlik, gecikme ve diğer kritik ölçümler açısından daha fazla analiz edilir. Altı eğitim oturumundaki ortalama uyarlanabilir CR'ler bu ilk sonuç kümesinde gösterilir. Alkol entübe edilen grup ile iki kontrol grubu arasında ikinci oturumdan altıncı oturuma kadar hem yüzde hem de amplitüd ölçümleri istatistiksel olarak anlamlıydı.

Bu, erken gelişim sırasında alkole maruz kalan sıçanlarda adaptif CR'lerin sıklığının ve gücünün bozulduğunu gösterir. Ortalama koşulsuz yanıtlar bu ikinci sonuç kümesinde gösterilir. Hem frekans hem de genlik ölçümleri hiçbir grup arasında istatistiksel olarak farklı değildi.

Bu sonuçlar, erken alkol maruziyetinin, sıçanların koşulsuz uyarana göz kırpma yeteneğini bozmadığını, ancak sergiledikleri bozulmanın, edinim sırasında CS ve US'yi düzgün bir şekilde ilişkilendirmedeki başarısızlıktan kaynaklandığını göstermektedir. Bu deneyde, beyin davranış ilişkisini, tıkınırcasına bir şekilde verilen gelişimsel alkol maruziyetinin, eksikliklere ve iz göz kırpma klasik koşullanmasına yansıyan hipokampusu etkileyip etkilemediğini belirleyerek inceledik. Gerçekten de, göz kırpma klasik koşullandırma, beyin gelişimi sırasında alkole maruz kalmayla ilişkili nörodavranışsal sonuçları değerlendirmek için yararlı bir araçtır.

Uyaran parametrelerini veya ilişkisel öğrenme gereksinimlerini değiştirerek, hipokampus dışındaki farklı beyin sistemlerinin işlevsel bütünlüğünün de değerlendirilebilmesi açısından çok yönlüdür. Bu videoyu izledikten sonra, yenidoğan sıçan yavrularına alkol verilmesi, elektrotların implante edilmesi ve göz kırpma testi prosedürünün gerçekleştirilmesiyle ilgili karmaşıklıkları iyi anlamış olmalısınız. Bu videoyu izlediğiniz için teşekkür ederiz.