Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Bu mikroakışkan deneyin genel amacı, gerçek zamanlı video mikroskobu kullanarak akış koşulları altında reaktif bir yüzey üzerinde fibrin oluşumunda trombosit birikimini aynı anda ölçmektir. Bu yöntem, trombosit konsantresi hazırlığının transfüzyon kanın prokoagülan doğası üzerindeki etkileri hakkında transfüzyon tıbbı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, trombosit fonksiyonunun ve akıştaki pıhtılaşmanın eşzamanlı analizini kolaylaştırması ve her iki süreç arasındaki etkileşimin incelenmesine izin vermesidir.

Bu yöntem, temas yolunun neden olduğu trombosit prokoagülasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, lipidlenmiş doku faktörü ile kaplanarak ekstrinsik yolun çalışmasına da uygulanabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvardan bir teknisyen olan Rosalie Devloo olacak. Mikroakışkan akış odası kurulumuna, 0.8 mikrolitre yeni sulandırılmış kolajeni, sekiz düz paralel kanallı yeni bir tek kullanımlık mikroakışkan biyoçipin bir ucundaki her kanalın uzunluğunun altıda beşine pipetleyerek ve mikroçipin bu ucunu çıkış olarak etiketleyerek başlayın.

Biyoçipi nemlendirilmiş ve kapalı bir kapta en az dört saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, kodlanmış kanalları, bloke edici tamponlu bir karıştırma biyoçipinde eşit sayıda Y şeklinde kanalda doldurun. Mikroçipi oda sıcaklığında bir saat boyunca kabın içine geri koyun.

Ardından, kullanılan her kanal için iki, sekiz santimetre uzunluğunda ve bir, iki santimetre uzunluğunda boru parçasının bir ucuna ve 46 santimetre uzunluğunda bir boru parçasının her iki ucuna bir pim yerleştirin. Ardından, bağlı borudaki tüm pompa akışkanlarını damıtılmış su ile durulamak için Nanopump yazılımını kullanın ve diğer tüm boruları bloke edici tamponla doldurmak için şırınga konektör piminde bir şırınga kullanın. Ardından, karıştırma biyoçipini mikroskop aşamasıyla aynı yükseklikte sabitlemek için bir laboratuvar makas krikosu kullanarak kodlanmış biyoçipi otomatik mikroskop aşamasına sabitleyin.

Bu boru parçalarını karıştırma biyoçip girişine sabitlemek için sekiz santimetrelik tüplerdeki pimleri kullanın ve her tüpün serbest ucunu bir HEPES tamponlu salin şişesine koyun. Şimdi, kodlanmış biyoçipi 46 santimetrelik boru parçasıyla karıştırma biyoçipine esnek ama düz bir çizgide bağlayın. Durulama pompasının luer uyumlu borusuna bir şırınga konektör pimi takın.

Ardından, pimi iki santimetrelik boru parçasının serbest ucuna bağlayın ve borunun diğer ucunu kodlanmış biyoçipin çıkışına sabitleyin. Ardından, tüm boruları ve kanalları bir mililitre HBS ile durulayın. Perfüzyon pompalarını hazırlamak için Mikroakışkan Perfüzyon Pompası Sürücüsü yazılımını açın ve pompaları başlatmak için şırınga simgesine çift tıklayın.

Kullanılacak şırınga tipini seçin ve durulama pompasını ve ona bağlı iki santimetrelik boruyu ayırın. Bağlantısı kesilmiş iki santimetrelik boruyu şırınga konektör pimi ile bir parça kalın duvarlı atık borunun luer kilidine bağlayın ve kalın duvarlı boruyu standart pepsin çözeltisiyle doldurmak için bir şırınga kullanın. Ardından, kalın duvarlı borunun açık ucunu bir Kocher kelepçesi ile sabitleyin.

Boruyu kodlanmış biyoçipin çıkışına sabitleyin. İki tüpü karıştırma akış odasından ayırın ve HBS kaplarını atın. Boşaltılmış sodyum sitrat kaplarında kan örneğini aldıktan sonra, tüpleri santrifüjleyin ve trombositten zengin plazmayı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.

Trombositten zengin plazma ile kapları tekrar döndürün. Ardından, süpernatan trombositten fakir plazmayı farklı bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, paketlenmiş kırmızı kan hücrelerinin yeni bir konik tüpe damlamasını sağlamak için sodyum sitrat kaplarının altını delmek için 21 gauge bir iğne kullanın.

Paketlenmiş kırmızı kan hücrelerinin tamamı toplandıktan sonra, ayrılmış paketlenmiş kırmızı kan hücrelerini trombositten fakir plazma ile birleştirerek kanı nazikçe yeniden sulandırın ve transfüzyon için hazırlanan kan bankası trombositlerini ekleyin, böylece mikrolitre konsantrasyonunda %40 hematokrit ve mikrolitre konsantrasyonunda 2,5 kez 10 ila beşinci trombosit içeren örnekler elde edin ve tam kan sayımı elde edin. Daha sonra, polistiren konik bir tüpe 13 mikrolitre florofor etiketli fibrinojen ekleyin. Bunu sulandırılmış kanın bir mililitresi takip eder.

Bir mililitre kanı iki mikrolitre floresan trombosit boyası ile karıştırın ve etiketli kan örneklerini birlikte ekleyin. Ardından, karışık kan örneklerini nazikçe ters çevirin ve hücreleri 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Perfüzyon testine başlamadan önce, mikroskop optiklerini ilk kanalın dibine yapışan kollajen liflerine odaklayın.

Satın alma yazılımını kullanarak, seçilen kanalda bir ilgi alanı tanımlayın. Bir mililitre önceden ısıtılmış pıhtılaşma tamponunu bir mililitrelik şırıngaya yükleyin ve şırıngayı perfüzyon pompasına monte edin. İkinci bir yumuşak ters çevirmeden sonra, kanı iki mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve şırıngayı perfüzyon pompasına monte edin.

Ardından, her iki şırıngayı da sekiz santimetrelik borunun bir parçasına takmak için bir şırınga bağlantı pimi kullanın ve konektörleri ve tüpleri dakikada 400 mikrolitre olarak doldurun. Tüm borular pıhtılaşma tamponu veya kanla doldurulduğunda, her iki tüpün diğer ucunu karıştırma biyoçipindeki Y şeklindeki kanalın bölünmüş bacaklarına sabitleyin. Ardından, atık tüpünün çıkışındaki Kocher kelepçesini çıkarın ve pıhtılaşma tamponu için dakikada 4.4 mikrolitre ve sulandırılmış kan için dakikada 44 mikrolitre perfüzyonu başlatın.

30 dakika boyunca her 10 saniyede bir gerçek zamanlı olarak görüntü kaydedin, 30 dakika sonra veya sinyal doygun hale geldiğinde pompaları ve görüntü alımını sonlandırın. Ardından, tüm boruları ve şırıngaları biyolojik olarak tehlikeli atık olarak atın. Bu video, trombosit trombüsünün birikmesine ve fibrin birikimine mükemmel bir örnek sunmaktadır.

Perfüzyonun başlangıcında, trombositler reaktif yüzeye yapıştı ve kaydedilen yeşil floresanda sabit bir artışa neden oldu. Bu yapışma aşaması sırasında, fibrinin sadece marjinal olarak oluştuğunu gösteren çok az mor floresan vardır. Pıhtılaşmanın başlaması üzerine, şiddetli floresan fibrin, trombosit yeşili floresansı yaklaşık aynı oranda birikerek hızla çöker.

Bu nedenle, bir pıhtılaşma başlangıç anı, trombosit prokoagülan potansiyelinin bir belirleyicisi olarak tahmin edilebilir. Sulandırılmış kana mısır tripsin inhibitörünün eklenmesi trombosit yapışmasını etkilemez, ancak pıhtılaşma perfüzyon deneyinin toplam süresi boyunca başlamaz. Sulandırılmış bir numunedeki trombosit sayısını artırarak, yapışma, birikim ve pıhtılaşma oranı doğrusal olarak artar.

Trombosit konsantrasyonunun arttırılmasıyla başlangıç anı önemli ölçüde kısalır, bu da pıhtılaşmayı tetiklemek için eşik sayıda aktive edilmiş birikmiş trombosit gerektiğini düşündürür. Ayrıca, sadece kollajen ile kaplanmış kanalların veya rekombinant lipidlenmiş doku faktörü ile kombinasyon halinde eşleştirilmiş bir analizinde, pıhtılaşma başlangıcı önemli ölçüde daha hızlıdır, ancak ne pıhtılaşmanın genel hızı ne de trombosit birikimi koşullar arasında farklı değildir. Bu videoyu izledikten sonra, trombosit fonksiyonu ve pıhtılaşmanın eşzamanlı analizi için çift etiketli sulandırılmış kanla bir mikroakışkan akış odası deneyinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, transfüzyon tıbbı alanındaki araştırmacıların trombositler ve akış altındaki pıhtılaşma arasındaki etkileşimleri keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoda, standartlaştırılmış bir deneyi göstermeye odaklandık. Ancak, ilgilenilen belirli araştırma sorularını yanıtlamak için yüzey kaplamasında, kalkan gerilmelerinde veya kalsiyum konsantrasyonunda değişiklikler yapılabilir.