Golgi-Cox Yöntemiyle Kalın Beyin Bölümler içinde Görüntüleme Nöronlar

Bu prosedürün genel amacı, kemirgen beynindeki nöronların morfolojisi üzerinde etkili tedaviyi belirlemektir. Bu yöntem, kemirgen beyninin çeşitli bölgelerindeki nöronların normal ve deneysel olarak manipüle edilmiş morfolojisi gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, tek histolojik numunelerde tamamen bulunan etiketli nöronları tanımlama ve görselleştirme olasılığını artırmanın ana avantajına sahiptir.

17 mililitre Golgi-Cox solüsyonu içeren 20 mililitrelik bir cam parıldama şişesine taze bir fare beyni yerleştirerek Golgi-Cox boyamaya başlayın. Işıktan koruyun ve 25 gün boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Kuluçka süresi geçtikten sonra, Cryo beyni 40 mililitre sükroz kriyoprotektan içine yerleştirerek korur ve karanlıkta 4 santigrat derecede 24 saat inkübe eder.

Sükrozdaki inkübasyondan sonra, beyin uzun süreli depolama için dondurulabilir veya videonun bir sonraki bölümünde gösterildiği gibi bölümlere ayrılmak üzere hemen bloke edilebilir. Donuyorsa, tüm beyni kuru buz üzerinde önceden soğutulmuş 200 mililitre izopentan içine daldırın. Daha sonra donmuş beyni 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve karanlıkta eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Başlamak için beyni sakarozdan çıkarın. Ve beyinciği keserek ve beynin kalan kuyruk ucunda düz bir kenar bırakarak bölümlere ayrılmasını engellemek için bir tıraş bıçağı kullanın. İlgilenilen nöronların ortaya çıkan bölümler içinde tam olarak yer almasını sağlamak için beynin kesin bir açıyla bloke edilmesi gerekir.

Örneğin, serebral korteks piramidal nöronlar için rostral kaudal eksene mükemmel bir şekilde dik olan bir koronal düzlem kullanıyoruz. Ardından, agarı eriyene kadar ısıtın. Ve erime noktasının biraz üzerine çıkana kadar soğumaya bırakın.

Ardından beyni, kuyruk ucu aşağı bakacak şekilde küçük, tek kullanımlık bir tartı kabına yerleştirin. Beyni kaplamak için eritilmiş agar ekleyin. Agar katılaştıktan sonra, beyni çevreleyen yaklaşık iki ila dört mililitre bırakarak fazlalığı kesin.

Daha sonra beyni kaudal ucu aşağı bakacak şekilde bir vibratom aşamasına yapıştırmak için az miktarda etil siyanoakrilat kullanın. Vibratomun sahne alanını beyni kaplayacak kadar sükroz kriyoprotektan ile doldurun. Daha sonra beyni, incelenecek beyin bölgesine bağlı olarak 400 ila 500 mikronluk bir dilim kalınlığında bölümlere ayırın.

Küçük bir boya fırçası kullanarak, beyin bölümlerini, ağ tabanlı ekler içeren ve önceden sakaroz M fosfat tamponu ile doldurulmuş altı kuyulu bir doku kültürü plakasının kuyularına yerleştirin. Kesit alma sırasında ışıktan koruyun. Kesitleme bittiğinde, bölümleri karanlıkta gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Ağ alt eklerini kullanarak, beyin bölümlerini fosfat tamponunda beş mililitre paraformaldehit içeren yeni bir kuyuya aktarın. Karanlıkta oda sıcaklığında yavaş hızda hareket eden bir külbütör üzerinde 15 dakika inkübe edin. Bölümleri beş mililitre su içeren yeni kuyulara aktararak iki kez yıkayın.

Işıktan koruyun ve oda sıcaklığında orta hızda beş dakika yıkayın. Daha sonra, bölümleri beş mililitre amonyum hidroksit içeren yeni bir kuyuya aktarın. Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika yavaşça sallayın.

Bölümleri beş mililitre su içeren yeni kuyulara aktararak iki kez yıkayın. Karanlıkta orta hızda hareket eden bir külbütör üzerinde oda sıcaklığında beş dakika yıkayın. Bölümleri, beş mililitre seyreltilmiş fiksatif A içeren yeni bir kuyucuğa aktarın. Karanlıkta yavaş hızda hareket eden bir külbütör üzerinde 25 dakika boyunca inkübe edin.

Bölümleri daha önce olduğu gibi iki kez suda yıkayın. Bölümleri bir mikroskop lamına yerleştirmek için küçük bir boya fırçası kullanın, ardından fazla suyu ve agarı çıkarmak için cımbız ve küçük bir mendil kullanın. Dehidrasyon adımlarına devam etmeden önce tüm agarın çıkarıldığından emin olun.

Bölümlerin ışıktan korunarak oda sıcaklığında kurumasına izin verin. Uygun kuruma süresi kritiktir ve her laboratuvar için belirlenmelidir. Çok kısa bir süre, dehidrasyon adımları sırasında bölümlerin slaytlardan düşmesine neden olabilir ve çok uzun bir süre bölümlerin çatlamasına neden olabilir.

Kuruduktan sonra, slaytları önce beş dakika boyunca temizleme maddesine yerleştirin. Slaytları beş dakika boyunca% 100 etanol içine yerleştirin. Ardından, her biri iki dakika boyunca bir dizi azalan etanol konsantrasyonundan geçin.

Alkol serisinden sonra, slaytları beş dakika boyunca suya koyun. Daha sonra yedi dakika boyunca suda% 0,5 kresil menekşe ile boyayın. Kresil menekşe lekesini takiben slaytları iki dakika suda bekletin.

Ardından, her biri iki dakika boyunca bir dizi artan alkol konsantrasyonu ile bölümleri kurutun. Daha sonra iki% 100 etanolde beş dakika yıkayın. Temizleme maddesine beş dakika boyunca yerleştirin.

Son olarak, susuz bir montaj ortamı ekleyin ve bölümlerin üzerine bir kapak fişi yerleştirin. Slaytların karanlıkta oda sıcaklığında en az beş gün boyunca yatay olarak kurumasına izin verin. İlgilenilen nöronu içeren alanın yüksek çözünürlüklü görüntü yığınlarını yakalamak için, önce mikroskopta 30X 1.05 NA silikon yağına daldırma objektifi seçin.

Ardından slayta üç ila dört damla silikon daldırma yağı uygulayın. Objektifi sürgünün üzerine yerleştirin ve objektif ile yağ arasındaki teması sağlayın. Görüntüyü odaklayın ve görüntüleme yazılımında pozlama ve beyaz dengesi dahil olmak üzere kamera ayarlarını yapın.

Ardından, bölümün en üstüne odaklanarak görüntü yığınının üst ve alt sınırlarını ayarlayın ve ardından görüntü alma penceresinde yığının üst kısmının yanındaki ayarla'yı seçin. Ardından bölümün en altına odaklanın ve yığının en altına yanındaki ayarla'yı seçin. Görüntü alma penceresindeki görüntüler arasındaki mesafenin yanına bir mikron girerek adım mesafesini bir mikron olarak ayarlayın.

Son olarak, görüntü alma penceresinde görüntü yığını al'ı seçerek görüntü yığınını yakalayın. Tüm görüntü yığınlarının X ve Y eksenlerinde en az %10 oranında örtüştüğünden emin olarak tüm ilgi alanını yakalamak için önceki adımları tekrarlayın. Serebral korteksin bu görüntüsü, 10X objektif kullanılarak 500 mikron kalınlığındaki bir bölümden elde edilen görüntü yığınlarının birleştirilmiş bir Z projeksiyonudur.

Bu görüntüdeki doku, ana tamamen taze protokol kullanılarak işlendi. Kırmızı kare ile gösterilen alan, 30X silikon yağına daldırma objektifi kullanılarak görüntülendi ve daha yüksek çözünürlüklü birleştirilmiş bir Z projeksiyon görüntü yığını elde edildi. Kırmızı ok, yüksek çözünürlüklü 30X görüntü yığınından izlenen bir nöronun iki boyutlu Z projeksiyonunu gösterir.

Burada kresil menekşe boyamalı taze protokol varyantı kullanıldı. Bu daha yüksek çözünürlüklü görüntü, kresil menekşe lekeli bölümü göstermektedir. Ve bu elde edilen nöron izlemesi.

Son olarak, bu doku, Golgi-Cox emprenye işleminden sonra beyinlerin dondurulduğu protokol varyantı kullanılarak işlendi. Burada daha önce dondurulan doku daha yüksek çözünürlükte görülür. Ve bir kez daha, nöron izlemenin yüksek kaliteli iki boyutlu Z projeksiyonu elde edilir.

Bu teknik bir ay içinde tamamlanabilir ve son bir hafta içinde tamamlanan işlem ve görüntüleme aşamaları ile tamamlanabilir. Golgi-Cox emprenye işleminden sonra beyinler alternatif olarak dondurulabilir, bu da işleme ve görüntülemenin daha sonraki bir tarihte tamamlanmasına olanak tanır. Bu prosedürü takiben, sinirbilimciler, deneysel bir manipülasyonun beyindeki nöronların yapısını nasıl değiştirebileceğini belirlemek için dendrit karmaşıklığı veya omurga yoğunluğu gibi ayrıntılı morfolojik analizler yapmak için yakalanan görüntüleri kullanabilirler.