Organotypic Hipokampal dilim kültürler çalışma Neuroprotection ve tümör hücrelerinin Invasiveness Model olarak

Vibratom ile hazırlama ve dilimleme. Dilimleme prosedürü sırasında beyni stabilize etmek için üç agar blok gereklidir. Kontaminasyonu önlemek için Otoklavlanmış bir alet seti kullanın.

Agarı uzaklaştırın. Metal plakaya tıbbi Siyanoakrilat yapıştırıcı ile yapıştırılmadan önce filtre kağıdı üzerinde kurutulmalıdır. Bir spatula yardımıyla beyni çıkarın ve dikkatlice hazırlama ortamı ile doldurulmuş Petri kabına yerleştirin.

Ardından, beyni filtre kağıdı üzerinde kısa süreyle kurulayın. Metal plakayı tıbbi Siyanoakrilat yapıştırıcı ile kaplayın. Beyni numune tutucuya yerleştirmek için pens ve spatulayı kullanın.

Her iki yandan mekanik stabilite sağlamak için önceden hazırlanmış iki parça agarı kullanın. Bu noktada, dilimleme sırasında hasarı önlemek için beyin, agar bloğunun yanına yerleştirilmeli ve iki ek blokla sabitlenmelidir. Metal plakayı vibratoma yerleştirin ve dokuyu soğuk hazırlama ortamı ile kaplayın.

Ardından, dokuyu kayar vibratom kullanarak 350 micrometers kalınlığında OHSC şeklinde yatay olarak diseke edin. Kesitleri toplamak için kırık bir Pasteur pipetinin arkasını kullanarak kesitleri Petri kabına aktarın. Beyin kesitlerini soğuk hazırlama ortamında tutun.

Kesitleri binoküler mikroskop altında optik olarak değerlendirin. Hipokampal bölgeyi ayırın ve 15 numara yuvarlak uçlu bir bistüri kullanarak iç kortekse girin. Dorsal ve ventral hipokampus arasındaki hipokampusun orta kısmından izole edilen, sadece sağlam cytoarchitecture yapısına sahip kesitlerin alınması önemlidir.

Düşük kaliteli OHSC'ler derhal atılmalıdır. Elde edilen kesitlerden ikisini veya üçünü, 0,4 mikrometre gözenek boyutuna sahip bir hücre kültürü insertine aktarın. Bir Pasteur pipeti kullanarak hücre kültürü insertinin üst kısmındaki hazırlama ortamını aspire edin.

İnserti, her kuyucukta bir milimetre kültür ortamı içeren altı kuyucuklu bir kültür plağına yerleştirin. Altı kuyucuklu plakları, %5 CO2 içeren tam nemlendirilmiş bir atmosferde 35 °C'de inkübe edin ve hücre kültür ortamını iki günde bir değiştirin. Sıçan dokusu için kültürde altı gün, fare dokusu için ise 14 gün geçtikten sonra, dilimleme işleminin kendisiyle ilişkili inflamatuar reaksiyonlar ortadan kalkmış olacaktır.

Deneyler artık yürütülebilir. Nöroproteksiyon çalışmaları için temsili sonuçlar. Görüntü A bölümü, kontrol dilimleri olarak hizmet eden, herhangi bir işlem uygulanmadan dokuz gün boyunca in vitro kültür ortamında tutulan lezyonsuz OHSC'leri göstermektedir.

Konfokal lazer taramalı mikroskopi ile doğrulandığı üzere, kontrol OHSC iyi nöronal koruma göstermiştir. İzolektin B4 pozitif mikroglial hücreler temel olarak moleküler ve pleksiform tabakalarda yerleşmişti ve dallanmış bir fenotip sergilemekteydi. Dentat girusun granüler hücre tabakasında, yalnızca çok az sayıda İzolektin B4 pozitif mikroglial hücre ve neredeyse hiç Propidium Iodide pozitif çekirdek bulunmamıştır.

Görüntünün B bölümünde gösterilen bir diğer OHSC seti, altı gün boyunca kültür ortamında tutulmuş, dört saat boyunca 50 micromolar NMDA ile lezyonlanmış ve ardından üç gün daha kültür ortamında bekletilmiştir. NMDA lezyonundan sonra, dentate gyrus'un tüm katmanları boyunca, nöronal hasar bölgesine aktive olmuş Isolectin B4 pozitif mikroglial hücrelerin yoğun bir birikimi yapışmıştır.

Kantitatif analizler, dentat girusun granüler hücre tabakasında, lezyonlu OHSC'deki Isolectin B4 pozitif mikroglial hücre sayısının kontrol koşullarına kıyasla daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Benzer şekilde, NMDA lezyonlu kesitlerin granüler hücre tabakasında Propidium Iodide pozitif dejenere olan nöron sayısı güçlü bir şekilde artış göstermiştir. Tümör invazyon çalışmaları için örnek sonuçlar.

Tüm görüntüler, konfokal lazer taramalı mikroskopla görüntülenen OHSC kullanılarak gerçekleştirilen tümör invazyonu SS sonuçlarını göstermektedir. Kırmızı renk OHSC'nin sitomimarini, yeşil renk ise tümör hücrelerini etiketlemektedir. Görüntü A, dört gün boyunca invaze olmasına izin verilen U138 glioblastoma hücreleri için tipik bir invazyon paternini göstermektedir.

Berrak, küresel ve belirgin tümörler gözlemlenebilir ve OHSC yapısı, açıkça görülebilen dentate gyrus ve Cornu Ammonis ile birlikte bozulmamış görünmektedir. Görüntü B, dört gün sonra LN229 glioblastoma hücreleri tarafından oluşturulan farklı bir invazyon paternini göstermektedir. Bu durumda, cytoarchitecture, deforme olmamış dentate gyrus ve Cornu Ammonis ile birlikte bozulmamış kalsa da, OHSC'nin büyük bir kısmını kaplayan ağ yapısı nedeniyle tekil tümörler net bir şekilde ayırt edilememektedir.

Ayrıca, LN229 hücrelerinin U138 hücrelerinden daha invaziv olduğu sonucuna varılabilir. Görüntü C ve D, dört günlük invazyon süresi sonrası LN229 hücreleri için aynı tümör invazyon sonucunu göstermektedir. Sol tarafta, tümör kitlesinin görüş alanının neredeyse tamamını kapladığı gözlemlenebilir.

Görüntü D, karşılık gelen Propidium Iodide boyamasını göstermektedir. Bu lamda, Cornu Ammonis artık görünmediği ve dentate gyrus da deforme olduğu için cytoarchitecture artık bozulmuştur. Böyle bir sonucun olası nedeni, deneyin başlangıcında tam olarak sağlam olmayan bir OHSC, uygulanan tümör hücre sayısının çok yüksek olması veya gözlemlenen yapı kaybına yol açan çok uzun bir invazyon süresi olabilir.

Bu nedenle, bu tür invazyon sonuçları göz ardı edilmelidir. Organotipik hipokampal dilim kültürleri, bozulmamış nöronal bağlantılarla beyin fizyolojisini yansıtan çok iyi bir in vitro model teşkil eder. Tek bir model olarak, birden fazla dilim kültürü elde edilebildiğinden, tek bir hayvandan alınan dokuda çok sayıda koşulun test edilmesine olanak tanır ve sonuçlar yüksek düzeyde tekrarlanabilirdir.

Yüksek erişilebilirlik derecesi nedeniyle, organotipik hipokampal dilim kültürleri çok sayıda deney tipi için mükemmel düzeyde uygundur. Buna elektrofizyolojik ve nörojenez çalışmalarıyla birlikte, nöroproteksiyon, tümör invazyonu ve tümör hücrelerinin sağlıklı beyin dokusuyla etkileşimleri üzerine yapılan deneyler de dahildir.