Rekombinant α-β ve γ Synucleins Protein fosfataz 2A katalitik alt birim faaliyet hücre ücretsiz deneyleri teşvik

Rekombinant alfa, beta ve gama sinükleinler, hücre dışı analizlerde protein fosfataz 2A katalitik alt birim aktivitesini stimüle eder. Merhaba, benim adım Sovanarak Lek. Texas Tech University Health Sciences Center, El Paso, Paul L. Foster School of Medicine'da tıp öğrencisiyim.

Bu videoda, rekombinant sinüklein proteinleri kullanarak protein fosfataz iki yönlü kolorimetrik analizini gerçekleştireceğim. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması. p-Nitrofenol Fosfat Tamponunun hazırlanması.

50 ml pNPP tamponu hazırlamak için, bir beher içinde 25 ml ultra saf deiyonize suya Trizma bazını ekleyip çözün. Temiz bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin ve manyetik karıştırıcıya yerleştirin. Trizma çözündükten sonra, karıştırmaya devam ederek kalsiyum klorür ekleyin.

pH değerini 7,0'a ayarlayın. Çözeltiyi dereceli bir silindire aktarın. Ultrapure deiyonize su ile nihai toplam hacmi 50 ml'ye tamamlayın.

Malahit yeşili çözeltisinin hazırlanması. Malahit yeşili çözeltisi için A, B ve C olmak üzere üç çözelti gereklidir. Çözelti A, dört molar hidroklorik asittir. Çözelti B, amonyum molibdat ile çözelti A'nın bir karışımıdır. Çözelti C, %0,045'lik malahit yeşili oksalat tuzudur.

Çözelti D'yi hazırlamak için, bir birim B'yi üç birim C ile bire üç oranında karıştırın. Oda sıcaklığında bir saat boyunca karıştırın. Son olarak, çözelti D'yi 22 µm'lik bir membrandan süzün ve 4 °C'de saklayın.

Işıktan koruyunuz. Aktivatörün hazırlanması. Aktivatör, yüzde bir Tween 20 çözeltisidir.

990 µL ultrapurle deiyonize su içine 10 µL Tween 20 pipetleyin. Tween 20 tamamen çözünene kadar vorteksleyin. Malahit yeşili artı Tween 20 çalışma çözeltisinin hazırlanması.

Aktivatörü çözüm D'ye 1:100 oranında ekleyin. Treonin fosfopeptit hazırlığı. İki mM pT stok çözeltisi hazırlamak için, bir miligram pT'ye 550 µL ultra saf deiyonize su ekleyin.

Fosfopeptit tamamen çözünene kadar vorteksleyin. Hemen kullanmak üzere buza yerleştirin. Fazla pT alikotlarını -20 °C'de saklayın.

Sinüklein hazırlama. Bir miligram sinükleini, nihai konsantrasyonu bir miligram/mil olacak şekilde mil ultrapure deiyonize su içerisinde yeniden süspande edin. Çözünmesi için hafifçe vorteksleyin.

Hemen kullanın ve kullanılmayan alikotları -80 °C'de saklayın. Fosfat standartlarının hazırlanması. Fosfat standartları birinci adım.

1 mM fosfat stok çözeltisi hazırlamak için, potasyum fosfatı bir beher içinde manyetik karıştırıcı yardımıyla ultra saf deiyonize su içerisinde çözün. Karışımı dereceli silindire aktarın ve son hacmi 100 mL'ye tamamlayın. Bu, 10 mM'lık bir çözeltidir.

Tüm çözeltiyi, büyük bir şırınga kullanarak 22 µm'lik bir filtreden süzün. Analiz standartlarında kullanılacak 1 mM fosfat çözeltisini hazırlamak için bunu 1:100 oranında seyreltin. Fosfat standartları ikinci adım.

Tabloya göre, uygun miktarda fosfatı ve ultrapure deiyonize suyu 1,5 ml'lik tüplere ekleyin. Bu işlem sonucunda 150, 300, 600, 1.200 ve 2.400 pmol fosfat içeren tüpler elde edilecektir. Alikotları -20 °C'de saklayın.

PP2A aktivite testi. PP2A testini buz üzerinde 1,5 mil tüplerde hazırlayın. 43 µL pNPP tamponu ekleyin.

Bir mikrolitre insan rekombinant PP2Ac ekleyin. Sinüklein ekleyin ve PP2A ile sinükleini bir Nutator üzerinde dört derece Celsius'ta 30 dakika inkübe edin. Ardından, 16 mikrolitre 2mM pT ekleyin.

Su banyosunda 30 °C'de 10 dakika inkübe edin. Düz tabanlı bir 96 kuyucuklu plakaya, her bir fosfat standardından düşükten yükseğe doğru duble şeklinde 25 µL ekleyin. Standartların bulunduğu aynı 96 kuyucuklu plakaya, her bir PP2A analizinden duble şeklinde 24 µL pipetleyin.

Her örneğe ve standarda Tween 20 içeren 75 µL çözelti D pipetleyin. MGT eklendiğinde, serbest fosfatların bulunduğu kuyucuklarda renk değişimi gözlemlenecektir. Fotometrik analiz.

630 nanometreye ayarlanmış bir spektrofotometre ile analiz edin. Temsili sonuçlar. Burada temsili bir PP2A analizi ve standart eğriyi gösteren grafik yer almaktadır.

Solda fosfat standartları yer almaktadır. Kuyucuklar ne kadar fazla fosfat içerirse, yeşil tonu o kadar koyulaşır. Sağda ise farklı molar konsantrasyonlardaki alfa, beta veya gama sinükleinlerle inkübe edilmiş PP2A bulunmaktadır.

Daha yüksek konsantrasyonlar, PP2A katalitik alt birim aktivitesini stimüle etmede daha etkili olmuştur. Burada, değişken alfa sinüklein, beta sinüklein ve gamma sinüklein konsantrasyonlarına yanıt olarak PP2A aktivitesinin grafiksel gösterimini görüyoruz. Alfa sinüklein, beta sinüklein ve gamma sinükleinin tümü, bir ila iki mikromolar konsantrasyonda PP2A aktivitesinin anlamlı stimülatörleri olmuştur.

Sadece alfa sinüklein ve beta sinüklein, 0,5 µM konsantrasyonda PP2A aktivitesinin anlamlı stimülatörleriydi. Şekil üç, fare beynindeki endojen sinükleinlerin PP2Ac ile etkileşimini göstermektedir. A'da, rekombinant alfa, beta ve gamma sinükleinler pozitif kontroller olarak gösterilmiştir.

B'de, PP2Ac'ye özgü 1D6 antikoru kullanılarak ko-immünopresipitasyon yapılmış olup; bu işlem PP2Ac'yi ve beraberinde önemli miktarda etkileşim halindeki alfa sinükleini çöktürmüş, ancak beta sinükleini neredeyse hiç çöktürmemiştir. Ko-immünopresipitasyonda PP2Ac ile birlikte hiç gama sinükleini çökmemiştir. Bu ko-immünopresipitasyon verileri, alfa sinükleinin in vivo ortamda PP2Ac'nin endojen modülatörü olduğunu göstermektedir.

Bu videoyu hazırlamamıza yardımcı olan herkese teşekkür etmek istiyoruz. Sonuç olarak, bunlar Ruth Perez ve Sonavarak Lek.

Javier Vargas. Size büyük başarılar dilerim. Hoşça kalın ve bol şans.