Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

Burada, in vitro deneyler için doğum sonrası fare yavrularından mikroglia izole etmek için bir protokol (gün 1) sunulmuştur. izolasyon Bu doğaçlama yöntem hem de yüksek verim ve saflıkta, mikroglial biyoloji açıklık amacıyla geniş bir aralık deney sağlar alternatif yöntemler üzerinde önemli bir avantaj oluşturur.

CD11b manyetik mikroglia izolasyonunun genel amacı, çok yönlü in vitro deney amacıyla nispeten kısa bir süre içinde yüksek saflıkta bir doğum sonrası mikroglia son verimi elde etmektir. Bu yöntem, nöral inflamasyonla ilgili sinyal mekanizmaları gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin şu anda mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, izolasyonun saflık, verim veya canlılıktan ödün vermeden yaklaşık 30 dakika sürmesidir.

Bir ila iki günlük fare yavrularından yeni kesilmiş kafaları laminer bir hava akımı başlığına aktararak başlayın. Ardından, kafatasında ve meninkslerde küçük bir kesi yapmak için 4,5 inçlik düz mikro diseksiyon makası kullanın, uçları dekapitasyonun oluşturduğu açıklığa sokarak ve kaudali rostral olarak keserek. Kesi yaptıktan sonra, yarım kürelerden birini yana doğru soyun.

Ardından tüm beyni çıkarmak için bir çift kavisli veya kancalı cımbız kullanın. Beyni, iki mililitre% 0.25 tripsin EDTA içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 37 derecelik bir su banyosunda 15 dakika inkübe edin. Beyni, ortamı ekleyip çıkararak taze büyüme ortamı ile yıkayın.

Yıkamaların tamamlanmasından sonra, beyin başına iki mililitre büyüme ortamı ekleyin ve beyni ezerek homojenize edin. Beyin dokusu küçülmediğinde, daha küçük bir diyafram açıklığına sahip bir pipete geçin. Öğütmenin sonunda, süspansiyon görünür parçalar olmadan berrak olduğunda, tek bir hücre kültürü oluşturmak için süspansiyonu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin.

Daha sonra, sekiz ila dokuz mililitre büyüme ortamını, beyin başına iki şişe olmak üzere T75 şişelerine pipetleyin ve her şişeye mililitre beyin homojenatı ekleyin. On altıncı günde izolasyona kadar hücreleri büyütün. On altı gün sonra, büyüme ortamını şişeden 50 mililitrelik taze bir tüpe aktarın.

Her T75 şişesine üç mililitre% 0.25 tripsin EDTA ekleyin. Daha sonra şişeleri bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında beş dakika çalkalayın. Büyüme ortamını beş dakika boyunca 0.4 kez g'de santrifüjleyin.

Beş dakika çalkaladıktan sonra, tripsin EDTA reaksiyonunu durdurmak için en az dört mililitre santrifüjlenmiş kültür ortamı ekleyin ve tüm hücrelerin ayrıldığından emin olmak için ezin. Daha sonra tek bir hücre kültürü oluşturmak için hücreleri 70 mikromolar hücre süzgecinden geçirin. Bir hücre sayımı yapın ve ardından beş dakika boyunca 0,4 kez g'de döndürün.

Ardından, beş mililitrelik bir polistiren tüp alın, önerilen ortamdan bir mililitre ekleyin ve menisküsü işaretleyin. 2,5 mililitreye kadar önerilen ortamı ekleyin ve bu menisküsü de işaretleyin. Ardından, ortamı çıkarın ve peleti 500 mikrolitre önerilen ortamda yeniden askıya alın.

Bu karışımı beş mililitrelik bir polistiren tüpe aktarın ve ardından bir mililitre işaretine kadar seyreltin. Daha sonra her bir mililitre askıya alınmış hücre için 50 mikrolitre sıçan serumu ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Kuluçka sırasında, 25 mikrolitre A bileşeni ve 25 mikrolitre B bileşenini karıştırarak seçim kokteylini hazırlayın.Beş dakika geçtikten sonra, hücrelere 50 mikrolitre seçim kokteyli ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika daha inkübe edin.

Mikro küreleri 45 saniye boyunca girdaplayın. Daha sonra bir mililitre numune başına 80 mikrolitre mikroküre ekleyin ve oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. Ardından, polistiren tüp üzerindeki 2,5 mililitre işaretine kadar önerilen ortamı ekleyin.

Tüpü oda sıcaklığında üç dakika boyunca manyetik tutucuya koyun. İnkübasyondan sonra, ortamı yavaşça mıknatısta bulunan 15 mililitrelik bir polistiren tüpe dökün. Manyetik ayırmayı üç kez daha tekrarlayın, her seferinde 2,5 mililitre işaretine kadar önerilen ortamı ekleyin.

Son manyetik ayırma işleminden sonra, üç mililitre büyüme ortamı ekleyin ve bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın. Tedaviler için hücreleri poli-D-lizin kaplı plakalarda kaplayın. Çoğunlukla astrositler içeren 15 mililitrelik tüpten gelen negatif fraksiyonu T75 şişelerinde plakalayın.

37 derecelik bir inkübatörde en az altı saatlik inkübasyondan sonra, inkübatöre geri dönmeden önce negatif fraksiyonu içeren şişelerdeki tüm büyüme ortamını değiştirin. Bu görüntü, yeşil kanalda bir mikroglia belirteci olan IBA ve kırmızı kanalda astrositlerin bir belirteci olan GFAP için araştırılan izole bir mikroglial kültürün immünositokimyasını göstermektedir. Hoechst boyama, hücre çekirdeğinin varlığını ortaya çıkarır.

GFAP pozitif hücrelerin yokluğu, CD11b pozitif seçim kiti kullanılarak izole edilen mikrogliaların da yüksek saflığa sahip olduğunu göstermektedir. İzole edilmiş bir mikroglial kültürden alınan bu immünoblotlanmış proteinler, yaklaşık 51 kilodaltonluk bir bant olarak görünen GFAP ve yaklaşık 15 kilodaltonluk bir bant olarak görünen IBA1 için araştırıldı. Beta-aktin bir yükleme kontrolü olarak kullanıldı ve yaklaşık 42 kilodaltonda görünüyor.

Eski izolasyon kitiyle ilgili bir sorun, burada görüldüğü gibi kırmızı kanalda PE floresansının gözlemlenebilmesiydi. Modifiye edilmiş prosedür, buradaki kırmızı kanalda görüldüğü gibi manyetik boncuklardan herhangi bir otomatik floresan üretmez. Bu prosedür kullanılarak izole edilen mikroglia, sinyalizasyon çalışmaları için kullanılabilir.

Western blot analizi, Fyn ve fosfo-src tirozin Y416'nın yeni rafine edilmiş yöntemimizle izole edilen mikrogliadan tespit edilebileceğini göstermektedir. Mikroglial ayrılmadan elde edilen negatif fraksiyon, sinyalizasyon çalışmaları için kullanılabilecek astrositleri içerir. Western blotlama, negatif fraksiyonun GFAP pozitif hücreler içerdiğini gösterir.

Western blot analizi, Fyn ve fosfo-src tirozin Y416'nın GFAP pozitif hücrelerden tespit edilebileceğini göstermektedir. Bu prosedürü takiben, gen ekspresyonu ve protein sinyalizasyonu ile ilgili soruları yanıtlamak için çok kanallı floresan mikroskobu, western blotlama ve kantitatif PCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bu hızlı izolasyon tekniğinin mikroglial deney amacıyla nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.