Kromatin kompleksleri değiştirme özelliklerini bağlama toplu Kromatin analizi için sıralı tuz çekimi
2 Ekim 2017
Tuz çıkarımı sıralı bağlı Kromatin proteinleri büyük protein kompleksleri bağlama özelliklerini belirlemek için yararlı bir araçtır. Bu yöntem tek tek alt birimleri veya etki alanlarında bulunan genel benzeşme Kromatin toplu olarak karmaşık bir proteinin rolü değerlendirmek için istihdam edilebilir.
Sıralı Tuz Ekstraksiyonu prosedürünün genel amacı, protein bağlanma profillerini toplu kromatine karakterize etmek ve protein veya çevresi manipüle edildiğinde bağlanmanın nasıl değiştiğini değerlendirmektir. Bu yöntem, epigenetik düzenleyicilerin kromatine nispi afinitesini ölçer ve bu etkileşimlerin genetik, kimyasal ve çevresel manipülasyon üzerine nasıl değiştiğini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kromatin bağlayıcı proteinlerin bağlanma profillerini değerlendirmenin hızlı ve ucuz bir yolu olmasıdır.
Kromatin alanına yeni başlayan kişiler genellikle kromatin immünopresipitasyonu veya ChIP ile mücadele eder. Sıralı Tuz Ekstraksiyonu, deneyimsiz bilim adamlarının bile aynı soruların çoğunu cevaplamak için kullanabileceği eski bir tekniktir. Prosedüre başlamak için, ilgilenilen her hücre hattından 8.000.000 hücre toplayın.
Her hücre örneğini beş mililitre buz gibi PBS ile iki kez yıkayın. Her numuneyi ve bir mililitre hipotonik tamponu proteaz inhibitörleri ile yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonlarını 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
Süspansiyonları dört santigrat derecede 10 dakika boyunca yukarıdan aşağıya döndürün ve ardından süspansiyonu aynı sıcaklıkta 6.000 G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Bir mililitrelik uca sahip bir mikro pipet kullanın.
Peletlere proteaz inhibitörleri içeren 200 mikrolitre tuzsuz modifiye ripa tamponu ekleyin. Peleti uca çekmek için pipet ucunu mikrosantrifüj tüpünün altına vurun. Peleti 15 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
Pelet parçalandıkça numune kalınlaşmalı ve yapışkan hale gelmelidir. Her numuneyi bu şekilde homojenize edin ve numuneleri buz üzerinde üç dakika inkübe edin. Daha sonra numuneleri 6500 G'de dört santigrat derecede üç dakika santrifüjleyin.
Süpernatanları 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerini temizlemek için aktarın. Her pelete, 100 milimolar sodyum klorür ve proteaz inhibitörleri ile 200 mililitre modifiye ripa tamponu ekleyin. Peleti 15 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
Peletin başlangıçta pipet ucuna çekilmesi zorsa, tüpün altındaki uca hafifçe vurun. Her numune için bu işlemi tekrarlayın ve numuneleri buz üzerinde üç dakika inkübe edin. Numuneleri 6500 G'de dört santigrat derecede üç dakika santrifüjleyin.
Süpernatanları yeni 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Numuneleri, artan sodyum klorür konsantrasyonları ile modifiye edilmiş ripa tampon çözeltilerine çıkarmaya devam edin. Pelet artık tüpün dibinde kalmadığında, süpernatanı boşaltmadan önce peleti santrifüj tüpü kapağına yerleştirin.
Seri tuz ekstraksiyonundan sonra, her numune için, beş süpernatan fraksiyonun her birine 70 mililitre dört kez protein yükleme boyası ekleyin. Her fraksiyondan 30 mikrolitre bir SDS akrilamid jel üzerine yükleyin. Proteinleri bir zara aktararak ve uygun primer antikorlarla boyayarak standart bir western blot gerçekleştirin.
Lekeyi kızılötesi boya ile etiketlenmiş ikincil antikorlarda inkübe edin ve lekeyi görüntüleyin. Her bir tuz konsantrasyonunun bant yoğunluğunu hesaplamak için görüntü analiz yazılımı kullanın. İlgilenilen proteinin elüsyon modelini belirlemek için bant yoğunluğunu tuz konsantrasyonuna karşı çizin.
ARID1a ve Polybromo 1 proteinlerinin Sıralı Tuz Ekstraksiyonu, sırasıyla 200 ve 300 milimolar tuz konsantrasyonları ile tutarlı elüsyon gösterdi. Aynı proteinlerin ardışık olmayan tuz ekstraksiyonu daha az tutarlı sonuçlar gösterdi. Kuluçka süresi, incelenen her protein için optimize edilmelidir.
Bu nedenle, değişen inkübasyon uzunluklarından sonra elüsyon profillerini incelemek için SSE kullanıldı. Bir transkripsiyonel aktivatör olan Polybromo 1, üç dakika ve 10 dakika boyunca inkübe edildiğinde benzer elüsyon profilleri gösterdi. BMI1 ile gösterilen transkripsiyonel baskılayıcı, Polycomb Repressive Complex 1, kromatinden salınması için üç dakikadan fazla süreye ihtiyaç duydu.
Elüsyon profillerindeki değişim incelenerek protein-protein etkileşimleri araştırılmıştır. Bir inhibitörün varlığında, protein dört içeren bromodomain, inhibitör içermeyenden daha düşük tuz konsantrasyonlarında ima edilir. Hücreler, kromatinin manzarasını değiştiren bir histon deasetilaz inhibitörü ile muamele edildiğinde histon desenlerinde farklılıklar gözlendi.
Hücreler genomik stres yaşadığında protein bağlanmasındaki değişiklikler de elüsyon profillerine yansımıştır. Burada, elüsyon için gerekli olan tuz konsantrasyonundaki artış, Polibromo 1'in Doksorubisin ile DNA hasarını takiben kromatine daha sıkı bağlandığını düşündürdü. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki ila üç saat içinde yapılabilir.
Bu prosedürü denerken, her bir numuneyi tedavi ederken mümkün olduğunca tutarlı olmayı unutmayın. Bu prosedür, bir kromatin bağlayıcı proteinin mekanizmasını ve regülasyonunu aydınlatmak için bir çalışmanın ilk adımlarında kullanılabilir. Bu, gereksiz genom çapında çalışmalarda zamandan ve paradan tasarruf sağlar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Sıralı Tuz Ekstraksiyonu prosedürü, proteinlerin dökme kromatine bağlanma profillerini karakterize etmek ve bu bağlanmaların çeşitli manipülasyonlarla nasıl değiştiğini değerlendirmek için tasarlanmıştır. Bu yöntem, epigenetik düzenleyicilerin kromatine olan afinitesini değerlendirmek için özellikle kullanışlıdır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kromatin biyolojisi
- Protein etkileşimleri
- Epigenetik
Arka Plan
- Ardışık Tuz Ekstraksiyonu, kromatin bağlayıcı proteinlerin incelenmesi için kullanılan bir tekniktir.
- Kromatin immünopresipitasyonuna (ChIP) hızlı ve düşük maliyetli bir alternatif sunar.
- Bu yöntem, deneyimsiz bilim insanları için bile erişilebilirdir.
- Protein etkileşimlerinin genetik, kimyasal ve çevresel faktörlerle nasıl değiştiğinin değerlendirilmesine olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Kromatin bağlayan proteinlerin bağlanma profillerini karakterize etmek.
- Çeşitli manipülasyonların protein bağlanması üzerindeki etkilerini değerlendirmek.
- Kromatin alanıyla uğraşan araştırmacılar için basit bir yöntem sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- İlgili her hücre hattından 8.000.000 hücrenin hasat edilmesi.
- Kromatine bağlı proteinleri izole etmek için ardışık tuz ekstraksiyonu.
- Proteinlerin kromatine bağlanma afinitesinin değerlendirilmesi.
- Farklı koşullar altında bağlanma profillerindeki değişimlerin incelenmesi.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, protein bağlanma profillerini etkili bir şekilde karakterize eder.
- Bağlanma afinitelerinin çevresel faktörlerle nasıl değiştirilebileceğini kanıtlar.
- Sonuçlar, bu tekniğin hem deneyimli hem de yeni başlayan araştırmacılar için kullanışlı olduğunu göstermektedir.
- Epigenetik düzenleyicilerin kromatin ile olan etkileşimlerine dair bilgiler sağlar.
Sonuçlar
- Sıralı Tuz Ekstraksiyonu, kromatin etkileşimlerini incelemek için değerli bir araçtır.
- Yöntem, çeşitli araştırma uygulamaları için verimli ve erişilebilirdir.
- Kromatin biyolojisindeki protein bağlanma dinamiklerinin anlaşılmasını geliştirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörle İlgili Yönetici Özeti
Ardışık Tuz Ekstraksiyonu (SSE), kromatin bağlayıcı protein afinitesini değerlendirmek için hızlı ve maliyet etkin bir yöntem sunarak, epigenetik odaklı ilaç keşfinde erken aşama hedef doğrulamasına olanak tanır. Genetik, kimyasal veya çevresel perturbasyonların protein-kromatin etkileşimlerini nasıl değiştirdiğini nicelleştiren SSE, kaynak yoğun analizlere geçmeden önce kromatin modifiye edici komplekslerin mekanistik risklerinin azaltılmasını destekler. Bu yaklaşım, doğrudan bağlanma etkilerini dolaylı hücresel yanıtlardan ayırarak, öncü bileşik tanımlamadaki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Kompleks alt birimleri kaybedildiğinde veya domainler inaktive edildiğinde meydana gelen göreceli bağlanma afinitesi değişikliklerini ölçerek, bireysel proteinlerin kromatin etkileşimine olan fonksiyonel katkılarını netleştirir.
- Bilimsel Değer: Spesifik kromatin bağlanmasını spesifik olmayan etkileşimlerden ayırt etmek için artan tuz konsantrasyonları altındaki elüsyon paternlerini profiller ve böylece hedef doğrulamadaki yanlış pozitifleri azaltır.
- Operasyonel Değer: Uzman olmayanların, özel ChIP uzmanlığına ihtiyaç duymadan kantitatif bağlanma verileri üretmesini sağlayarak erken aşama hipotez testlerini hızlandırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Kromatin ortamındaki değişiklikler üzerinde bileşik etkilerini taramak için kantitatif okumalar sağlayan, tekrarlanabilir elüsyon profilleri oluşturur.
- Operasyonel Değer: Standart western blot altyapısını ve görüntü analizini kullanarak laboratuvarlar arası analiz standardizasyonunu kolaylaştırır ve teknik değişkenliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Yalnızca temel santrifüj ve elektroforez ekipmanı gerektirerek, epigenetik modülatörlerin tarama süreçlerine uygulanma önündeki engelleri azaltır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Kromatin ortamındaki değişiklikleri (örneğin, HDAC inhibitörleri aracılığıyla) protein bağlanmasındaki değişimlerle ilişkilendirerek, hastalıkla ilgili sistemlerde biyobelirteçlerle uyumlu mekanistik çalışmaları destekler.
- Bilimsel Değer: Genomik stres (örneğin, doksorubisin kaynaklı DNA hasarı) altındaki bağlanma kaymalarını değerlendirerek, patofizyolojik koşullar altında hedef etkileşiminin öngörücü modellerine veri sağlar.
- Operasyonel Değer: Keşif aşamasından preklinik aşamalara kadar kromatin etkileşim sürekliliğinin ortogonal doğrulamasını sağlayarak hücreye dayalı ve biyokimyasal analizları tamamlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
SSE, hedef doğrulamadan öncü bileşik optimizasyonuna kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, epigenetik programlardaki biyokimyasal bağlanma analizleri ile hücresel fenotipik okumalar arasında mekanistik bir köprü sunar.
- Keşif Biyolojisi: Karmaşık değişikliklerin kromatin bağlanmasını nasıl etkilediğini nicelleştirerek hipotez testlerini destekler, böylece yolakların netleştirilmesine ve epigenetik hedeflerin biyolojik risklerinin azaltılmasına olanak tanır.
- Tarama: Farklı tarama kampanyaları boyunca bileşiklerin neden olduğu kromatin durum değişikliklerini karşılaştırmak için nicel çıktılar olarak tuz bağımlı elüsyon profilleri sunar.
- Analitik: Tuz konsantrasyonuna karşı çizilmiş bant yoğunluğu verileri oluşturarak, yapı-aktivite ilişkisi tartışmalarına temel teşkil eden hesaplanabilir bağlanma afinitesi kaymaları sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Fonksiyonel okumalarla birleştirildiğinde, in vitro bağlanma değişikliklerini hücresel kromatin manzara modifikasyonlarıyla ilişkilendirerek translasyonel biyobelirteç uyumunu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla kromatin hedefinde uygulanabilen standartlaştırılmış ve düşük maliyetli bir yetkinliği temsil ederek, epigenetik ilaç keşif süreçlerinde platformun yeniden kullanımını teşvik eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kontrollü tuz elüsyonu aracılığıyla doğrudan kromatin bağlanmasını dolaylı hücresel etkilerden ayırarak, hedef doğrulamadaki öngörüsel güveni artırır.
- Operasyonel Değer: Yaygın olarak bulunan laboratuvar ekipmanlarını kullanarak tekrarlanabilir, kantitatif bağlanma profilleri sunar ve ekipler arası standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Başlangıç bağlanma değerlendirmeleri için düşük kapasiteli ChIP'e olan bağımlılığı azaltarak, erken dönem epigenetik projelerindeki sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Kromatin modifiye edici kompleks hedeflerinin, çevresel perturbasyonlara karşı kantitatif bağlanma dirençlerine göre risk ayarlı önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Elüsyon profilinin doğru yorumlanmasını sağlamak için kromatin biyokimyası ve western blot kantifikasyonu konularında uzmanlık gerektirir.
- Soğutmalı santrifüjlere, mikrosantrifüj tüplerine ve standart SDS-PAGE/western blot cihazlarına erişime bağlıdır.
- Örnekler arasındaki değişkenliği en aza indirmek ve karşılaştırılabilir tuz ekstraksiyon sonuçları sağlamak için standartlaştırılmış hücre toplama ve lizis protokollerini gerektirir.
- Bağlanma salınım kinetiği kromatin modifiye edici kompleksler arasında farklılık gösterdiğinden, her hedef protein için inkübasyon sürelerinin optimizasyonunu içerir.
- Sadece göreli afinite karşılaştırmalarıyla sınırlıdır; mutlak bağlanma sabitleri doğrulanması için ortogonal biyofiziksel yöntemler gerektirir.
