Name: iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Öğrenin iPSC türetilmiş insan beyin organoidleri oluşturma yöntemini. Erken nörogelişimsel bozuklukları ve mikrosefaliyi modelleyerek nörogenez mekanizmalarını inceleyin. Hızlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Fritz Thyssen Vakfı (Az.10.14.2.152) tarafından desteklenmiştir. Biz doku gömme tesisi ve CMMC mikroskop çekirdek tesisine minnettarız. Biz Sentrozom ve Sitoiskelet Biyoloji Laboratuvarı üyeleri tarafından sunulan tartışmalar ve teknik destek için müteşekkiriz. Yazıları ve düzeltilmesi için Li Ming Gooi teşekkür ederim.

Beyin Organoids 1. Nesil (23 gün) <ol><li> Nöroektoderm başlatılması (5 gün) NOT: Aşağıdaki noktalar farklılaşma başlamadan önce düşünülmelidir. İnsan iPSCs elde etmek üzere yeniden programlama yöntemi (lentiviral- sendai-virüs- epizomal-, veya mikroRNA bazlı vs.), ideal hastada için aynı ve iPSC hatları kontrol edilmelidir. Çeşitli yeniden programlama kitleri ve yayınlanmış protokollere göre talimatları 15, 16, 17, 18 mevcuttur. İnsan iPSC hatlarının kalite optimal farklılaşma gerçekleştirmek için bir anahtardır. Bir mikroskop ile koloni ve hücre morfolojisi Monitör ve Oct3 / 4, Nanog veya TRA-1-60 Markerlerin ekspresyonunu test ederek pluripotensini doğrulamak. <ol><li> Engelbreth-Holm-Swarm ile kaplanmış bir tabak üzerinde kültür ortamı A içinde besleyici içermeyen koşullar altında kültür insan iPSCs(EHS) matris. Not: İnsan iPSCs büyütün besleyici içermeyen ve serumsuz tanımlanmış bir kültür muhafaza edilmesi için ve farklılaşma başlamadan önce fare embriyonik besleyici hücreler (MEF&#39;ler) çıkarılması için ek bir adım önlemek için. İnsan iPSCs için en uygun geçiş sayısı, toplam geçit 70 yeniden programlama üzerine geçit 15 farklılaşma aralığını başlatın. pasaj, yeni bir çanak agrega aktarmak için düşük mekanik stresle uygun bir hücre ayırma çözeltisi ve 2 ml serolojik pipet kullanarak agrega hücreleri gibi hiPSC koloniler ayırmak. bu en iPSC hatlarında farklılaşmayı ve apoptosis edilebileceği gibi tek hücrelere dissosiyasyonu kaçının. Uzun vadeli, tek-hücreli pasajlama insan iPSCs 19, 20 genomik değişiklik artırabilir olduğu bildirilmiştir. Bu iPSCs genel canlılığını azaltır, sıyrılma çözeltinin ayrılması için bir santrifüj aşamasını gerektirir hücre ayırma işlemleri, kaçının. Ölçekmikrobiyal kontaminasyonlarla, düzenli olarak özellikle mikoplazma, tüm kültürler bu iPSCs kalitesini ve bunların farklılaşma kapasitesinin değiştirmesi nedeniyle. <ol><li> Kaplama, üreticinin talimatlarına uygun olarak EHS matris ile bir 60 mm doku kültürü çanağı. </li><li> 1 x 10 6, insan iPSCs bir kısım çözülme. EHS matris içinde kaplandı ve ortam A 5 mL (Malzeme Tablo) ihtiva eden bir 60 mm doku kültürü çanağı içinde iPSCs Seed. Hücreler ~% 80 birleşmeye ulaştığında 5 ila 7 gün sonra günlük orta ve geçit değiştirin. Not: Geçiş farklılaşmasını başlamadan önce en az bir kez, örneğin koloni 21 enzim içermeyen ayrılması gibi standart yöntemler kullanılarak% 80 birleşme çözülmüş iPSCs. üreticinin aşağıdaki iPSCs Besin Karışımı F12 (DMEM / F12), ve inkübe: Kısaca, iPSC orta kaldırmak önceden ısıtılmış 37 ° C Dulbecco&#39;nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı ile bir kez yıkama hücreleriReaktif A kullanılarak talimatları (malzeme tabloya bakınız). Tek hücrelere ayrışma önlemek için tavsiye edilen inkübasyon süresi aşmayın. İnsan iPSCs müstakil ve agrega gibi tek değil hücreleri olarak yüzen edilmelidir. Daha sonra, yeni EHS matris kaplı tabaklara transfer edilebilir; örneğin, iPSC bir 60 mm çanak 4 yeni 60 mm&#39;lik tabaklara dağıtılabilir agrega. </li><li> üreticinin talimatlarına göre bir mikoplazma algılama kiti ile mikoplazma için kontrol edin. mikoplazma iPSCs farklılaşma yeteneğine değiştirebilir olarak, sadece mikoplazma içermeyen iPSCs kullanın. </li></ol></li><li> iPSCs (% 80 kaynaşık), ayrıştırmaları ve reaktif B ile tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak <ol><li> Önceden ısıtılmış (37 ° C), DMEM / F12 ile bir kez iPSCs yıkayın. </li><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika ve% 5 CO2 için iPSCs (60 mm tabak içinde, örneğin, 1 mL) önceden ısıtılmış reaktif B ilave edin ve inkübe edilir. </li><li> tarafında ve alt tarafında bir parmak ile Flick 20 katçanak iPSCs ayırmak için. Mikroskop altında hücrelerin dekolmanı kontrol edin. </li><li> 1 ml mikropipet ile tabak içinde yukarı ve aşağı 5 kez hücre süspansiyonu pipetle. </li><li> reaktif B 1 mL seyreltik ve 15-ml santrifüj tüpü içinde hücre süspansiyonu toplamak için ortam A 3 mL ekleyin. </li><li> Yavaşça oda sıcaklığında 4 dakika boyunca iPSCs (500 x g) aşağı doğru döndürün. </li><li> Ortam B&#39;de 1 mL hücre pelletini ve bir hemositometrede hücre sayısını. NOT: yeniden süspanse edilmesi için sadece orta B&#39;yi kullanarak farkında olun. Bu farklılaşmasını inhibe olabilir bFGF bir çok yüksek bir konsantrasyonda, olarak, ortam, bir kaçının. </li></ol></li><li> 10 uM rho-ilgili protein kinaz önleyicisi (Y-27632) ile desteklenmiş ortam B&#39;de ml başına 4.5 x 10 5 hücre hücre süspansiyonu seyreltin. </li><li> Bir yapışkan olmayan, V tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde, oyuk başına 100 uL ekleyin. NOT: emin olun hücreler eşit sus dağıtılır100 uL kısımları alınmadan önce tüpü her çalkalayarak pansiyon. Her bir boyut ve şekil (yuvarlak, oluşturulan yüzeylerin) içinde homojen nöroküreleri elde etmek üzere bir eşdeğer hücre sayısı içermelidir önemlidir. </li><li> Yavaşça 3 dakika boyunca 500 x g&#39;de oda sıcaklığında hücreler plaka aşağı spin ve 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 inkübe edin. </li><li> 50 mcL kaldırılması ve önümüzdeki 5 gün boyunca her kuyuya taze ortam B 50 mcL ekleyerek günlük orta değiştirin. </li></ol></li></ol> EHS Matrix 2. gömülmesi Neurospheres (4 gün) <ol><li> W / olmadan (100 (h / h) takviyesi 2: 200 (h / h) takviyesi 1, 1: 1: DMEM / F12 ve orta C (h / h), 1: 1 karışımı, aşağıdakileri karıştırarak neurosphere orta hazırlayın o) A vitamini, 1: 100, L-glutamin, 0.05 mM esansiyel olmayan amino asitler (MEM), 100 U / mL penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 1.6 g / L insülini, ve 0.05 mM β-merkaptoetanol. </li><li> Neurospheres espri toplayınha bir ~ 2 mm uç kullanılarak 200 uL mikropipet daha önce steril bir makas ile kesilmiştir. </li><li> Boş 100 mm tabak içinde yaklaşık 5 mm uzaklıkta parafin film (3 x 3 cm 2) üzerinde birbirinden nöroküreleri yerleştirin ve dikkatli bir sürede geri kalan ortam kadar çıkarın. </li><li> Her bir neurosphere üzerine EHS matrisinin bir damla (7 uL) ilave edilir. </li><li> EHS matris, bir kuluçka makinesi içinde 15 dakika için neurospheres ile damla inkübe edin. </li><li> neurosphere ortamla onları yıkanmak suretiyle parafin filmden dikkatle nöroküreleri yıkayın. temizlemek için, 1 ml mikropipet ve neurosphere ortamı 10 mL içeren yeni bir 100 mm Petri kabı kullanılır. </li><li> Sonraki 4 gün boyunca nöroküreleri inkübe ve 2 gün sonra, taze neurosphere orta 2 ml. NOT: EHS matris gömülmüş Neurospheres yemeğin bir tarafta yığın birlikte olmayacak şekilde kuluçka raflar düz olduğundan emin olun. </li></ol> Bir döner süspansiyon 3. OrganoidsKültür (14 Gün) <ol><li> 200 (h / h) takviyesi 1, 1: 100 (h / h) takviyesi 2 w / o 1: DMEM / F12 ve orta C (h / h), 1: 1 karışımı, aşağıdakileri karıştırarak beyin Organoid orta hazırlayın Vitamin A, 1: 100, L-glutamin, 0.05 mM MEM, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 1.6 g / L insulin, 0.5 uM dorsomorphin, 5 uM SB431542 ve 0.05 mM β-merkaptoetanol. </li><li> yan kollar üzerinden her bükme şişesi beyin Organoid ortamın 100 ml ilave edilir ve en az 20 dakika boyunca ön ısıtma için bir kuluçka makinesi içinde yerleştirin. </li><li> üreticinin talimatlarına göre, 25 rpm&#39;de bir karıştırma programı kurun. NOT: döndürücü şişelere EHS matris gömülmüş nöroküreleri aktarmadan önce, hepsi ayrıldığından emin olun. İki veya daha fazla EHS matris boyunca bağlı ise, bir bisturi ile bağlantı matrisi kesilerek ayırın. </li><li> Dikkatle Organoid ortamın 100 mL içeren döndürücü şişelere EHS matris gömülmüş nöroküreleri transferi bize2 ml serolojik pipet ing. şişe içine nöroküreleri aktarmak için bükme şişesi yan kollarını kullanın. </li><li> 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 ile bir inkübatör içerisinde bir manyetik karıştırma platformu üzerinde döndürme şişeleri yerleştirin; Bu Organoid kültürün gün 0&#39;dır. </li><li> (Ya da daha sık bir renk değişimi olduğunda) orta yarısını kaldırılması ve taze ortam aynı miktarda ekleyerek haftada bir ortam değiştirin. Not: kuluçka döndürme şişeleri çekerken, organoids şişenin tabanına iner izin 3-5 dakika bekleyin. sıvının yüzeyi üzerinde (bir pompaya bağlı) bir cam pipet yerleştirerek orta çıkarın; dikkatli bir şekilde bir yan açıklık / şişenin kolu ile orta aspire. Bu manipülasyonlar laminer kaputun altında yapılmalıdır. </li></ol> Beyin Organoids 4. analizi <ol><li> Organoids fiksasyonu <ol><li> spinner şişesi kültür wi 14. gününde organoids toplayınbir kesim 1 ml mikropipet (kesim ~ 5 mm) th. 60 mm tabak hepsini koyun ve 3 dakika için sıcak DMEM / F12 5 mL kez yıkayın. </li><li> Sıcak% 4 paraformaldehit 500 uL (PFA) ile 1.5 ml tüp hazırlanır. Dikkat: PFA fiksatif tutarken bir emniyet başlık altında cilt ve göz koruması ve iş giyin. </li><li> her biri ayrı ayrı ve her bir tüp içinde oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca, onları gidermek organoid yerleştirin. daha uzun 60 dakika boyunca organoids düzeltmek etmeyin. organoids taşımak için bir aşılama döngü veya uygun başka herhangi bir vasiyetle kullanın. </li><li> PFA çıkarın ve 1 mL PBS ile her biri 10 dakika için iki kere sabit organoids yıkayın. </li><li> sonraki kullanıma kadar, en fazla 7 gün boyunca 4 ° C&#39;de 1 mL PBS içinde organoids saklayın. </li></ol></li><li> Cryosectioning için organoids katıştırma <ol><li> PBS çıkarın ve cryofreezing önce organoids kurutmak için tüp başına damıtılmış su çözeltisi içinde% 30 sukroz, 1 mL eklemek; Sukro ekledikten sonrase Çözelti organoids yüzeyde yüzen olmalıdır. 4 ° C&#39;de sukroz çözeltisi gece boyunca organoids saklayın; Bir sonraki gün geçtikçe, organoids tüpün dibine batmış olması gerekirdi. Not: gerekirse Organoids, sukroz çözeltisi içinde 4 ° C&#39;de en fazla 3-5 gün saklanabilir. </li><li> Optimum kesme ısısı (OCT), bileşik 400 uL bir vinil numune kalıbı doldurmak ve kalıp merkezindeki bir organoid yerleştirmek için bir aşılama döngü kullanılır. Numune adıyla kalıp kenarını etiketleyin. </li><li> cryosectioning kadar -80 ° C &#39;de organoid içeren kalıp dondurun. </li><li> Kat cam, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 poli-L-lizin çözeltisi (PLL) ile cryoslides ve izin slaytlar, 3 saat boyunca kurutulur. 4 ° C&#39;de slaytlar saklayın ve kullanmadan önce oda ılımana onları ısıtın. NOT: uzağa yüzmesini Organoid dilim önleyecektir olarak PLL-kaplama, önemli bir adımdır. Toplamak ve en fazla 3 kadar 4 ° C&#39;de saklayın PLL çözeltisiaydır. tekrar kullanılmadan önce, 0.22 mikron bir şırınga ile filtre edilir ve oda sıcaklığına kadar sıcak sağlar. </li><li> PLL kaplı cam üzerinde 20-50 um kalınlığında dilimler halinde Kısım cryofrozen organoids 22 cryoslides. bölümlerle Slaytlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca kurumasına izin verin. daha sonra işlenene kadar -80 ° C&#39;de bölümleri saklayın. </li></ol></li></ol> Organoid Bölümlerin 5. Immunofluorescent Boyama NOT: Nestin, bir sinirsel kök işaretleyici ve Tuj1, bir pan-nöronal marker ile boyama organoids genel karakterizasyonu için, tavsiye edilir. Ek örnekler, mitotik apikal radyal glial hücreleri etiketler fosfo-vimentin (p-um), ve Arl13b ile immünofloresan boyama gibi, kirpiksi cisim için tarif edilmiştir. apoptozu test etmek için, DSB&#39;leri (TdT) dUTP Nick Sonu Etiketleme (TÜNEL) deneyi kullanmaktadır. tozdan korumak için inkubasyon sırasında plastik bir kutu içinde slaytlar yerleştirin, hafif,ve kurutma. <ol><li> Oda sıcaklığında 30 dakika için slaytlar çözülme. </li><li> PFA-kaynaklı otoflüoresan söndürmek için 3 dakika süre ile PBS-glisin, 200 uL (PBS içerisinde glisin 0.225 g) ile, iki kez slaytlar yıkayın. </li><li> % 0.5 Triton X-100&#39;ün 200 uL / ​​oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS çözeltisi içinde% 0.1 Tween ile bölümleri permeabilize. </li><li> 3 dakika için PBS-glisin çözeltisi 200 uL ile iki kez yıkanır. </li><li> Spesifik olmayan antijen bağlanma bloke etmek için oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca PBS içinde% 0.5 balık jelatini 200 uL /% 0.1 Triton X 100 ile inkübe edin. NOT: Bir TÜNEL deneme gerekiyorsa, üreticinin protokolüne uygun olarak tahlil gerçekleştirin. ikincil antikorlar müdahale ve sonrasında kullanıldığında fluorophores gidermek edebileceğiniz gibi, immun boyama yapmadan önce TÜNEL tahliline ile başlayın. </li><li> Nestin, 1: aşağıdaki konsantrasyonlarda çözüm engelleme antikorlar seyreltilir 200; p-um, 1: 500; Tuj1, 1: 200;Arl13b, 1:20; ve ikincil antikorlar, 1: 1,000. </li><li> Oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de 1-2 saat boyunca, ilk birincil antikor 200 uL (örneğin, Nestin) ile inkübe edin. </li><li> bloke etme çözeltisi, 200 uL 3 x 3 dakika yıkayın. </li><li> bloke etme çözeltisi içinde 1.000 ve oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca 200 uL slayt inkübe: ilk (anti-fare 488) sekonder antikoru 1 seyreltin. Şu andan itibaren her zaman ışıktan slaytlar korur. </li><li> bloke etme çözeltisi, 200 uL 3 x 3 dakika yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1-2 saat veya gece boyunca 4 ° C (örneğin, Tuj1) aşağıdaki primer antikor 200 uL kuluçkalayın. </li><li> bloke etme çözeltisi, 200 uL 3 x 3 dakika yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca bir sonraki ikincil antikor (anti-tavşan 647) 200 uL ekleyin. </li><li> 3 x 3 dakika yıkayın. bloke etme çözeltisi, 200 uL. </li><li> 30 nM konsantre en az 4&#39; , 200 uL, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyinnükleer boyama için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS içinde entration. </li><li> bloke etme çözeltisi 200 uL 2 x 3 dakika yıkayın. </li><li> damıtılmış su 200 uL 1 x 1 dak yıkanır ve belirgin bir su damlası daha fazla görünür hale gelene kadar bölümler, 10-20 dakika boyunca kurumaya bırakın. </li><li> orta gömme bulunduğu bölümleri monte edin. onları birkaç haftaya kadar 4 ° C&#39;de ışıktan korunmuş olarak saklayın. </li><li> görüntüye mikroskopik analizi organoid, ventriküler bölge, ilkel kortikal plaka ve ilgilenilen diğer alanlarında bir bakış ile devam edin. </li><li> 1, 10, kullanılan floresan boya etiketli sekonder antikor göre seçilen bir 63X yağ objektif ve flüoresan filtreler ile konfokal mikroskop kullanın. </li></ol>

<ol><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501, 373-379 (2013).</li>
<li>Eiraku, M., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryonic+stem+cell+culture+for+generation+of+three-dimensional+retinal+and+cortical+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues.</a> Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).</li>
<li>Gabriel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPAP+promotes+timely+cilium+disassembly+to+maintain+neural+progenitor+pool%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool.</a> EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).</li>
<li>Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+CENPJ+mutation+causes+Seckel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome.</a> J Med Genet. 47, 411-414 (2010).</li>
<li>Wollnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+mechanism+for+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A common mechanism for microcephaly.</a> Nat Genet. 42, 923-924 (2010).</li>
<li>Thornton, G. K., Woods, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+microcephaly%3A+do+all+roads+lead+to+Rome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Primary microcephaly: do all roads lead to Rome?</a> Trends Genet. 25, 501-510 (2009).</li>
<li>Barbelanne, M., Tsang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+basis+of+autosomal+recessive+primary+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly.</a> Biomed Res Int. 2014, 547986(2014).</li>
<li>Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+control+in+neural+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proliferation control in neural stem and progenitor cells.</a> Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).</li>
<li>Gabriel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPAP+promotes+timely+cilium+disassembly+to+maintain+neural+progenitor+pool%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool.</a> EMBO J. 35, 803-819 (2016).</li>
<li>Mak, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+greatly+improve+conversion+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+to+the+neuronal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage.</a> Stem Cells Int. , (2012).</li>
<li>Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+bone+morphogenic+protein+and+activin%2Fnodal+signals+promote+highly+efficient+neural+induction+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells.</a> J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+induction+of+neural+conversion+in+human+ESCs+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+a+single+chemical+inhibitor+of+transforming+growth+factor+beta+superfamily+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors.</a> Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nat Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+with+CytoTune%2C+a+non-integrating+Sendai+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus.</a> Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).</li>
<li>Bai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+analysis+of+genome+alterations+induced+by+single-cell+passaging+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).</li>
<li>Garitaonandia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+risk+of+genetic+and+epigenetic+instability+in+human+embryonic+stem+cells+associated+with+specific+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions.</a> PLoS One. 10, e0118307(2015).</li>
<li>Ohnuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-free+passage+of+human+pluripotent+stem+cells+by+controlling+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations.</a> Sci. Rep. 4, 4646(2014).</li>
<li>Currle, D. S., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+freezing+and+cryosectioning+E12.5+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Yingling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroepithelial+stem+cell+proliferation+requires+LIS1+for+precise+spindle+orientation+and+symmetric+division%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division.</a> Cell. 132, 474-486 (2008).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+step+for+the+cell%2C+a+giant+leap+for+mankind%3A+a+hypothesis+of+neocortical+expansion+during+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution.</a> Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).</li>
<li>Hu, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).</li>
<li>Wilson, P. G., Stice, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+differentiation+of+neural+rosettes+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews%22%5BJournal%5D)">Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).</li>
<li>Dhara, S. K., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human embryonic stem cells.</a> J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).</li>
<li>Christie, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+evaluation+of+synthetic+retinoid+derivatives+as+inducers+of+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Org+Biomol+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation.</a> Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).</li>
<li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+enhancement+of+neural+differentiation+from+human+ES+and+iPS+cells+regardless+of+their+innate+difference+in+differentiation+propensity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews%22%5BJournal%5D)">Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity.</a> Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).</li>
<li>Gabriel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Zika+Virus+Isolates+Induce+Premature+Differentiation+of+Neural+Progenitors+in+Human+Brain+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids.</a> Cell stem cell. , (2017).</li>
<li>Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+Characterization+of+a+MYF5+Reporter+Human+iPS+Cell+Line+Using+CRISPR%2FCas9+Mediated+Homologous+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination.</a> Sci. Rep. 6, 18759(2016).</li>
<li>Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genomic+correction+methods+in+human+iPS+cells+using+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 101, 27-35 (2016).</li>
<li>Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Isogenic+Human+iPS+Cell+Line+Precisely+Corrected+by+Genome+Editing+Using+the+CRISPR%2FCas9+System%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews%22%5BJournal%5D)">Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System.</a> Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).</li>
<li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+organoids+recapitulate+gene+expression+programs+of+fetal+neocortex+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165, 1238-1254 (2016).</li>
<li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain-like+Organoids+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Contain+Functional+Dopaminergic+and+Neuromelanin-Producing+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).</li>
<li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA%2FGlutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162, 375-390 (2015).</li>
<li>D'Avanzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+in+3D+culture%3A+challenges+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives.</a> Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

MCPH in vivo ya da insan hücre kültürü, in vitro olarak yaklaşımlar hayvan modellerinde değinmeyecek edilemez bir karmaşık insan nöro hastalıktır. MCPH klinik tezahürü erken nöron başladığında, ilk trimesterde görünmeye başlar. Böylece, 3D beyin organoids MCPH gelişimini modellemek için güvenilir deneysel sistemi temsil etmektedir. Buna ek olarak, 3D insan beyni organoids önemlisi, iii) çeşitli farklılaşma i) çeşitli genetik arka planı olan hasta numunelerinin spektrumu uyarlanması için izin ii) farklı...

Böyle mikrosefali gibi İnsan nörogelişimsel bozukluklar, sadece kötü nedeniyle insan beyni uzun bir kortikal yüzeye, insan olmayan hayvanlardan farklı benzersiz bir özelliğe sahip olması nedeniyle hayvan modellerinde incelenebilir. Bu özellik, insan beyin gelişimi yeterli in vitro hücre kültürü sisteminde, bir 2D incelenecek bir karmaşık işlemi yapar. Gelişmekte olan 3D kültür teknikleri uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) doku benzeri organoids üretilmesini sağlar. 3B süspansiyon kültüründe pluripotent kök hücrelerinin in vitro farklılaşma organize, tabakalı doku, 1, 2, 3 sebebiyet veren, zamanında ve bölgeye özgü bir şekilde, çeşitli hücre tiplerinin oluşmasını sağlar. 3D kültür teknolojilerini öncülük ve kök hücrelerinden başlayarak, organ oluşumu karmaşıklığını demystified laboratuarlar sayesindeinsan beyin gelişimi erken olayları tanımlamak için ve in vitro, 1, 2, 3 mikrosefali model beyin organoids üreten güçlü bir yöntem geliştirdi. Biz Lancaster ve arkadaşları tarafından geliştirilen bir yöntem adapte olması dikkat çekicidir. serebral organoids 1 oluşturmak için. Bu yöntem deneysel gereksinimlerine göre değiştirildi. Gabriel ve diğerleri arasından bir çalışmanın amacı. beyin gelişimi sırasında nöral kök hücre bakımı hücresel ve moleküler mekanizmaların analiz etmektir. Bunu yapmak için, mekanik bir çalışma mikrosefali hasta 4 türetilen 3D beyin organoids nöral projenitör hücreler (NPC) analiz ederek gerçekleştirildi. Bu hasta CPAP, sentrozom biogenezinin 5 için gerekli olan korunmuş centrosomal proteininde bir mutasyonun taşıdı. Bir yaygın olarak kabul hipoTez mikrosefali NPC havuz tükenmesi sonucu olduğunu ve bu, hücre ölümüne veya erken farklılaşma 1, 6, 7, 8, 9 ya da bağlı olabilir. Mikrosefali beyin organoids ventriküler dilimleri (VZS) analiz ederek, bu NPC önemli sayıda sağlıklı bir vericiden 4 türetilmiş beyin organoids farklı olarak, asimetrik hücre bölünmesinin olmadığı gösterilmiştir. Mikrosefalik beyin organoids kapsamlı mikroskopik ve biyokimyasal analizler zamanında kirpikler sökme 4 CPAP için beklenmeyen bir rol ortaya çıkardı. Spesifik olarak, mutasyona uğramış CPAP NPC 4 erken farklılaşmasına yol açan, gecikmeli kirpik sökme ve gecikmeli hücre döngüsü yeniden giriş ile bağlantılıdır. Bu sonuçlar mikrosefali ve th cilia bir rol oynadığını düşündürmektedirnörogenez ve beyin büyüklüğü kontrol 10 sırasında EIR tutulumu. Bu protokolün birinci parçası homojen beyin organoids oluşturmak için üç aşamalı bir yöntemi bir açıklamasıdır. Daha önce belirtildiği gibi, orijinal Lancaster protokol adapte ve amacımızı 1 uyacak şekilde değiştirildi. İlk olarak, insan iPSCs Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matris üzerinde tanımlı bir besleyici içermeyen durumda kültürlenir. Bu adım, besleyici bağımlı pluripotent kök hücre kültürlerinin varyasyonları önler. Bu protokol, sinir farklılaşmasının indüksiyonu, sinir epiteli iPSCs şirketinden başlar oluşturulur. embriyoit gövde (EB) oluşturma aşamasını, daha kontrollü ve yönlendirilmiş bir şekilde sinir farklılaşma ilerler atlanarak. Bu yaklaşım, mezoderm ve endoderm gibi germ hücre katmanları, spontan ve yönsüz oluşumunu kısıtlar. Bu protokolü uygulayarak, nöral rozetler içeren Neurospheres EH için 5. günde hasat edilebilirS matrisi gömme ve sabit süspansiyon kültürü. Protokolde üçüncü adımı için kullanılan Organoid ortam dorsomorphin ve SB431542 ile takviye edilir. Dorsomorphin kemik morfojenik protein (BMP), küçük moleküllü inhibitörüdür ve SB431542 TGF / aktivin / düğüm sinyal yolunu inhibe eder. Bu faktörler bir araya sinir farklılaşmasını daha etkili bir tek 11, 12, 13, 14-cis retinoik asit teşvik edebilir. Hep birlikte, bu modifikasyonların organoids boyunca en az varyasyonları ile, beyin organoids tekrarlanabilir üretilmesini mümkün kılmak. Önemli olarak, bu yöntem sağlam sentrozom ve hücre döngüsü dinamiklerini etkileyen genlerinde mutasyon taşıyan hasta iPSCs gelen mikrosefalik beyin organoids oluşturmak için uygulanmıştır. Bu protokolün ikinci bölümü br hazırlamak için talimatlar verirain analizi ve mikrosefali hücresel kusurların yorumlanması için organoids. Bu tespit, krio-bölümleme, immünofloresan boyama ve odaklı mikroskopik analiz içerir. Bu protokol beklenen sonuçların ayrıntılı bir açıklama ile ve yorumlanması için rehberlik okuyucu sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>Anti-fare 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Keçi anti-Fare IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Anti-tavşan 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td>Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Arl13b</td><td>proteintech</td><td>17711-1-AP</td><td>ARL13B tavşan poliklonal antikoru & nbsp;</td></tr><tr><td>CELLSPIN sistemi</td><td>IBS Integra Biyobilim</td><td>183001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>32670</td><td>4 ve asal;, 6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür; birden fazla tedarikçi</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco, ABD</td><td>31331093</td><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı: Besin Karışımı F-12&nbsp;</td></tr><tr><td>Dorsomorfin</td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>P5499</td><td>Bileşik C; birden fazla tedarikçi</td></tr><tr><td>Gömme ortamı</td><td>AppliChem</td><td>A9011, 0100</td><td>Mowiol; gömme ortamı; çoklu tedarikçiler</td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrisi</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrigel hESC nitelikli matris; önemli: hESC nitelikli</td></tr><tr><td>Balık jelatini&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>G7765-250ML</td><td>Soğuk su balık derisinden elde edilen jelatin; birden fazla tedarikçi; çözmek ve sterilize etmek için PBS'ye ekledikten sonra otoklav, 4 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Glisin</td><td>AppliChem</td><td>A1067,1000</td><td>Moleküler biyoloji için glisin; çoklu tedarikçiler ve nbsp;</td></tr><tr><td>İğne ile aşılama döngüsü, tek kullanımlık (1 & mikro; L)</td> <td>Sigma Aldrich, ABD</td><td>BR452201-1000EA</td><td>çoklu tedarikçiler ve nbsp;</td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>I3536-100MG</td><td>çoklu tedarikçiler</td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Gibco, ABD</td><td>25030081</td><td>L-glutamin (200 mM)</td></tr><tr><td>Orta A</td><td>Kök hücre teknolojileri</td><td>#05850</td><td>mTeSR1 (hiPSC orta)</td></tr><tr><td>Orta B</td><td>Kök hücre teknolojileri</td><td>#05835</td><td>Nöral indüksiyon ortamı (NIM); nöral farklılaşma ortamı</td></tr><tr><td>Orta C</td><td>Gibco, ABD</td><td>21103049</td><td>Nöral Bazal Ortam</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco, ABD</td><td>11140035</td><td>MEM esansiyel olmayan amino asit çözeltisi (100x)</td></tr><tr><td>MycoAlert Mikoplazma Tespit Kiti</td><td>Lonza, İsviçre</td><td>#LT07-218</td><td>Mikoplazma tespit kiti; çoklu tedarikçiler</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Novus biyolojikleri</td><td>NBP1-92717</td><td>Nestin fare monoklonal antikoru (4D11)</td></tr> <tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>AppliChem</td><td>A3813, 0500</td><td>PBS'de %4, mağaza çözümü -20 ° C'de; C; DİKKAT: CİLT VE GÖZ KORUMASI GİYİN VE KAPÜŞON ALTINDA ÇALIŞIN&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS tabletleri</td><td>Gibco, ABD</td><td>18912014</td><td>Bkz. üretici&akut; S talimatları; çoklu tedarikçiler</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco, ABD</td><td>15140122</td><td>Çoklu tedarikçiler</td></tr><tr><td>Poli-L-lizin çözeltisi (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P8920-100ML</td><td>Çoklu tedarikçiler</td></tr><tr><td>pVim</td><td>MBL</td><td>D076-3S</td><td>Fosfo-Vimentin (Ser55) mAb</td></tr><tr><td>Reaktifi A&nbsp;</td><td>Kök hücre teknolojileri</td><td># 05872</td><td>Protokol 1.1.1.2 Notu; ReLSR (Enzim içermeyen insan ES ve iPS hücre seçimi ve pasaj reaktifi); Lütfen üretici ve akut'u takip edin; S protokolü; birden fazla tedarikçiden alternatif ürünler mevcuttur</td></tr><tr><td>Reaktif B&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>A6964-100ML</td><td>Accutase solüsyonu, tek hücre ayrışması için enzimatik bir çözeltidir; çoklu tedarikçiler; Protokol 1.1.2 "Enzimatik hücre ayrışma çözümü" &nbsp;</td></tr><tr><td>Araştırma Kriyostat Leica CM3050 S</td><td>Leica biosystems</td><td>CM3050 S</td><td>Çoklu tedarikçiler</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1067</td><td>Çoklu tedarikçiler</td></tr><tr><td>Eğirici şişe 250 mL</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>182026</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>AppliChem</td><td>A4734, 1000</td><td>Birden fazla tedarikçi</td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus mikroskop slaytları</td><td>Thermo scientific, ABD</td><td>J3800AMNZ</td><td>Slaytlar "+" ve pozitif yüklü ile etiketlenmelidir</td></tr><tr><td>Ek 1</td><td>Gibco, ABD</td><td>17502048</td><td>N-2 takviyesi (100x)</td></tr><tr><td>A Vitamini içermeyen Ek 2</td><td>Gibco, ABD</td><td>12587010</td><td>B-27 takviyesi (50x), eksi A vitamini; birden fazla tedarikçi</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, NL</td><td>4565</td><td>Çoklu tedarikçiler</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. bileşiği</td><td>Sakura, NL</td><td>4583</td><td>Çoklu tedarikçiler</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A1388,0500</td><td>Çoklu tedarikçiler</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>T2200</td><td>&beta;-Tubulin III (tavşan poliklonal)</td></tr><tr><td>TUNEL testi</td><td>Promega, US</td><td>G3250</td><td>DeadEnd Florometrik TUNEL sistemi; moleküler biyoloji için birden fazla tedarikçi</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td>Birden çok tedarikçi</td></tr><tr><td>su geçirmez levha</td><td>BEMIS şirketi, inc.</td><td>PM996</td><td>Parafilm " M&rdquo;; çoklu tedarikçiler</td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp;</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1049</td><td>KAYA inhibitörü (Y-27632 2HCL); çoklu tedarikçiler</td></tr> <tr><td>ve beta;-merkaptoetanol</td><td>Gibco, ABD</td><td>31350010</td><td>2-merkaptoetanol (50 mM); çoklu tedarikçiler</td></tr></tbody></table>

ipsc türetilmiş İnsan beyin organoids oluşturulması erken nörogelişimsel bozuklukları model

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Karmaşık insan beyninin gelişimini güvenilir bir şekilde temsil edebilen uygun in vitro modellerin kısıtlı mevcudiyeti, temel beyin araştırmalarının klinik uygulamaya geçişini sınırlayan önemli bir darboğazdır. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) etik açıdan sorgulanabilir insan embriyonik kök hücrelerinin yerini almış olsa da, iPSC tabanlı nöronal farklılaşma çalışmaları hücresel düzeyde tanımlayıcı olmaya devam etmektedir, ancak karmaşık, 3D insan beyin dokusundan türetilebilecek ayrıntıları yeterince sağlayamamaktadır. 
Bu boşluk şimdi, karmaşık insan beyni gelişiminin birçok özelliğini modelleyen iPSC'den türetilmiş, 3D beyin organoidleri, "Bir tabaktaki beyinler" uygulamasıyla dolduruluyor. Burada, iPSC'den türetilmiş, 3D beyin organoidleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Organoidler, nadir görülen bir insan nörogelişimsel bozukluğu olan otozomal resesif primer mikrosefali (MCPH) modellenmesine yardımcı olabilir. MCPH'deki beyin malformasyonu için yaygın olarak kabul edilen bir açıklama, insan beyninin gelişiminin erken aşamalarında nöral kök hücre havuzunun tükenmesi, in vitro olarak yeniden yaratılması veya kanıtlanması zor olan gelişimsel bir kusurdur.
MCPH'yi incelemek için, sentrosomal protein CPAP'ta bir mutasyon taşıyan hasta kaynaklı fibroblastlardan iPSC'ler ürettik. Mikrosefali 3D beyin organoidlerinin ventriküler bölgesini analiz ederek, nöral progenitörlerin erken farklılaşmasını gösterdik. Bu 3D beyin organoidleri, nörotoksik kimyasallar, nörotrofik viral enfeksiyonlar veya kalıtsal genetik mutasyonların neden olduğu konjenital beyin bozukluklarının modellenmesinde etkili olacak güçlü bir in vitro sistemdir.

Beyin organoids üretilmesi, sürekli kültürleme (Şekil 1A), en az üç hafta gerekir. tekrarlanabilir sonuçlar başarmak için araştırmacı her adımda belgeleyen ve daha da önemlisi, orta bileşenleri, zaman noktaları ve baz muameleleri ile ilgili herhangi bir değişiklik önler öneririz. Burada, kritik kilometre taşları deney sonunda yeterli kalitede organoids elde etmek için ulaşılır eğer nasıl değerlendirileceğini bir özetini verir. 96 oyuklu bir plaka içerisinde neurospheres ...

İnsan beyni gelişiminin modellenmesi, nöral epitel dokusunun benzeri görülmemiş karmaşıklığı nedeniyle engellenmiştir. Burada, insan beyninin gelişiminin erken olaylarını tanımlamak ve mikrosefaliyi in vitro olarak modellemek için sağlam beyin organoidleri üretimi için bir yöntem açıklanmaktadır.

iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

iPSC kaynaklı İnsan Beyin Organoidleri oluşturmaya yönelik bu protokolün genel amacı, erken dönem insan nörogelişimsel bozukluklarını modellemektir. Bu yöntem, yeni nörojenezde sentezomların ve siliyumların rolü ile primer mikrosefali gibi insan beyninin gelişimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hastaların iPSC kaynaklı beyin organitlerinden tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için sağlam ve hızlı bir model sunmasıdır.Prosedürü, Köln'deki Moleküler Tıp Merkezi'ndeki laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Elke Gabriel gerçekleştirecek. Bu prosedüre başlamak için, daha önce steril makasla kesilmiş iki milimetrelik bir uç takılmış 200 µL'lik bir mikropipet kullanarak nörosferleri toplayın. Ardından, nörosferleri 100 mL'lik bir kap içindeki parafin film üzerine, birbirlerinden yaklaşık beş milimetre uzaklıkta olacak şekilde yerleştirin.Kalan besiyerinin mümkün olduğunca fazlasını dikkatlice uzaklaştırın. Ardından, her bir tekli nörosferin üzerine bir damla EHS matrisi ekleyin. EHS matrisi damlalarını nörosferlerle birlikte 37 degrees celsius sıcaklıkta 15 dakika inkübe edin.Ardından, nörosferleri nörosfer ortamı ile yıkayara

generation-ipsc-derived-human-brain-organoids-to-model-early

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Video, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden insan beyni organoidleri üretmek için bir yöntemi göstermektedir. Nörosferin, diğer mikrop tabakalarının oluşumunu baskılayan bir nöroektodermal tabaka oluşturduğunu gösterir. Nöroküreler bir 3D jel matrisine gömülüdür ve nöroepitelyal tomurcuklar oluşturur. Organoid medya ile inkübe edildiğinde, bu nöroepitelyal tomurcuklar belirli beyin bölgelerine farklılaşır ve bu da olgun beyin organoidlerinin oluşumuna neden olur.

İnsan Beyni Organoidlerini Oluşturmak için İn Vitro Bir Yöntem

Bu video, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) serebral organoidler üretmek için bir testi göstermektedir. İnsan iPSC'leri embriyoid cisimler (EB'ler) oluşturmak için indüklenir. EB'ler, bir indüksiyon ortamı kullanılarak bir polimer iskele üzerinde kültürlenir ve nöral kök hücrelere, progenitör hücrelere ve olgunlaşmamış nöronlara farklılaşmayı teşvik eder. Son olarak, EB'ler bir matrise gömülür ve serebral organoid oluşumu için bir bakım ortamına aktarılır.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Serebral Organoidlerin Üretilmesi

Serebral organoids erken insan beyni geliştirme vitroaraştırmak için yeni bir modeli sistemi temsil eder. Bu makale verimli bir şekilde homojen dorsal ön-tipi organoids İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre de dahil olmak üzere kritik karakterizasyonu ve doğrulama adımları oluşturmak için ayrıntılı yöntembilim sağlar.

Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

Bu protokol, beyin hücresi tiplerinin çeşitliliğini ve hücresel organizasyonun birçok özelliğini korurken, dışsal büyüme faktörleri veya bazal membran matrisi olmadan basitleştirilmiş, düşük maliyetli bir şekilde beyin organoidleri üretmek için bir araç olarak oluşturulmuştur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Beyin Organoidleri Üretmek için Statik Kendi Kendini Yöneten Bir Yöntem

2D ve 3D insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hIPSC) tabanlı neokortik gelişim modellerinin üretimi ve karakterizasyonu için ayrıntılı protokollerin yanı sıra primer selyyum (PC) biyogenez ve fonksiyonunun nitel ve nicel analizini sağlayan tamamlayıcı metodolojiler sunuyoruz.

Neokortik Gelişim Sırasında Primer Seyum Tutulumını Diseksiyona Yönelik 2D ve 3D İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Bazlı Modeller

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi beyin organoidlerinin üretimi ve mitokondriyal hastalıkların modelinde kullanımları için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Mitokondriyal Hastalık Modellemesi için İnsan Beyni Organoidlerinin Üretimi

Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC' ler) beyin organoidleri üretmek için bir protokol açıklıyoruz. Beyin organoidlerini büyük miktarlarda ve yüksek kalitede elde etmek için ev yapımı mini biyoreaktörler kullanıyoruz.

Ev Yapımı Mini Biyoreaktörlerde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Organoidi Üretimi

Bu çalışmada, standart besleyicisiz hPSC kültürlerini kullanarak basit ama sağlam bir kortikal organoid kültür sistemi için ayrıntılı bir teknik sunuyoruz. Bu, in vitro beyin yaşlanmasının yönlerini modelleyen organoidler üretmek için hızlı, verimli ve tekrarlanabilir bir protokoldür.

Beyin Nöronal Yaşlanmasını Modellemek için Kortikal Beyin Organoidlerinin Sağlam ve Yüksek Oranda Yeniden Üretilebilir Üretimi In Vitro

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi hematopoietik progenitör hücreleri (HPC'ler) organoid gelişimine dahil ederek yerleşik mikroglialı bir insan beyni organoidi oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Mikroglia Gelişimi ile İnsan Beyni Organoidinin Türetilmesi

Nükleer silahların yayılmasına karşı geçiş ve neurite çıkıntı kez nöropsikiyatrik hastalık tedirgin gibi nörogelişimsel işler. Böylece, biz hızla ve tekrarlanarak insan IPSC kaynaklı NPCs bu nörogelişimsel işlemlerde değerlendirmek için protokolleri mevcut. Bu iletişim kuralları da ilgili büyüme faktörleri ve tedavi etkileri NPC gelişimi üzerine bir değerlendirme sağlar.

Hızlı algılama nörogelişimsel fenotipleri insan sinir habercisi hücrelerdeki (NPCs)

Öğrenin iPSC türetilmiş insan beyin organoidleri oluşturma yöntemini. Erken nörogelişimsel bozuklukları ve mikrosefaliyi modelleyerek nörogenez mekanizmalarını inceleyin. Hızlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edin.

iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model

Daha fazla video keşfet