iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model

iPSC kaynaklı İnsan Beyin Organoidleri oluşturmaya yönelik bu protokolün genel amacı, erken dönem insan nörogelişimsel bozukluklarını modellemektir. Bu yöntem, yeni nörojenezde sentezomların ve siliyumların rolü ile primer mikrosefali gibi insan beyninin gelişimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hastaların iPSC kaynaklı beyin organitlerinden tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için sağlam ve hızlı bir model sunmasıdır.

Prosedürü, Köln'deki Moleküler Tıp Merkezi'ndeki laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Elke Gabriel gerçekleştirecek. Bu prosedüre başlamak için, daha önce steril makasla kesilmiş iki milimetrelik bir uç takılmış 200 µL'lik bir mikropipet kullanarak nörosferleri toplayın. Ardından, nörosferleri 100 mL'lik bir kap içindeki parafin film üzerine, birbirlerinden yaklaşık beş milimetre uzaklıkta olacak şekilde yerleştirin.

Kalan besiyerinin mümkün olduğunca fazlasını dikkatlice uzaklaştırın. Ardından, her bir tekli nörosferin üzerine bir damla EHS matrisi ekleyin. EHS matrisi damlalarını nörosferlerle birlikte 37 degrees celsius sıcaklıkta 15 dakika inkübe edin.

Ardından, nörosferleri nörosfer ortamı ile yıkayarak parafin filminden dikkatlice temizleyin. Sonrasında, nörosferleri sonraki dört gün boyunca inkübe edin ve ikinci günde iki mililitre taze nörosfer ortamı ekleyin. Bu prosedürde, her bir spinner flask'a yan kollarından 100 mililitre beyin organoid ortamı ekleyin.

Ve besiyerini inkübatörde 37 °C'de en az 20 dakika boyunca ön ısıtmaya tabi tutun. Ardından, nörosferlerin hepsinin birbirinden ayrılmış olduğundan emin olun. Eğer ikisi veya daha fazlası EHS matriksi aracılığıyla birbirine bağlıysa, bağlantılı matrisi bir bistüri ile keserek onları ayırın.

25 RPM hızında bir karıştırma programı ayarlayın. EHS matrisine gömülü nörosferleri, 100 mililitre organoid medyumu içeren spinner flasklara dikkatlice aktarın. Ardından, spinner flaskları inkübatör içindeki bir manyetik karıştırma platformuna yerleştirerek 37 °C'de 14 gün boyunca bekletin.

Organoid kültürünün sıfırıncı günüdür. Besiyerinin yarısını uzaklaştırıp aynı miktarda taze besiyeri ekleyerek besiyerini haftada bir kez değiştirin. Bu adımda, 14. günde spinner flask kültüründeki organoidleri, ucu önceden kesilmiş bir mililitrelik mikro pipet ile toplayın.

Hepsini 60 mm'lik bir kaba koyun ve beş mL sıcak DMEM F12 ile üç dakika boyunca bir kez yıkayın. Ardından, 500 µL sıcak %4 PFA içeren 1,5 mL'lik bir tüp hazırlayın. Her bir organoidi ayrı tüplere yerleştirin ve oda sıcaklığında 30-60 dakika boyunca sabitleyin.

Ardından, organoidleri çıkarmak için bir ekim özesini kullanın. Daha sonra PFA'yı uzaklaştırın ve fikse edilmiş organoidleri, her seferinde bir mililitre PBS ile 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. Sonrasında organoidleri, daha sonraki kullanımlar için dört derece santigrat sıcaklıkta bir mililitre PBS içinde 7 güne kadar saklayın.

Organoidleri kriyoseksiyon için gömmek amacıyla, PBS'yi uzaklaştırın ve kriyodondurma öncesinde organoidleri dehidrate etmek için her tüpe 1 mililitre %30 sükroz çözeltisi ekleyin. Sükroz çözeltisi eklendikten sonra organoidler yüzeyde yüzmelidir. Organoidleri sükroz çözeltisi içinde, dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca saklayın.

Ertesi güne kadar organoidler tüpün dibine çökmüş olmalıdır. Ardından, bir vinil numune kalıbını 400 mililitre OCT bileşiği ile doldurun. Bir organoidi kalıbın merkezine yerleştirmek için bir ekim halkası kullanın.

Kalıbın kenarına örnek adını yazın. Ardından, organoid içeren kalıbı kriyoseksiyonlama işlemine kadar -80 °C'de dondurun. Sonrasında, cam kriyolamları oda sıcaklığında beş dakika boyunca %0,1 PLL ve PBS ile kaplayın.

Ardından, lamların üç saat boyunca kurumasına izin verin. Lamları dört derece celsius'ta saklayın ve kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin. Bunun ardından, kriyojenik olarak dondurulmuş organoidleri PLL kaplı cam kriyolamlara 20 ila 50 mikrometre kalınlığında dilimler halinde kesin.

Kesitleri oda sıcaklığında bir saat boyunca kurumaya bırakın ve ileri işlemlere kadar -80 °C'de saklayın. Tipik bir VZ ve primitif kortikal plak sergileyen kriyoseksiyonlanmış organoidlerin immünofloresan görüntülemesi. VZ, apikal taraftan bazal tarafa kadar uzanır.

VZ içindeki hücrelerin palizat benzeri çekirdekler sergilediği ve bunun onların radyal glial hücreler olduğunu gösterdiği dikkate alınmalıdır. Sağ panel, VZ içindeki nestin pozitif NPC'lerin ve primitif kortikal plakadaki TUJ1 pozitif nöronların immünofloresan boyamasını göstermektedir. Burada, PVIM ve ARL 13B ile boyanmış VZ'lere ait iki örnek sunulmuştur.

Beyaz karelerle işaretlenen bölgeler büyütülmüştür. VZ'nin apikal tarafında bölünen apikal radyal glial hücreler PVIM pozitiftir. Bir anafaz hücresinin bölünme düzlemi, ARL 13B boyaması ile işaretlenen lümen yüzey hattına paraleldir.

Bu teknikte uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde işlem 23 günde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, kültürlerde periyodik kalite kontrollerinin ve mikroplazma kontrollerinin yapılması gerektiğini unutmamak önemlidir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, nörobiyolojideki gelişim araştırmacılarına insan beyin organoidlerinde nörogelişim mekanizmalarını keşfetme imkanı sağlamıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, hücresel fonksiyonları bozulmuş hasta hücre hatları da dahil olmak üzere çeşitli iPSC hücre hatlarından insan beyin organoidlerinin nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.