Name: Elektriksel Uyarı Biowires İnsan Kök Hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde Olgunlaşma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Öğrenin, insan kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin olgunlaşması için üç boyutlu hücre yetiştirme ve elektriksel uyarı yöntemini. Bu teknik, gelişmiş kalp dokusu mühendisliği ve ilaç testi modelleri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kanada Kalp ve İnme Kuruluşundan (G-14-0006265) hibe yardımı, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitülerinden işletme hibeleri (137352 ve 143066) ve bir JP Bickell vakfı hibesi (1013821 ) SSN&#39;ye gönderir.

1. Ana Tasarım ve İmalat NOT: araç imalatı için yumuşak litografi kullanın. Polidimetilsiloksan (PDMS), kalıplanması için bir iki tabakalı SU-8 ana olun. <ol><li> Cihaz (sol, Şekil 1A), bir tasarım kullanarak ve yazılım hazırlanması tasarımı. ayrı ayrı ana her tabakası çizin. Ana 15 iki katmana tekabül eden 20.000 dpi&#39;de iki fotoğraf maskeleri cihaz tasarımı Baskı. şeffaf gibi cihaz modeli ve koyu olarak çevredeki ayarlayın; maskeleri (diğerleri 15 tarafından tarif edildiği gibi), optik olarak litografi SU-8 üzerine cihaz desen transfer etmek için bir şablon olarak hizmet edecektir. </li><li> 4 inçlik bir silikon gofret merkezi üzerine SU-8 ila 50 arasında, yaklaşık 4 ml koyun. Kaplama SU-8 50 eşit 30 s (RPM) yaklaşık 2000 devirde dönen bir döndürme kaplayıcı kullanılarak gofret. 10 dakika boyunca 95 ° C&#39;lik bir sıcak plaka üzerinde gofret pişiriniz. Ultraviyole (UV) li gofret Açığa200 mJ GHT / cm2. </li><li> 30 saniye süreyle 2500 RPM&#39;de gofret ve spin merkezi üzerine SU-8 2050, yaklaşık 4 ml dökün. 15 dakika boyunca 95 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerindeki fırında. Oda sıcaklığında (RT) soğutulur. </li><li> Adımı tekrarlayın 1.3 iki kere daha. </li><li> birinci tabaka, şeffaflık photomask ile kaplanmış gofret örtün. Ilk katman yapmak için 270 mJ / cm2 UV ışığına gofret Açığa. 15 dakika boyunca 95 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerindeki fırında. </li><li> iki adım 1.3 tekrarlayarak SU-8 2050, ikinci katman olun. </li><li> Bir maske hizalama kullanarak ilk katman üzerinde özelliklere ikinci katman maskesini hizalayın. Daha sonra, 240 mJ / cm2 UV ışığına maruz kalmaktadır. 15 dakika boyunca 95 ° C&#39;de pişirin. Not: maruz kalma süresi, gereken toplam UV dozu ve kullanımdan önce günde ölçülen UV ışık çıkışı yoğunluğu ile tespit edilir. </li><li> propilen glikol monometil eter asetat (PGMEA) yerleştirilmeden ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca 200 RPM&#39;de çalkalayarak gofret geliştirin. </li><li> yerlevhanın ortasına: dikkatlice bir Petri kutusu içine, ana ve (ağırlık olarak 1 ila 10 arasındaki bir oranda çapraz bağlayıcı baz) PDMS karışımı dökün. Tüm özellikleri örtün ve hava kabarcıklarını önlemek. </li><li> 2 saat boyunca 70 ° C&#39;de bir fırın içinde ısı. PDMS biowire şablonun kenarı (doğru Şekil 1A) etrafında kesmek için keskin bir bıçak kullanarak. ustadan PDMS soyun. bıçak cihazı kesin. 20 dakika boyunca 121 ° C &#39;de bir sterilizasyon kese ve buhar otoklavda PDMS biowire şablonu koyun. </li><li> Biyogüvenlik kabini (BSC) olarak, bir Petri kabı içine şablona biowire PDMS yerleştirin. Tutun ve kanalın (Şekil 1B-I), her iki ucunda oluk içinde oturma PDMS kuyucuklarda kanalının merkezinde Steril cerrahi ipek sütür (6-0) &#39;in bir parça monte etmek için cımbız kullanarak. </li></ol> Elektriksel Uyarımı Odası 2. Oluşturma <ol><li> 2 cm x: dikdörtgen polikarbonat parçaları (uzunluk x genişlik x kalınlık bir çift yapmak0.85 cm x 0.35 cm) ve elektrik stimülasyonu odasının çerçeve olarak (Resim 2). </li><li> Her bir polikarbonat çerçeve parçasının merkez hattı boyunca 2 cm aralıklı iki 3 mm genişliğinde delik delin. </li><li> 1.5 cm uzunluğunda karbon çubuklarının iki parça kesin. uçtan 3 mm daha kadar karbon çubuğu boyunca 1 mm çapında bir delik delin. karbon çubuk delikten bir platin tel Konu ve karbon çubuğu etrafına sararak kablo sıkın. Elektrik uyarıcı ile, daha sonra bağlantı için platin tel diğer ucuna bir klip takın. </li><li> polikarbonat çerçeve parçalar halinde karbon çubuklar yerleştirin. altı gözlü bir plakanın bir kuyuya karbon çubuklar monte çerçeve yerleştirin. </li><li> kuyuya PDMS 2 mL dökün. yakın PDMS yüzey düzeyde tutmak ancak karbon çubuklarının alt ulaşan değil ise PDMS polikarbonat çerçevelerinin alt daldırın. 2 saat boyunca 70 ° C&#39;de bir fırın içinde ısı. </li><li> altı üzerinden elektriksel uyarım odası aleh levha, 20 dakika boyunca 121 ° C&#39;de buhar sterilizasyon için bir sterilizasyon kese içine koyun ve. </li></ol> hPSC-CM&#39;ler 3. enzimatik ayrışma <ol><li> Kurulu bir protokol 4 kullanılarak kardiyomiyositlere ayırt etmek hPSC neden. Not: Kısaca, ofisler embriyoit gövde ile kardiyomiyositlerde oluşturmak (EB) protokolleri kemik morfogenetik protein 4, bazik fibroblast büyüme faktörü, aktivin A, vasküler endotelyal büyüme faktörü ve Dickkopf homolog 1 ila 4 ile sıralı takviyesi ile kök pro ortamda. biowires yapmak için farklılaşma günden 20-34 den EBS kullanın. </li><li> Bir P1,000 pipet ucu ile düşük bağlanma plakadan EBS toplamak ve bir konik tüp aktarın. 125 xg ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj ile pelet. ile pelet Süpernatant atılır ve yeniden süspansiyon haline önceden ısıtılmış, 37 1% deoksiribonükleaz içeren ° C kollajenaz tip I (DNAz I). 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edinSindirim için. </li><li> Önceden ısıtılmış, 37 ° C 5 ml ekleyin 125 xg ve oda sıcaklığında 5 dakika için orta ve santrifüj yıkayın. Süpernatant atılır. tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi ile 2 ml pelet yeniden süspanse edin ve 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> % 3 ihtiva eden durdurma ortamının 1 ml ekleyin (h / h) DNaz I </li><li> 3-5 kez 5 ml şırıngaya 20 G (0.9 mm) bir iğne takılır ve içinden EB süspansiyon geçmektedir. </li><li> 5 dakika süre ile 280 x g&#39;de yıkama ortamında ve santrifüj 7 mL ekleyin. Süpernatant atılır. Iscove&#39;un değiştirilmiş Dulbecco ortamı (IMDM) içinde pelletini ve buz üzerinde muhafaza edin. hemositometre ile hücre sayısını belirler. 5 dakika süre ile 280 x g&#39;de santrifüj ile 0.5 x 10 6 hücre ve pelet al. süpernatantı. </li><li> bir steril tüp içine katmadan önce buz üzerinde önceden soğutmak bütün jel bileşenler. takip eden kolajen jel bileşenlerinin (nihai konsantrasyon) karıştırın: 2,1 mg / ml sıçan kuyruğu I tipi kolajen, 24.9 mM glikoz, 23.8 mM NaHCO 3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, ve 1 x M199 ortamı içinde% 10 hücre dışı matris. kolajen ve son hücre dışı matriks ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. </li><li> Kollajen jel 3.5 uL, 0.5 x 10 6 hücre yeniden süspanse edin ve iyice karıştırın. </li><li> 0.5 cm uzunluğunda bir kanal (Şekil 1B-II) &#39;hücre süspansiyonu 4 uL eklemek için bir P10 pipet kullanın. Steril forseps gerektiğinde dikiş ipliğinin pozisyonunu ayarlar. </li><li> emin jel dokunun dikkat ederek, steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile Petri kabı alt kapak. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Hücreler (Şekil 1B-III) karşılamak için yeterli kültür ortamı 12 mL (örneğin, Pro ya da orta hücre üretici tarafından tavsiye edilen sap), PBS ile değiştirin. 1 hafta boyunca 37 ° C&#39;de bir inkübatör içinde kültür. günaşırı ortamı değiştirin. </li></ol> Biowire Yetiştirme 4. Elektriksel Uyarımı <ol><li> İçindeBSC, bir elektrik stimülatörü odası ev sahipliği yapacak altı gözlü bir plakanın her bir oyuğuna, 2 mL PBS ilave edin. yavaşça kuyuya otoklava elektriksel uyarım aygıtını yerleştirmek için steril cımbız kullanarak. kuyudan PBS atın. </li><li> önceden ısıtılmış kültür ortamı 5 mL karbon çubuklar örtün. Elektrik uyarımı haznesinde biowires monte etmek için steril cımbız kullanarak ve karbon çubukları (Şekil 2) dik olarak yönlendirmek. </li><li> altı plaka üstüne kapak yerleştirin, fakat elektrik uyarıcı ile bağlanmak için plakanın dışında ulaşan yeterli platin tel bırakın. 37 ° C&#39;de bir hücre kültür inkübatörü içinde altı-plaka ve elektrik stimülatörü platin tel bağlayın. </li><li> İki fazlı tekrar darbe, 1-ms atım süresi, 3 V / cm, ve saniyede 1 darbesi (PPS), bir elektrikli aşağıdaki ayarlar ile stimülatörü kullanılarak biowires teşvik. aşağıdaki değerlere PPS 24 saatte kaldırılması: 1.83, 2.66, 3.49, 4.82, 5.15 ve 6. Değişim orta günaşırı. </li><li> 10 kat büyütmede mikroskop altında elektriksel uyarıya tepki olarak kardiyomiyosit kasılmasını dikkate alınmalıdır. NOT: stimülasyon bir hafta, biowires olgun hale geldikten sonra (sonuçlar bölümüne bakınız). </li></ol>

<ol><li>Sun, X., Nunes, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+hydrogel-based+strategies+for+application+in+cardiac+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration.</a> Biomed Mater. 10 (3), 034005(2015).</li>
<li>Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+strategies+of+engineered+tissues+and+their+application+in+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration.</a> Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).</li>
<li>Hastings, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+and+cell+delivery+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Drug and cell delivery for cardiac regeneration.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 84 (0), 85-106 (2015).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiovascular+progenitor+cells+develop+from+a+KDR%2B+embryonic-stem-cell-derived+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population.</a> Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+the+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Snir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+ultrastructural+and+proliferative+properties+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).</li>
<li>Dolnikov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+intracellular+Ca2%2B+handling+and+the+role+of+sarcoplasmic+reticulum+in+the+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction.</a> Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).</li>
<li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+adolescence%3A+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).</li>
<li>Zimmermann, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+a+differentiated+cardiac+muscle+construct%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct.</a> Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).</li>
<li>Radisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assembly+of+engineered+myocardium+by+electrical+stimulation+of+cardiac+myocytes+cultured+on+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).</li>
<li>Schaaf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+engineered+heart+tissue+as+a+versatile+tool+in+basic+research+and+preclinical+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology.</a> PLoS One. 6 (10), e26397(2011).</li>
<li>Tulloch, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+engineered+human+myocardium+with+mechanical+loading+and+vascular+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture.</a> Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).</li>
<li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biowire%3A+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li>
<li>Lake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/protocolexchange/protocols/4049">Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols.</a> Protocol Exchange. , (2015).</li>
<li>Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+applications+for+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Cardiac applications for human pluripotent stem cells.</a> Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cardiac+patch+for+advanced+functional+maturation+of+human+ESC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes.</a> Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).</li>
<li>Radisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+gradients+correlate+with+cell+density+and+cell+viability+in+engineered+cardiac+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue.</a> Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Bu yazının hPSC-CM&#39;ler olgunlaşmasını geliştirmek için, mühendislik platformu, biowire kurulumunu ve uygulanmasını açıklar. Cihaz, standart mikroimalat tesislerinde yapılabilir ve biowires ortak hücre kültürü teknikleri ve bir elektrik uyarıcı ile üretilebilir. Bildiğimiz kadarıyla, biowires benzer hiçbir rapor yöntem yoktur. Bu strateji, yüksek uyarım oranı rampa rejimi (3 Hz karşı 6Hz) tabi biowires elde edilen daha büyük bir olgunlaşma düzeyi ile kanıtlandığı gibi gelişmiş olgunlaşma ...

Hücresel tedavi kardiyak onarım / yenilenme ulaşmak için en umut verici ve incelenen stratejilerden biridir. Bu kalp doku mühendisliği ve biyomalzeme 1, 2 eş zamanlı verilmesi ile yardımcı olmuştur. En uygun hücre kaynakları hasarlı, hastalıklı veya yaşlı kalpleri 3 üzerindeki potansiyel yararlı etkileri için hayvan modellerinde incelenmiştir. Özellikle, önemli çabalar insan pluripotent kök hücresinin kullanmak için yapılmıştır (hPSC) kardiyomiyositlerde (hPSC-CM), kardiyak doku mühendisliği için potansiyel olarak sınırsız otolog hücre kaynağı -türetilmiş. hPSC-CM&#39;ler çeşitli yerleşik protokoller 4, 5, 6 kullanılarak üretilebilir. Bununla birlikte, elde edilen hücreler yetişkin ventriküler kardiyomiyositlerde 7&#39;ye göre olgunlaşmamış özelliklerinin bir dizi fetal benzeri fenotipler sergiler, </sup&gt; 8. Bu ilaç keşif araştırma ve yetişkin kardiyak hastalık modellerinin 9 gelişiminde erişkin kalp dokusunun modelleri olarak hPSC-CM&#39;ler uygulanmasına engel teşkil edebilir. fenotipik olgunlaşmamışlığın bu sınırlamanın üstesinden gelmek için yeni yaklaşımlar aktif kardiyomiyosit olgunlaşmasını teşvik etmek için araştırılmaktadır. İlk çalışmalar, siklik mekanik 10 veya elektriksel uyarım 11 aracılığıyla yenidoğan sıçan kardiyomiyositlerde etkili ön-olgunlaşma özellikleri açığa çıkmıştır. Jel sıkıştırma ve siklik mekanik uyarma da elektrofizyolojik ve kalsiyum kullanım özelliklerinin en az donanımıyla hPSC-CM olgunlaşması 12, 13, bazı yönlerini geliştirdiği gösterildi. Bu nedenle, &quot;biyolojik tel&quot; (biowire) olarak adlandırılan bir platform sistemi yapısal işaretler ve elektrik alanı stimülasyon sağlamak suretiyle geliştirildiN hPSC-cm 14 olgunlaşmasını artırmak için. Bu sistem, elektriksel alanla uyarıma müsait hizalanmış kardiyak doku oluşturmak için bir mikro-platformu kullanır. Bu hPSC-cm yapısal ve elektrofizyolojik olgunluk geliştirmek için kullanılabilir. Burada, böyle biowires yapma ayrıntılarını açıklar.

<table><tbody><tr><td>L-Askorbik asit</td><td>Sigma</td><td>A-4544</td><td>hPSC-CM kültür ortamı bileşeni</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk, Inc</td><td></td><td>Cihaz tasarlamak için yazılım</td></tr><tr><td>Karbon çubuklar, & Oslash; 3 mm</td><td></td><td></td><td>Elektrik stimülatör odası bileşeni</td></tr><tr><td>Kollajen, tip 1, sıçan kuyruğu</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td>Kollajen jeli: 24.9 mM glikozda 2.1 mg / mL sıçan kuyruğu kollajen tip I, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, 1x M199 ortamında% 10 büyüme faktörü azaltılmış Matrigel ile.</td></tr><tr><td>Kollajenaz tip I&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td>PBS'de Ca2 + ve Mg2 ile PBS'de% 0.2 kollajenaz tip I (a) ve% 20 FBS . 0.22 & mu ile sterilize edin; m süzgeç ve 12 mL alikot yapın. -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Deoksiribonükleaz I (DNaz I)</td><td>EMD Millipore</td><td>260913-25MU</td><td>Suda 1 mg / mL DNaz I stok çözeltisi yapın. Steril süzün ve 0,5 mL alikotları & eksi derecede saklayın; 20 derece > C</td></tr><tr><td>Matkap ve matkap uçları (&Oslash; 1 mm ve 2 mm)</td><td>Dremel</td><td></td><td>Polikarbonat çerçevelerde delikler açın</td></tr><tr><td>Elektrik stimülatörü</td><td>Grass</td><td>s88x</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>WISENT Inc.</td><td>080-450</td><td></td></tr><tr><td>D- (+) - Glikoz&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td>Kollajen jel bileşeni</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>MilliQ</td><td></td><td>18.2 M&Omega; &orta nokta; 25 & derece'de cm; C, ultra saf, tüm çözeltileri yapmak için</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Kollajen jel bileşeni</td></tr><tr><td>Sıcak plaka</td><td>Torrey Pines</td><td>HS40</td><td></td></tr><tr><td>Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Orta (IMDM)</td> <td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Maskesi hizalayıcı</td><td>EVG ve nbsp;</td><td>EVG 620</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, büyüme faktörü azaltıldı&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Kollajen jel bileşeni</td></tr><tr><td>Orta 199 (M199)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11825015</td><td>Kollajen jel bileşeni</td></tr><tr><td>Monotiyogliserol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M-6145</td><td>hPSC-CM kültür ortamı bileşeni</td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin (P / S)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Ca 2 + ve Mg 2 + içeren fosfat tamponlu salin (PBS);</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Plakası (6 kuyulu)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Plakası (6 oyuklu), düşük bağlantı</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Platin teller, 0,2 mm</td><td></td><td></td><td>Elektrik stimülatör odası bileşeni</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Propilen glikol monometil eter asetat (PGMEA)</td><td>Doe & Ingalls A.Ş.</td><td></td><td>Gofret Kılıfını geliştirmek için</td></tr><tr>, buhar <td>sterilizasyonu için</td><td>soyulabilir</td><td>Dönüştürücüler</td><td>92308</td></tr><tr><td>Silikon gofret, 4 inç</td><td>UniversityWafer Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat (NaHCO3)</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Kollajen jel bileşeni</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Kollajen jel bileşeni</td></tr><tr><td>Sprin kaplayıcı</td><td>Özel Kaplama Sistemleri</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>StemPro-34 kültür ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10639011</td><td>hPSC-CM kültür ortamı. 50 mL yapmak için 1.3 mL takviye, 500 & mu ekleyin; L 100 kez; L-Glutamin, 250 & mu; L 30 mg / mL transferrin, 500 & mu; l 5 mg / mL askorbik asit, 150 & mu; L / 26 &mu; l / 2 mL monotiogliserol (MTG) ve 500 &mu; L (% 1) penisilin / streptomisin.</td></tr><tr><td>Medyayı</td><td></td><td></td> durdur <td>Yıkama ortamı: FBS (1: 1)</td></tr> <tr><td>SU-8 50&nbsp;</td><td>MicroChem A.Ş.</td><td></td><td>fotorezist, ana bileşen</td></tr><tr><td>SU-8 2050&nbsp;</td><td>MicroChem A.Ş.</td><td></td><td>fotorezist, ana bileşen</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche</td><td>10-652-202</td><td>hPSC-CM kültür ortamı bileşeni</td></tr><tr><td>Tripsin / EDTA,% 0.25</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td>hPSC-CM kültür ortamı bileşeni</td></tr><tr><td>% 1 Penisilin / Streptomisin içeren</td> <td>yıkama ortamı</td><td></td><td></td> IMDM</tr></tbody></table>

elektriksel uyarı biowires İnsan kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde olgunlaşma

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

İnsan pluripotent kök hücre kökenli kardiyomyositler (hPSC-CM&#39;ler) gelecek vaat eden hücre kaynağı olmuş ve böylece ilaç keşfi, hastalık modelleme, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp dahil kardiyak araştırmalarındaki potansiyel uygulamaların soruşturma teşvik ettik. Ancak, mevcut protokoller tarafından üretilen hücrelerin, doğal yetişkin ventriküler kardiyomiyositlerde kıyasla olgunlaşmamış bir dizi gösterir. Birçok çabaları şimdiye dek elde sadece ılımlı olgunlaşma, hPSC-CMS olgun yapılmıştır. Bu nedenle, biowire adı verilen bir mühendislik sistemi, in vitro olarak daha olgun bir duruma hPSC CMS kurşun fiziksel ve elektriksel iki ipuçları temin ederek oluşturulmuştur. Sistem bir giderek artan bir sıklık ile elektriksel alanla uyarıma tabi hizalanmış kardiyak doku (biowire) içine monte etmek için bir bükülmez şablon dikiş boyunca jel kolajen türü hPSC CMS tohum bir mikro-platformu kullanır. stimüle kontroller ile karşılaştırıldığında,biowired kardiyomiyositlerde yapısal ve elektrofizyolojik olgunlaşma geliştirilmiş bir derecede sergileyebilir uyarmıştır. Bu tür değişiklikler stimülasyon hızına bağlıdır. Bu yazının ayrıntılı olarak biowires tasarım ve oluşturulması açıklanmıştır.

biowires bir ameliyat dikiş ipliği kullanımı için rasyonel bir eksen hizalamak ve kalp liflerin şekli taklit 3D yapıları oluşturmak için bir şablon olarak hizmet etmektir. Biz biowire kültür yedi gün sonra, hücreler, ameliyat dikiş ipliği (Şekil 3A) yaklaşık jel yenilenmiş göstermektedir. Dikiş ekseni boyunca monte hücreler kalp dokusunu (Şekil 3) hizalanmış oluşturulur. ön kültür 7 gün sonra, biowires 7 elektriksel alan stimülasyonu gün kardiyomiositler...

Kalp biowire platformu elektrik stimülasyonu ile üç boyutlu hücre ekimi birleştirerek, insan embriyonik ve uyarılmış pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositlerde (hPSC-CM) olgun için kullanılan bir in vitro yöntem olup. Bu el yazması kardiyak biowire platformunun ayrıntılı kurulum sunar.

Elektriksel Uyarı Biowires İnsan Kök Hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde Olgunlaşma

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

Bu prosedürün genel amacı, insan embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilen kardiyomiyositlerin olgunlaşmasını teşvik etmek için elektriksel stimülasyonda kontrollü üç boyutlu hücre kültürü yöntemlerini kullanmaktır. Bu yöntem, farklı elektriksel stimülasyon parametrelerinin veya sürenin kalp hücresi fonksiyonunu ve olgunlaşma durumunu nasıl etkilediği dahil olmak üzere, kardiyak doku mühendisliği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Nihai sonuçlar, olgunluğu artırılmış mühendislik ürünü insan kalp dokularıdır.Bu tekniğin etkileri, yeni ilaçların güvenliğinin ve etkinliğinin test edilmesi gibi tanı uygulamalarına kadar uzanmaktadır; çünkü elektriksel iletim gibi olgun özelliklere sahip kardiyomiyositlerin, ilaç tarama çalışmalarında insan kalp hücrelerinin daha doğru modelleri olarak hizmet etme olasılığı daha yüksektir. PDMS monomerini ve kürleme ajanını 10:1 oranında birleştirin ve iyice karıştırın. Gaz çıkışını sağlamak için beş dakika boyunca bekletin.Ardından, biotel şablonu kalıbını içeren bir Petri kabına PDMS karışımını ekleyin. Hava kabarcığı oluşumunu en aza indirmeye çalışın. Daha sonra PDMS'yi 70 °C'de iki saat boyunca kürley

maturation-human-stem-cell-derived-cardiomyocytes-biowires-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

Burada, insan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler) için sağlam, hızlı ve ölçeklenebilir bir kardiyomiyosit farklılaşma protokolü sunuyoruz. Bu büyük ölçekli yöntem kullanılarak türetilen kardiyomiyositler, insan kardiyovasküler hastalık modellemesinde, yüksek verimli ilaç taramasında ve potansiyel olarak klinik uygulamalarda etkili kullanımları için yeterli hücre sayısı sağlayabilir.

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden (hPSC-CM) türeyen kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik karakterizasyonu, kardiyak hastalık modellemesi ve ilaç yanıtlarının belirlenmesi için çok önemlidir. Bu protokol, hPSC-CM'lerin çok elektrotlu diziler üzerinde ayrılması ve plakalanması, alan potansiyelinin ölçülmesi ve QT ve RR aralıklarının analiz edilmesi için gerekli olan bilgileri sağlar.

Çok Elektrodlu Diziler (ÇÇA&#39;lar) Kullanan İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilmiş Kardiyomiyositlerin (hPSC-CM&#39;ler) Elektrofizyolojik Analizi

Burada, fonksiyonel, sözleşme, cardiomyocyte benzeri hücreler üretmek için kardiyak farklılaşma potansiyeli insan Mezenkimal kök hücrelerin genç kaynaklarının verimli koşum için bir yöntem mevcut tüp bebek.

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Burada elektrik ve mekanik uyaranlara kardiyak Fizyoloji taklit kullanan bir hücre kesimin eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu elektromekanik stimülasyon işlem görmüş hücreleri cardiomyogenic potansiyelini artırır ve daha fazla hücre tedavisi, hastalık modelleme ve uyuşturucu taraması için umut verici bir stratejidir.

Hücrelerin Cardiomyogenic potansiyeli geliştirmek için aynı anda elektrik ve mekanik stimülasyon

Bu makale, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyosit (hiPSC-CM) ağlarının gelişimi için bir dizi protokolün yanı sıra, hücre membranı hareket potansiyeli ölçümleri için ters şekilde electroporate etmek için multiwell MEA plakaları üzerinde kültürlü bir set içerir. Yüksek verimlilik kayıtları aynı hücre sitelerinden gün içinde tekrar tekrar elde edilir.

Tekrarlayan eylem potansiyel kayıtlar için Multiwell mikro elektrot diziler üzerinde insan iPSC-türetilen Kardiyomiyoksit ağları

Bu protokol, preklinik ilaç testi için insan kardiyak dilimlerinin kesilmesi ve kültüre edilmesi prosedürünü açıklar ve bu dilimlerden aynı anda transmembran voltajı ve hücre içi kalsiyum sinyallerini kaydetmek için optik haritalamanın kullanımını ayrıntılarıyla açıklar.

İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), klinik öncesi kardiyotoksisite taraması için hayvanların kullanılmasına bir alternatif sunar. Preklinik toksisite taramasında hiPSC-CM'lerin yaygın olarak benimsenmesinin bir sınırlaması, hücrelerin olgunlaşmamış, fetal benzeri fenotipidir. Burada hiPSC-CM'lerin sağlam ve hızlı olgunlaşması için protokoller sunulmaktadır.

Olgun İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit Monokatmanları Kullanılarak Yüksek Verimli Kardiyotoksisite Taraması

Burada, video tabanlı mikroskopi ile birlikte esnek bir substrat üzerine kaplanmış, 2D insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit (hiPSC-CM) monokatmanlarını kullanan non-invaziv bir kardiyak tıbbi cihaz kontraktilitesi değerlendirme yöntemini gösteriyoruz. Bu araç, kardiyak elektrofizyoloji cihazlarının kasılma özelliklerinin in vitro değerlendirilmesinde yararlı olacaktır.

2D İnsan Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositlerde Kardiyak Kontraktilite Modülasyon Tedavisinin Değerlendirilmesi

Burada, optik tabanlı bir platform kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kontraktilite ve kalsiyum ölçümleri yapmak için yerleşik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu platform, araştırmacıların mutasyonların etkisini ve çeşitli uyaranlara verilen tepkiyi hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde incelemelerini sağlar.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kalsiyum ve kontraktilite parametrelerinin gerçek zamanlı ölçümleri

Eriyik elektrospinning yazma (MEW), polikaprolakton (PCL) iskeleleri ve fibrin hidrojelleri hiPSC türevi kardiyomiyositler ve fibroblastlarla birleştiren 3D miyokardiyal dokular oluşturmak için tekrarlanabilir bir yöntem sunulmuştur. Bu teknik, iskele mimarisi üzerinde hassas kontrol sağlar ve klinik öncesi ilaç testlerinde ve kalp hastalığı modellemesinde uygulanabilir.

Polikaprolakton İskelelerinin ve hiPSC'den Türetilmiş Kardiyak Hücrelerin Eriyik Elektrospinning Yazımı Kullanılarak 3D İnsan Miyokard Dokusu Üretimi

Öğrenin, insan kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin olgunlaşması için üç boyutlu hücre yetiştirme ve elektriksel uyarı yöntemini. Bu teknik, gelişmiş kalp dokusu mühendisliği ve ilaç testi modelleri sağlar.

Elektriksel Uyarı Biowires İnsan Kök Hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde Olgunlaşma

Daha fazla video keşfet