Elektriksel Uyarı Biowires İnsan Kök Hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde Olgunlaşma

Bu prosedürün genel amacı, insan embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilmiş kardiyomiyositlerin olgunlaşmasını teşvik etmek için elektriksel stimülasyonda kontrollü üç boyutlu hücre büyütme yöntemlerini kullanmaktır. Bu yöntem, farklı elektriksel stimülasyon parametrelerinin veya zaman uzunluğunun kardiyak hücre fonksiyonunu ve olgunlaşma durumunu nasıl etkilediği de dahil olmak üzere kardiyak doku mühendisliği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Nihai sonuçlar, gelişmiş olgunluğa sahip tasarlanmış insan kalp dokularıdır.

Bu tekniğin etkileri, yeni ilaçların güvenliğini ve etkinliğini test etmek gibi tanı uygulamalarına kadar uzanır, çünkü elektriksel ilerleme gibi olgun özelliklere sahip kardiyomiyositlerin, ilaç tarama çalışmalarında insan kalp hücrelerinin daha doğru modelleri olarak hizmet etmesi muhtemeldir. PDMS monomerini ve sertleştirici maddeyi 10:1 oranında birleştirin ve iyice karıştırın. Gazı almak için beş dakika bekletin.

Ardından, PDMS karışımı ile biowire şablonu için master'ı içeren bir Petri kabı yükleyin. Hava kabarcığı oluşumunu en aza indirmeye çalışın. Daha sonra PDMS'yi iki saat boyunca 70 santigrat derecede sertleştirin.

Ardından, önce kenarlarından keskin bir bıçak kullanarak ve ardından soyarak katılaşmış kalıbı kurtarın. Ardından fazla PDMS'yi kesin ve tüm şablonları bir sterilizasyon poşetinde toplayın. Steam, şablonları 121 santigrat derecede 20 dakika boyunca otomatik olarak körükleyin.

Ardından her bir şablonu bir biyogüvenlik kabininin havalandırması altında steril bir Petri kabına yükleyin. Şimdi, her şablon için, tüm kanalı kaplayan oluğa bir parça steril 6.0 ipek sütür monte etmek için cımbız kullanın. Şablonlar daha sonra hücre tohumlama için hazırdır.

Sütür, kalp liflerinin şeklini taklit eden sütür ekseni boyunca hizalanan 3D yapıların oluşturulması için bir şablon görevi görecektir. Her oda için, elektrik stimülasyon odası için çerçeve görevi görecek bir çift dikdörtgen polikarbonat parçası yapın. Her parçanın merkez çizgisi boyunca, iki santimetre aralıklarla üç milimetre genişliğinde iki delik açın.

Her oda için iki adet 1,5 santimetre uzunluğunda karbon çubuk hazırlayın. Her çubuğun ucundan yaklaşık 3 milimetre uzakta bir milimetre genişliğinde bir delik açın. Ardından her deliği bir platin tel ile geçirin ve telin bir ucunu çubuğun etrafına sarın.

Daha sonra, her oda için iki polikarbonat parça arasına iki çubuk yerleştirin ve bir çerçeve oluşturun. Daha sonra altı kuyulu bir plakanın kuyusuna yaklaşık iki mililitre PDMS dökün ve çerçeveyi PDMS ile kuyuya yerleştirin ve çerçevelerin altını batırın. PDMS'yi 70 santigrat derecede iki saat boyunca kürleyin, böylece PDMS çerçeveyi sabitler.

Ardından, tamamlanmış hazneyi PDMS takılıyken plakadan çıkarın. Monte edilmiş bir odanın işlevini test etmek için, platin telleri bir aküye bağlayın ve elektriğin çubuklardan geçip geçmediğini kontrol etmek için bir voltmetre kullanın. Şimdi fonksiyonel odaları bir sterilizasyon poşetine aktarın ve hücre kültürüne hazırlamak için 121 santigrat derecede 20 dakikalık buhar sterilizasyonu kullanın.

Jeli hazırlamak için, steril bir tüpte karıştırmadan önce tüm jel bileşenlerini buz üzerinde önceden soğutun. En son kolajen ve ekstra hücresel matrisi eklediğinizden ve bileşenleri pipetleme kullanarak karıştırdığınızdan emin olun. Çünkü hücreler, insan pluripotent kök hücrelerinden farklılaşmış kardiyomiyositlere sahiptir.

Hücreleri toplayın ve her bir biowire hazırlama tesisi için yarım milyon hücre içeren 3,5 mikrolitre kollajen jeli hazırlayın. Şimdi her tabaktaki 0,5 santimetre uzunluğundaki kanal şablonuna yaklaşık dört mililitre süspansiyon yüklemek için bir P10 pipet ucu kullanın. Gerektiği gibi steril forseps kullanarak sütürün pozisyonunu ayarlayın, böylece tamamen gerilir.

Hücreleri tohumladıktan sonra, tutarlı sonuçlar elde etmek için otoklav almadan önce jel hücre karışımını her zaman yeniden süspanse ettiğinizden emin olun. Kanalları yükledikten sonra, jele dokunmamaya dikkat ederek tabağın altını steril PBS ile örtün. Bu, biyotellerin polimerizasyon sırasında dehidre olmamasını sağlayacaktır.

Biyotelleri 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe ettikten sonra, PBS'yi hücreleri kaplayacak kadar kültür ortamı ile değiştirin. 12 mililitre genellikle yeterlidir. Ardından, yemeği bir hafta boyunca kültürleyin, ortamı her gün değiştirin.

Bir biyo güvenlik kabininde, bir elektrik stimülatör odasını barındıracak altı kuyulu bir plakanın her bir kuyusuna iki mililitre PBS ekleyin. Ardından, otoklav cihazlarını kuyucuklara nazikçe yerleştirmek için steril cımbız kullanın. Yerine oturduktan sonra, PBS'yi atın ve karbon çubukları tamamen kaplaması gereken beş mililitre sıcak ortamla değiştirin.

Hücreleri 24 saat boyunca kültürlemeden önce, hücrelerin elektriksel uyaranı yakaladığından ve kasılmalarla yanıt verdiğinden emin olmak için elektriksel stimülasyona yanıt olarak kardiyomiyositlerin kasılmasını gözlemleyin. Ardından, biyotelleri elektrik stimülatör odasına yerleştirin ve kanalları karbon çubuklara dik olarak yönlendirin. Platin telleri plakadan uzağa uzatın ve ardından plakaların üzerini kapatın.

Kabloları bir elektrik stimülatörüne bağlayın. Stimülatörü, bir hertz'de ve santimetre başına üç voltta bifazik bir milisaniye darbeler verecek şekilde ayarlayın. Daha sonra elektrik stimülatöründeki preparatları 37 santigrat derecede bir inkübatöre aktarın.

Stimülasyon oranını her 24 saatte bir kademeli olarak sıfır. günde bir hertz'den altıncı günde altı hertz'e yükseltin. Bu kültür haftası boyunca, ortamı her gün değiştirin. Ve kardiyomiyositlerin kasılmasını günlük olarak gözlemleyin.

Biyotel hücrelerinde yedi günlük ön kültürden sonra, hücreler jeli sütürün etrafında yeniden kalıpladı. Hücreler, hizalanmış kalp dokusu oluşturmak için sütürün ekseni boyunca bir araya geldi. Kardiyak kontraktil proteinleri eksprese eden hücreler, kontraktil aparatta sarkomerik bantlanma gösterdi ve miyofibrilleri sütürün ekseni boyunca hizalandı.

Biyoteldeki hücreler, embriyoid cisimlerdeki hücrelerden daha düşük çoğalma oranları sergiledi. Biyotellerde yetiştirilen kardiyomiyositlerde kalsiyum kullanımı önemli ölçüde iyileştirildi. Kafein ile tedavi, sakroplazmik retikulumdan ani bir kalsiyum salınımına neden oldu.

Bu tür geçici olaylar sadece uyarılmış hücrelerde bulundu. Kalsiyum salınım genliklerine bağlı olarak anlamlı derecede daha yüksek stimülasyon frekansı da vardı. Ek olarak, biyotellerde kültürlenen kardiyomiyositler, elektriksel stimülasyon ile daha da arttırılan embriyoid cisimlerdeki kültivasyona kıyasla daha iyi hERG ve içe doğrultucu akım yoğunlukları göstermiştir.

Geliştirilmiş içe doğru doğrultucu akımı, potasyum içe doğru doğrultucu kanal jean, KCN J2'nin artan ekspresyonu ile tutarlıydı. Otomatiklik, spontan atım yeteneği, embriyoid vücut kaynaklı kardiyomiyositlerde kontrollü biyotellere kıyasla anlamlı olarak daha yüksekti. Kontrol, altı hertz rejimine tabi tutulan biyotel hazırlığı ile karşılaştırılabilir otomatiklik gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, biyotellerin kurulumu yarım gün içinde yapılabilir.

Elektriksel stimülasyonun kurulumu birkaç saat sürecektir ve nihai sonuçlara iki hafta içinde ulaşılabilir. Bu prosedürü denerken, farklı hücre hatlarından veya farklı protokollerle farklılaşan kardiyomiyositlerin olgunluk ve saflıklarında biraz farklılık gösterebileceğini hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, hücrelerinize stimülasyon oranı gibi deneysel parametrelerin optimize edilmesi gerekebilir.

Bu prosedürü takiben, hücresel bileşimin varyasyonu ve mutant kardiyomiyositlerin kullanımı dahil olmak üzere diğer koşullar, bir dizi ek soruyu yanıtlamak için optimize edilebilir.