Name: Fare Spermatocytes segregasyonun kromozom hazırlanması yayılır (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Öğrenin fare spermatositlerinden mayozik kromozom yayılması hazırlama yöntemini. Bu teknik erkek mayozunu ve kromozom ayrışmasını incelemek için zengin hücre nüvesi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Abigail Harris teknik yardım kabul. Onlar da Paula Cohen ve Kim Holloway yüzeyine yayılmış çekirdeği fare spermatocytes üzerinden hazırlama Protokolü optimize etmek için yardımcı olduğunuz için kabul. Yazarlar ayrıca el yazması Karen Schindler tarafından eleştirel okuma için teşekkür ederiz.
Bu eser NIH R01 GM106262 için K.M.B. tarafından desteklenmiştir

Tüm yöntemleri fareler içeren yüksek etik ve sosyal standartları kullanılmaktadır ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım komite toplantısında Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından kabul edildi.
1. hazırlık çözümler ve gerekli aletleri
<ol><li>Hipotonik ayıklama arabellek (HEB) 50 mL ultrasaf laboratuvar sınıf su, pH 8.2-8.4 (tablo 1) hazırlayın. Taze her zaman buz üzerinde saklayın ve yayılır hazırlama 2 h içinde çözüm olun; Bu azaltmak ve DTT ve PMSF, faaliyetleri sırasıyla inhibe proteaz optimize etmek gereklidir. HEB 10 mL fare testis her çifti için kullanın.</li>
	<li>100 mM Sükroz çözüm (taze her zaman) ultrasaf laboratuvar için 10 mL sukroz 0.342 g ekleyerek sınıf su hazırlamak. 8.2 için pH ayarlama</li>
	<li>Sabitleştirici çözüm hazırlamak (%1 paraformaldehyde (PFA), % 0.15 Triton X-100, 9,2 1 N HCl veya 1 N NaOH ile ayarlanır pH) taze aylık ve mağaza oda sıcaklığında korumalı gelen ışık. Bir % 16 piyasada bulunan İngiltere'de yılın başlangıç hisse senedi 1 X PBS bir çalışma hisse senedi olarak kullanmak için % 4 oranında seyreltin ve % 4 aliquots-20 ° C'de depolayın<ol>
<li>Sabitleştirici çözüm hazırlamak için 10 mL % 4 İngiltere'de yılın çözeltisi ve 600 µL % 10 ekleyin Triton X-100 30 ml 1 X PBS, iyice karıştırın ve pH 1 N HCl veya 1 N NaOH ile 9.2 için ayarlayın. Sabitleştirici çözüm 50 mL konik tüp (en fazla 4 hafta boyunca) oda sıcaklığında alüminyum folyo sarılı saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fotoğraf-Flo 200 (slaytlar son 30 dk kurutma iken) yıkama çözümlerle hazırlamak: %0.4 fotoğraf-Flo 200/PBS (80 ml 1 X PBS fotoğraf-Flo 200 320 µL) ve % 0,4 fotoğraf-Flo 200/dH2O (40 mL ultrasaf laboratuvar sınıf su içinde fotoğraf-Flo 200 160 µL). 10 veya daha az slaytlar teker teker yıkamak için çözümler 40 mL ile dolu bir 50 mL Coplin kavanoz kullanın.</li>
	<li>Cihazlar hazırlamak: Cerrahi makas (Cilt deşmek için), 1 Çift 1 Çift iyi ipucu Cerrahi makas (karın zarını deşmek için), düz ince uç forseps, (her sınav incelemek için) 2 Çift 1 düz kenarlı (her testis deşmek için) jilet, 2 çift eğri (her testis hareketsiz ve seminifer tübüllerin sıkmak için) ipucu forseps, 50 mL Coplin kavanozlar, Teflon basılı 3 halka slaytlar, boyutu 11 bıçak, oksijen odası, 100 x 15 mm Petri yemekler, iyi ipucu kalıcı kalem veya kurşun kalem, 1 neşter ve bir Platform dönen shaker.<ol>
<li>Yer sigorta primi doldurulmamış buzlu sonunda cam slaytlar dik kavanozda kadar kullanmak sabitleştirici çözüm ile dolu 50 mL Coplin precleaned. Not: slaytlar etanol, Floresans in situ hibridizasyon gibi gerektiren işlemler daha sonra kullanılacaksa, kalem tercih edilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. spermatocyte çekirdeği Yayilim
<ol><li>Bir erkek fare (örneğin servikal yerinden çıkması veya CO2 boğulma olmadan) kurumsal yönergelere ötenazi.</li>
	<li>P10 - P20 erkek segregasyonun hücrelere sperma ilk dalga değerlendirmek için kullanın; P15 rutin olarak kullandığımız - hücreleri profaz ı. yetişkin testis sağlayacak tüm substages elde etmek için P17 erkek hücreleri profaz ben de, ama onlar da daha postmeiotic hücreleri, spermatids gibi ortaya çıkarır.</li>
	<li>Hasat ve (eşleştirilmiş ağırlıkları kaydetmek) testis tartmak; o zaman onları nemli tutmak için soğuk HEB birkaç damla içeren bir Petri kabına koyun.</li>
	<li>Testis çanak alt karşı eğri ipucu Forseps ile tutun ve küçük dikey Ensizyon testis kapsül yapmak için düz kenarlı jilet kullanın. Testis çanak alt karşı bir Forseps ile süre hareketsiz tutmak, testislerden seminifer tübüllerin hafifçe sıkmak için eğri ipucu forseps ve düz kenarlı jilet ikinci kümesi kullanın.<ol>
<li>Tübüllerin soğuk HEB, adet kapsül tüpün içine koyarak önlemek için dikkat çekici 10 mL içeren bir 15 mL konik tüp içine koyun. İkinci testis ile bu adımları yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>HEB testis büyüklüğüne bağlı olarak 30-60 dakika buzda içeren konik tüp decapsulated seminifer tübüllerin kuluçkaya. 30 mg tartı testislerde tanısal yaklaşım çifti üzerinden seminifer tübüllerin kuluçkaya veya 30 dk, 31-50 mg 60 dakika 30-45 dakika ve daha büyük testis için tartı testislerde tanısal yaklaşım çifti üzerinden tübüllerin için daha az. Bir tek testis için kez değiştirmeyin. Not: En iyi kuluçka süresi deneyci, kullanılan reaktifler ve analiz ediliyor fareler tecrübesine bağlı olarak değişebilir.</li>
	<li>Seminifer tübüllerin HEB içinde kuluçka iken, bir işaret veya kalem numarası, slayt numarası ve Tarih precleaned kaymak fare ile buzlu uçları etiketlemek için kullanın. O zaman önceden temizlenmiş slaytlar sabitleştirici solüsyon içeren bir Coplin kavanoza yerleştirin.</li>
	<li>Kuluçka tübüllerin ve HEB temiz bir Petri ve yaklaşık 3 mm çap kümeleri içine ayrı tübüllerin içine dökün. Her yığın 2 slayt verimleri ve vermiştir slayt sayısını testis boyutuna bağlıdır. Not: Biz vahşi türü ve subfertile Chtf18üzerinden 6 slayt 8 slaytlar elde-P16 testisler (segregasyonun ve Mitotik germ hücreleri8azalan sayıda nedeniyle daha küçük olan) null. 100 mg veya daha ağırlığında bir yetişkin testis 16 slaytlar verim beklenir.</li>
	<li>100 mM Sükroz çözüm bir Teflon bir halka içine yer 23 µL baskılı, 3 slayt halka ve bir yığın seminifer tübüllerin Yüzük'e ekleyin.  Sonra kullanarak yığın tutun, çözüm bulutlu hale gelinceye kadar yavaşça tübüllerin boyutu 11 jilet ile bin dereden su getirmek için ipucu forseps kavisli. Not: Bu parçalanmış kromozomlar yol açar gibi overmince değil. Parçalanmış kromozomlar da mutasyona uğramış bir fenotip göstergesi olabilir unutmayın.</li>
	<li>Enkaz kaldırma Sükroz çözüm başka bir 23 µL ekleyip hafifçe karışım yukarı ve aşağı için birkaç kez pipette için bir micropipette kullanabilirsiniz süspansiyon hücrelerde ayrı yardım.</li>
	<li>Sabitleştirici solüsyon içeren Coplin kavanoza iliklerine kadar bir slayt kaldırmak ve o bir cömert damlacık slayt alt köşesinde toplar böylece slayt kavanoz içinde tilt.<ol>
<li>Damlalıklı 20 µL Sükroz hücre süspansiyon üzerinden prim Teflon yazdırılan 3 yüzük slaytta sabitleştirici damlacık içine yüzük, buzlu cam slayt ve damlalıklı süspansiyon aşağı yukarı 2 - 3 kez. Not: (2,11 aşağıya bakınız) karışımı spread zaman Sükroz hücre süspansiyon bunu 20 μL eklenmesi kapsama tüm slayt sağlar böylece sabitleştirici damlacık hacmindeki yeterince büyük olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yavaş yavaş Slayt Slayt boyunca hücre süspansiyon yaymak için damlacık karşısında tarafa eğin. Sonra yavaş yavaş eğimli slayt arka tamamen karşılayacak slaydın genişliği boyunca hücre süspansiyon yaymak için. Aynı alanı hücreleri birbiriyle çakışır daha--dan bir kez aksi takdirde slaydın üzerinde süspansiyon yayılmasını önlemek.</li>
	<li>Hemen düz bir oksijen odasında slayt yerleştirin ve slaytlar yapmak için kullanılan seminifer tübüllerin adımlardan 2.8-2,11 tüm kümeleri kadar yineleyin. Yırtılma ve hücreleri örtüşen önlemek için kurutma işlemi sırasında oksijen odası oynatmamaya önemlidir.</li>
	<li>Böylece yavaş yavaş ve tamamen kuru 2,5 h için oda sıcaklığında kapalı bir oksijen odasında kuluçkaya slaytların izin. Yüksek nem ve yavaş bu adımda kurutma yeterli Kromatin yayılmasını sağlamak önemlidir. O zaman odası kapağını çıkarın ve slaytlar tamamen ek bir 30 dk kurumasını sağlar.</li>
	<li>Slaytlar (arkaya veya bir zikzak desen) % 0,4 fotoğraf-Flo 200/1 X PBS solüsyon içeren bir Coplin kavanoza yerleştirin ve slaytlar iki kez, 5 min yıka, yavaşça Coplin Tantanacı tarafından shaker dönen bir platform üzerinde kavanoz. Taze çözüm her yıkama için kullanın ve slaytlar her yıkama için farklı fareler ayrı kavanoz gelen tutmak.</li>
	<li>Coplin kavanozda % 0,4 fotoğraf-Flo 200/dH2O solüsyon 5 min için bir kez süre Tantanacı içeren slaytlar yıkayın.</li>
	<li>Coplin slaytlardan Kaldır (son yıkama) kavanoz, dikkatle kenarları ve dipleri aşırı sıvı kaldırmak için slaytları silin ve slaytlar kurumasını bir açılı, neredeyse dik konumda yer. Bu teknikte yetkin bir deneyci işlemek ve yüzey-yayılım çekirdeklerin 4 veya 5 fare--dan bir günde hazırlamak.</li>
	<li>Bir kez kuru (15-20 dk), işlem ayirt boyama veya mağaza-80 ° c ışık en fazla 2 hafta için korumalı bir sıkıca kapalı slayt kutusunda hemen slaytlarını (değerlendirilmekte; hedef proteinler bağlı olarak en iyi sonuçları elde aynı gün ya da 2 hafta içinde lekeli).<ol>
<li>-80 ° C'de depolanan, oda sıcaklığına kadar gelip 1 içeren bir Coplin kavanoza boyama önce 5 min için X PBS veya blok yıkayın slayt izin. Not: Birçok farklı ayirt boyama protokolleri iyi sonuçlar sağlayacaktır; Berkowitz vd immunostaining Protokolü ' li8bakın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+mammalian+meiosis%3A+regulation%2C+dynamics+and+impact+on+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li>
<li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li>
<li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li>
<li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li>
<li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li>
<li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li>
<li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li>
<li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996(2012).</li>
<li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li>
<li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+cohesins+in+mitosis%2C+meiosis%2C+and+human+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li>
<li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+in+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li>
<li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+elaboration%3A+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li>
<li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li>
<li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li>
<li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+premature+G2%2FM-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralının en kritik adımlar de yaymak, iyi kalite spermatocyte çekirdek sayısının fazlalığı elde etmek için HEB, seminifer tübüllerin kıyma uygun seminifer tübüllerin uygun kuluçka süresi içerir ve tekniği istihdam Sükroz hücre süspansiyon sabitleştirici kaplamalı slaytları arasında yayıldı. Biz vahşi türü erkeklerin testis dan kıyaslanabilir yaşlı Chtf18iken HEB yetişkinlikte 45 dk için için doğum sonrası gün 15 arasında değişen testislerde tanısal yaklaşım üzerinden seminifer tübüllerin kuluçkaya-ç...

Fareler yaygın olarak mayoz memelilerde çalışma için bir model organizma olarak kullanılır. Normal gelişim süreçleri ve mayoz sırasında oluşan hataları değerlendirilebilir. Zaman çizelgesi ve profaz sırasında ben ve substages oluşan belirgin özellikleri ilerlemesini yanı sıra çok sayıda belirli proteinlerin süreçleri mayoz düzenlenmesi için çok önemli yer vahşi türü ve mutasyona uğramış fareler karakterize edilebilir. Ben (Handel ve Schimenti1' gözden) ayrıntılı okudu mayoz sırasında oluşan birkaç özel işlemler. Bunlar DNA iki iplikçikli (DSB) formasyonu ve tamir, Rekombinasyon, synaptonemal kompleks oluşumu ve kromozom ayrımı içerir.
Segregasyonun süreçleri eğitimi önemli bir yönü optik ve görsel olarak daha iyi çözümlenir içeren homolog kromozomlar ayırt etmek ve profaz ı. profaz 5 substages oluşur substages tanımlamak çekirdeği incelemek için yeteneğidir Bu synaptonemal kompleksi (SC) oluşumu dahil olmak üzere belirli özellikleri ile karakterizedir. SC bir eşleştirme sağlar üçlü protein iskele ve DNA iki iplikçikli sonu tamiri homologs olduğunu. SC Aksiyel unsurları belirlenmiştir gibi leptonema sırasında homologs hizalayın. O zaman zygonema sırasında synaptonemal kompleks Merkezi elemanları ek eşleştirme ve fiziksel bağlantı (synapsis) homologs çiftleri arasındaki kolaylaştırır. Pachynema sırasında homologs synapsis tam olur ve DNA kesişim üzerinden homolog rekombinasyon DNA çift iplikli kırılmalara select nüfusu tamiri dan oluşur. SC diplonema sırasında homologs desynapse ama onların sentromerler ve DNA kesişim sitelerdeki bağlı kalır izin ayrıştırır. Son olarak homologs diakinesis sırasında recondense ve metafaz geçiş1oluşur.
Tarihsel olarak, yüzey saçan segregasyonun Kromatin, kaç hücre çekirdeği, özellikle de profaz erken dönemlerinde üzerinden vermiştir ben2. Sonuç olarak, bu yöntemleri dokuları (yani testis ya da yumurtalık) hücrelerden ayrılması, Yayilim segregasyonun Kromatin tekniği ve değerlendirme2,3, için yüksek kaliteli segregasyonun çekirdeği verimini artırmak için modifiye edilmiştir 4. buna ek olarak, bu yöntem nükleer koruyarak yararlı kanıtladı ve Kromatin bağlı proteinler segregasyonun çekirdekleri tarafından yayımlanan immunolocalization teknikleri5,6,7gösterildiği gibi. Bu nedenle, bu yöntem başlangıçta Engin2 tarafından açıklanan ve verimleri profaz leptotene, zygotene, pachytene, diplotene ve diakinesis substages geçiren homologs içeren birçok ayrı patlama spermatocyte çekirdeği aşağıda gösterildiği ben.
Yüzey-yayılım çekirdeği (Kromatin yayılmış analiz olarak da bilinir) hazırlama tekniği mayoz üreme ve hücre biyolojisi alanlarında çalışma için yaygın olarak kullanılır. Yüzey-yayılım çekirdek içeren slaytlar immunostained antikorlar proteinlere ilgi ile daha sonra olabilir veya gümüş boyama için tabi ve mikroskobu ile analiz. Yöntem hem erkek hem de dişi fareler için benzer olsa da değişiklikler için dişi fareler2tarif edilmistir. Seminifer tübüllerin overmince değil çok önemlidir. Çekirdeklerin da de immunostaining homologs takip böylece yaymak gerekir ve ilişkili proteinler mikroskobu ile açıkça görülmektedir. Yüzey-yayılım çekirdek sadece birkaç saat ve her iki immunostained hemen hazırlanmış veya en fazla 3 hafta önce çözdürme ve immunostaining-80 ° C'de depolanan. Ancak, en iyi sonuçları en iyi immunostaining hemen veya yüzey-yayılım çekirdeği hazırlama 2 hafta içinde gerçekleştirilirse bazı proteinler için elde edilir. Slaytlar-ebilmek var olmak immunostained karşı antikorlar için faiz, proteinlerin kullanarak standart bir protokol ile kuluçka ikincil antikorlar floresan için konjuge proteinler veya boya ile izledi, sonra Floresans mikroskobu8ile görüntüsü. Doğum sonrası gün 15-21, 6-10 slaytlar vermeye vahşi türü testisler çift başına yeterli doku işte ve büyük fareler (yetişkin dahil) daha fazla slayt verecektir. Ancak, farelerde vahşi tip 6 hafta yaş ve üstü de immunostaining takip slaytlara daha sonrası segregasyonun hücreleri (yani spermatids) ortaya çıkarır. Buna ek olarak, tüm substages profaz, ben çocuk ve yetişkin fareler görülebilmektedir. Testis erkek, doğum sonrası gün 10 ile 15 dan çok daha fazla leptotene ve zygotene hücre ortaya çıkarır. Doğum sonrası gün 14-15 büyük fareler daha fazla pachytene ve diplotene çekirdekleri ortaya çıkarır.
Burada biz tanımlamak ve yüzey-yayılım çekirdeği fare spermatocytes üzerinden hazırlama bir yaygın kullanılan yöntem göstermek.

<table><tbody><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>Kodak</td><td>1464510</td><td></td></tr><tr><td>%16 Paraformaldehit (formaldehit sulu çözelti)</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>RT 15710</td><td>%16'lık çözeltiyi 1X PBS ile %4 çalışma stoklarına seyreltin ve alikotları -20 °C'de dondurun; C</td></tr><tr><td>Teflon baskılı 3 halkalı slaytlar</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>63418-11</td><td></td></tr><tr><td>Premium şarjsız buzlu uçlu cam slaytlar</td><td>Birkaç ticari marka</td><td></td><td>Slaytları etil veya izopropil alkolde temizleyin ve kullanmadan önce kurumaya bırakın; slaytların sonraki kullanımına bağlı olarak buzlu uçtaki slaytları kalıcı bir işaretleyici veya kurşun kalemle etiketleyin</td></tr><tr><td>Cerrahi makas (keskin ve keskin uçlar)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-12</td><td>Benzer tipte farklı marka işe yarayacak</td></tr><tr><td>İnce uçlu cerrahi makas (keskin uçlar)</td><td>İnce Bilim Araçları</td><td>14058-11</td><td>Benzer tipte farklı marka işe yarayacak</td></tr><tr><td>Düz ince uçlu forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11050-10</td><td>Benzer türden farklı marka işe yarayacak</td></tr><tr><td>Kavisli orta uçlu forseps</td><td>Fisher</td><td>16100110</td><td>Benzer türden farklı bir marka işe yarayacak</td></tr><tr><td>Neşter sapı</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10003-12</td><td>Benzer türden farklı marka işe yarayacak</td></tr><tr><td>Fare anti-SYCP3</td><td>Abcam</td><td>ab97672</td><td>1:300'de kullanın</td></tr><tr><td>Anti-sentromer proteini (insan CREST hasta serumundan türetilmiştir)</td> <td>Antikorlar Dahil</td><td>15-234-0001</td><td>1:50'de kullanın</td></tr><tr><td>Nemlendirilmiş oda Nemli kağıt</td><td></td><td></td><td>ile 500 cm2 / kuyu Nunc kare kültür kapları kullanıyoruz havlular</td></tr><tr><td>Epifloresan Leica mikrosistemleri ile geniş alan mikroskobu</td><td></td><td>Herhangi bir standart model</td>Coplin kavanozları Birkaç ticari marka 50 ml kapasite; 40 mm (1,6 inç) çap, 10 slayt tutar (sırt sırta)Petri kapları Birkaç ticari marka 100 x 15 mm çap, polistiren steril işlenmemiş <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare spermatocytes segregasyonun kromozom hazırlanması yayılır

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Memeli mayoz germ hücrelerinde oluşur ve okudu ve karakterize dinamik bir gelişim işlemidir. Çekirdeği üzerinde slaytlar yüzeyine yaymak için bir yöntem kullanarak (onları bir yükseklikten atılan yerine), biz ilk olarak 1997 yılında açıklanmıştır bir en iyi duruma getirilmiş tekniği üzerinde fare spermatocytes göstermek. Bu yöntem yaygın olarak kullanılan yüksek kaliteli çekirdekleri profaz ı. seminifer substages geçiren bir bolluk verimleri çünkü memeli mayoz çalışma laboratuvarlarda tübüllerin ilk spermatocytes şişmeye Hipotonik çözeltilerine yerleştirilir. O zaman spermatocytes bir hücre süspansiyon oluşturmak için bir Sükroz çözümde serbest bırakılır ve çekirdekleri sabitleştirici bulanmış cam slaytlar yayılır. İmmunostaining, proteinler segregasyonun işlemlere konu ile ilgili bir çeşitlilik incelenebilir. Örneğin, protein synaptonemal kompleks kromozom eksen/çekirdek homologs, birlikte bağlayan bir üçlü yapı kolayca görselleştirildiği. DNA çift iplikli kırılmalara tamirde homolog rekombinasyon tarafından söz konusu, segregasyonun rekombinasyon proteinler de profaz ilerlemesini değerlendirmek için immunostained olabilir ben. Burada biz tanımlamak ve ayrıntılı olarak spermatocytes gelen çocuk ya da yetişkin erkek fareler içinde memeli mayoz çalışma için yaygın olarak kullanılan bir tekniği göstermek.

Bu yöntem yüzey çok sayıda yayılmış olduğu gibi homologs içeren çekirdeklerin sağlama yeteneği üç ana faktöre bağlıdır: 1) seminifer tübüllerin Hipotonik arabelleği yeterince elde etmek için (yani HEB) uygun kuluçka süresi arttı spermatocyte patladı ama üzerinden parçalanmaya değil çekirdek kuluçka HEB, 2 içinde uzun süreli) micropipetting birlikte clumped değil çekirdek ve 3 ayrı bir askıya almak için hücreleri Sükroz damlacıkları) her sabitleştirici devirme kaplı bir defada tek bir yönd...

Mayoz hangi gamet DNA ikileşmesi bir turu ve kromozom ayrışma birbirini izleyen iki tur üzerinden kurulan gelişimsel işlemidir. Memeli mayoz segregasyonun kromozom yayılır hazırlamak için bir teknik kullanarak incelenebilir. Burada, yüzey-yayılım çekirdeği fare spermatocytes üzerinden hazırlama yöntemi göstermektedir.

Fare Spermatocytes segregasyonun kromozom hazırlanması yayılır

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Bu protokolün genel amacı, erkek mayozunun incelenmesine olanak sağlamak için fare spermatositlerinden meiyotik kromozom yayılımları hazırlamaktır. Bu yöntem, üreme biyolojisi alanında meiyotik rekombinasyonu ve kromozom ayrılmasını düzenleyen mekanizmalar hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mayozun farklı aşamalarındaki, özellikle profaz 1'in alt evrelerinden geçen spermatosit çekirdeklerinin bol miktarda elde edilmesini sağlamasıdır.Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır çünkü spermatosit çekirdeklerini lamlara yaymak için kullanılan tekniği yazılı olarak aktarmak zordur. İşleme, postnatal dönemden yetişkinliğe kadar olan erkek farelerden alınan eşleşmiş testislerin tartılması ve tartılan örneklerin birkaç damla soğuk hipotonik ekstraksiyon tamponu içeren bir Petri kabına yerleştirilmesiyle başlayın. Tübülleri toplamak için, kavisli bir pensetin uçlarını kullanarak bir testisi kabın tabanına doğru sabitleyin ve testis kapsülü boyunca dikey, küçük bir orta hat insizyonu yapmak için düz kenarlı bir jilet kullanın.Seminifer tübülleri testisten nazikçe sıkıp çıkarmak için ikinci bir kavisli pens seti veya d

preparation-of-meiotic-chromosome-spreads-from-mouse-spermatocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Oosit mayotik olgunlaşması sırasında kromozom segregasyon hataları nedeniyle anöploidi yatkındır. Anöploid yumurta, kısırlık, düşüklere veya gelişimsel bozukluklar, Down sendromu gibi neden olabilir. Burada, yumurta ve mayotik olgunlaşma incelemek ve Ploidi değerlendirmek için yöntemler seçim malzemeleri tanıtmak için yöntemler açıklanmaktadır.

Fare Oosit Mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi Değerlendirmesi

Bu tübül squash teknik hızla hücresel bütünlüğünü koruyarak fare spermatocytes geliştirme saytolojik özellikleri değerlendirmek için hedeftir. Bu yöntem tüm aşamalarında spermatogenez çalışma için izin verir ve diğer biyokimyasal ve moleküler biyolojik yaklaşımlar için fare mayoz çalışmanın yanında kolayca uygulanabilir.

Seminifer tübül Squash tekniği fare modeli kullanarak sperma saytolojik analizi için

Oogenesis memelilerde özellikle kromozom missegregation nedeniyle hataya, olduğu bilinmektedir. Bu el yazması için fare profaz, yaymak Kromatin hazırlama yöntemleri açıklar metafaz ı ve II sahnelenen yumurtalar. Bu temel teknikler Kromatin bağlı proteinler ve kromozom morfolojisi memeli oogenesis boyunca çalışma sağlar.

Kromatin fare oosit ilerleme profaz metafaz II analizi için hazırlıklar yaymak

Burada sunulan pachytene spermatositler zenginleştirmek için bir protokol, yuvarlak spermatidler, ve yetişkin fare testislerinden uzayan spermatidler standart laboratuvar ekipmanları ile bir kesintili sığır serum albumin yoğunluğu gradyanı kullanarak.

Standart Laboratuvar Ekipmanları Kullanılarak Fare Testlerinden Pachytene Spermatosit ve Spermatidlerin Zenginleşmesi

Nükleer yüzey spreadleri, kekozis sırasında kromozom olaylarını incelemek için vazgeçilmez bir araçtır. Burada zebrabalığı spermatositlerinden profaz I sırasında meyotik kromozomları hazırlamak ve görselleştirmek için bir yöntem göstermek.

Zebrabalığı Spermatositlerinden Meiotik Kromozom Spreadlerinin Hazırlanması

Burada yetişkin fare testislerinden canlı meiotik ve post-meyotik mikrop hücrelerini izole etmek için basit ve etkili bir yöntem salıyoruz. Düşük sitotoksisite, menekşe heyecanlı DNA bağlayıcı boya ve floresan-aktive hücre sıralama kullanarak, bir birçok downstream uygulamaları için son derece zenginleştirilmiş spermatojenik hücre popülasyonları izole edebilirsiniz.

Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon

Bu makalede, erkek mayotik bölünmesi için değerli bir model olan abdominal cerrahi ve testiküler GSK923295 enjeksiyonu yoluyla CENP-E'nin in vivo inhibisyonu bildirilmiştir. İmmünofloresan, akım sitometrisi ve transmisyon elektron mikroskobu tahlillerini kullanarak, CENP-E inhibisyonunun fare spermatositlerinde kromozom yanlış hizalaması ve genom instabilitesi ile sonuçlandığını gösterdik.

Kinesin-7 CENP-E'nin In Vivo İnhibisyon, İmmünofloresan ve Akım Sitometrisi Kullanılarak Spermatositlerde Fonksiyonel Değerlendirilmesi

Sinapslardaki mayotik hatalar ve rekombinasyon, memeli oositlerinde yaygındır. Bu süreçlerde yer alan proteinlerin titiz analizi, oogenezin nasıl ve neden sıklıkla yanlış gittiğini anlamak için çok önemlidir. Burada sunulan teknikler, farelerde oosit kalitesini değerlendirmek için rekombinasyon ve sinapsların kapsamlı bir şekilde izlenmesine izin verir.

Sinapsis ve Rekombinasyonun Değerlendirilmesi için Fare Oositlerinden Mayotik Kromozom Yayılımlarının Hazırlanması

Bu video gentleMACS Dissociator kullanarak fare dalak tek hücre süspansiyonları hazırlamak için otomatik doku ayrılma için basit, zaman tasarrufu sağlayan bir teknik açıklar.

Fare Dalak gentleMACS Dissociator Tek Hücreli Cezalar hazırlanması

Belirli doku tiplerinin hücreleri Dissociating doku ajitasyon için belirli parametreler uygulanabilir kültürlenebilen hücrelerinin yüksek ses elde etmek için gereklidir. Miltenyi gentleMACS dissociator basit, pratik bir protokol ile bu görevi en iyi hale getirir. Bu yayında akciğer dokusunda bu cihazların kullanımı açıklanmıştır.

Standardize Hazırlık gentleMACS Dissociator kullanarak Fare Akciğer Doku Tek Hücre Cezalar

Öğrenin fare spermatositlerinden mayozik kromozom yayılması hazırlama yöntemini. Bu teknik erkek mayozunu ve kromozom ayrışmasını incelemek için zengin hücre nüvesi sağlar.

Fare Spermatocytes segregasyonun kromozom hazırlanması yayılır

Daha fazla video keşfet