Name: Tek hücre TCR yalıtım ve üretme-in Vitro için Retroviral Vektörler ve In Vivo ifade insan TCRs aerodinamik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Öğrenin tek hücre TCR alfa ve beta zincir izolasyonu ve retroviral vektör üretimi yöntemini. Bu protokol insan TCR'lerinin in vivo fonksiyonelliğini analiz etmek için immünoloji araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 PILOT PJ ve Robert ve Janice McNair Vakfı tarafından finanse edildi.
Biz Sandra Pena ve Andrene McDonald hasta işe alım, Samuel Blum için teknik destek, Dr George Makedonas antikorlar ve kontrol DNA PCR optimizasyonu için kullanılan hediye için teşekkür ederim.

1. ilgi T hücre nüfusu tanımlamak.
 Not: antijen belirli hücre bölünmesi boya (gibi Carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE) ile birlikte nükleer silahların yayılmasına karşı-ebilmek var olmak kullanılmış-T hücreleri izole etmek için onların nükleer silahların yayılmasına karşı yanıt olarak antijenik stimülasyon dayalı. PBMCs başlayan, 7 günlük vitro genişleme bir antijen belirli CFSE düşük nüfus 12 tanımlamak için yeterli olmalıdır.
<ol><li>Mix PBMCs besleyici MHC eşlemeli hücreleri ve etiket 5 µM CFSE hücre bölünmesi boya ile 1:1.</li>
	<li>Plaka 2-2,5 x 10 5 hücre başına iyi bir 96-şey yuvarlak-alt plaka 200 µL % 10 FCS tam RPMI medya kültür. 
	Not: Tam RPMI içeren 2 mM l-glutamin, 1 mM sodyum pyruvate, 100 µM MEM önemli olmayan amino asitler, 5 mM HEPES, 5.5 × 10 &#8722; 5 2-mercaptoethanol birimleri, 100 U mL &#8722; 1 penisilin ve 100 µg mL &#8722; 1 streptomisin.</li>
	<li>Teşvik hücreleri 25 µM peptid antijen ile.</li>
	<li>Kültür dördüncü gününde dikkatle kaldırın ve medya 100 µL değiştirin. 
	Not: Peptit-HLA tetramers 13 kullanımı antijen spesifik T hücre kimliği için daha uygun bir yaklaşımdır. Tetramer boyama sağlar antijen özgüllük gibi HLA-kısıtlama eşzamanlı değerlendirilmesi için.</li>
</ol> 2. Tek hücre sıralama ayarlayın.
<ol><li>Perform tüm yordamları bir başlık veya belirlenmiş bir alanda güçlendirilmiş şablon / ücretsiz. Aliquot, kontaminasyon reaktifleri temiz tüm çalışma yüzeyleri ve mümkünse, ekipman % 10 ile çamaşır suyu önce PCR Kur. Filtre ipuçları, RNAse ve Dnaz ücretsiz reaktifler ve plastik PCR ve adımları klonlama vektör kullanın. Anahtar reaktifler Malzemeler tablo bulundu. 
	Not: Çoklu PCR reaksiyon son derece duyarlıdır ve kirlenme seviyesinin düşük güçlendirilmiş üründe neden olur.</li>
	<li>Generate 10 x RT tepki birleştirerek ters transkripsiyon ana mix tampon, 25 X DNTPs, 9 U RT enzim, % 0,01 Triton-X, 0.7 U RNAse inhibitörü ve 383 nM (Tablo 1 ' de listelenen) her RT-TCR astar steril pipetting Reservoir. Pipetting sırasında sıvı kaybı telafi etmek için her 96-şey plaka için 10 ek reaksiyonlar (Toplam 106), için yeterli ana karışımını oluşturur. Reaksiyon bileşenleri ve iyi başına tutarları için bkz: Tablo 2.</li>
	<li>Hazırlama bir 96-şey PCR koleksiyon plaka hücre başına iyi bir çok kanallı pipet ile ters transkripsiyon ana karışımı pipetting 6 µL sıralama için. Plaka buz veya soğuk bir blok içinde devam.</li>
	<li>Etiket (örneğin, CD4 ve CD3, veya CD8 ve CD3, her biri 2 µg/mL, hücre bölünmesi boya veya boyama tetramer) yüzey işaretleyicileri hücre için antikorlar içeren hücreleri.</li>
	<li>Bir sıralama T hücreleri hücre başına iyi, bir negatif kontrol görev yapacak on ikinci satır atlanıyor. 
	Not: Sıralama verimliliğini kesin toplama plaka hizalama plaka sahibi gibi hücreleri ve plakaları cDNA reaksiyon önce düşük ısıda muhafaza içinde bağlı olacaktır. Koleksiyon tabakları buz üzerinde her zaman, dışında onlar içinde soğutma plaka tamir ederken, sıralama sırasında tutulmalıdır. Tüm sorters bir sıcaklık düzenlenmiş plaka sahibi ile donatılmıştır; Ancak, bir kullanımı önerilir. Sıralama genellikle yaklaşık 10-15 dk plaka başına alır bu yana, olup olmadığını RNA bozulması için artan bir potansiyel plaka bir düşük sıcaklıkta korunmaz.</li>
	<li>Pozitif bir denetim olarak hücreleri (100 hücreleri) daha çok sayıda el ile bir pipet ile kuyuları için bu aşamada ekleyin. Alternatif olarak, daha önce izole RNA havuza alınan hücrelerden bir olumlu denetim 10, kullanılabilir ng iyi başına. 
	Not: saf denetim RNA hassasiyetle pipet ve Çapraz bulaşma diğer wells ve yanlış pozitif sonuçlar önlemek için dikkat.</li>
	<li>Yapıştırıcı film ile plaka mühür ve spin aşağı vasıl 1000 x g 5 min için saat 4'te ° C.</li>
	<li>Hemen uyarlamak RNA cDNA için 25 ° c 10 dk, 37 ° C için 45 dk, plaka kuluçka ve 10 dk. 85 ° C 
	Not: verimli PCR reaksiyon emin olmak için ilk PCR reaksiyon aynı gün yapılması önerilir. Alternatif olarak, kopya etmek plakaları-80 ° C'de 2 aya kadar tutulabilir.</li>
</ol> 3. Multiplex iç içe PCR gerçekleştirmek Not: tüm ana karıştırır kirlenmesini önlemek için bir temiz ücretsiz şablon alanda hazırlayın.
<ol><li>Sulandırmak her değişken bölge astar Dnaz ve RNAse free H 2 O. ile 100 µM Daha sonra her birinin V-Alfa astar havuzu oluşturmak için 44 astar 20 µL birleştirin. Astar havuzu V-beta oluşturmak için her biri 40 V-beta astar artı 80 µL Dnaz ve RNAse free H 2 O. dizileri Tablo 1 ' de listelenen astar 20 µL birleştirir. Havuza alınmış bir kez her astar karışımında 2.3 µM bölgedir.</li>
	<li>Sabit bölge astar Dnaz 100 µM hisse senedi çözüm için sulandırmak ve RNAse free H 2 O. Dilute 10 µM çalışma çözüm ve aliquot kullanılmak için sabit bölge astar.</li>
	<li>İki ayrı ana karışımları TCR-Alfa ve TCR-beta amplifikasyon için hazır olun. 5 X birleştirerek ana karışımları oluşturmak tampon, 80 µM dNTPs, % 3 DMSO, 2 µM astar Havuzu (46 son konsantrasyonu nM her astar için), 200 nM TCR-sabit bölge ters astar, 1 U DNA polimeraz ve Dnaz ve RNAse free H 2 O (Tablo 2 ). Pipetting sırasında sıvı kaybı telafi etmek için yeterli ana mix 10 ek reaksiyonlar (Toplam 106), için her 96-şey plaka için makyaj. 
	Not: Son şey, nerede 22.5 µL ana PCR karışımı 2.5 µL cDNA şablonu ile birleştirilmiştir başına 25 µL PCR hacmi hesaplamaları dayanır.</li>
	<li>Plaka cDNA buz veya soğuk bir blok ile tutun. Bir çok kanallı TCR-beta tepki yeni bir 96-şey PCR tabak içine 22.5 µL pipet için kullanın. Sonra cDNA 2.5 µL PCR plaka aktarmak için bir çok kanallı kullanın.</li>
	<li>Bir çok kanallı TCR-Alfa tepki içine doğrudan cDNA kalan içeren plaka 22.5 µL pipet kullanın.</li>
	<li>Yapıştırıcı, yavaşça girdap ve spin aşağı vasıl 1000 x g 5 min için saat 4'te plakalarının ° C.</li>
	<li>Multiplex PCR reaksiyon ile aşağıdaki devir çalıştırın: 95 ° C'de 5 dk 20 34 döngüsü tarafından takip s 95 ° c, 30 s 54 ° c ve 1 dk. 72 ° C'de 72 7 dakika izledi ° C.</li>
	<li>Taşıma 25 son bir hacim içinde iç içe geçmiş PCR reaksiyon dışarı µL, multiplex PCR karışımı 2.5 µL şablon olarak kullanarak.
	<ol><li>İle Dnaz ve RNAse free H 2 O. olun 10 µM aliquots çalışan hisse senedi için 100 µM için iç ve adaptör astar reconstitute.</li>
		<li>İki ayrı ana karışımları TCR-Alfa ve TCR-beta ampl için hazırlanın.ification. Mix 5 X arabellek, 25 X DNTP, % 3 DMSO, 200 nM ileri adaptör astar, 200 nM ters iç içe astar, 1 U DNA polimeraz ve DNA polimeraz ve nükleaz ücretsiz H 2 O 22.5 µL (Tablo 2) son bir birim için. Pipetting sırasında sıvı kaybı telafi etmek için yeterli ana mix 10 ek reaksiyonlar (Toplam 106), için her 96-şey plaka için makyaj. 
		Not: ikinci PCR reaksiyon kullanımda 5 X PCR tampon yükleme özel jel kolaylaştırmak için içeren yükleme boya.</li>
		<li>Bir çok kanallı, kullanarak ana karışımları iyi başına 22,5 µL adlı TCR-Alfa ve TCR-beta tepkiler iki yeni 96-şey PCR tabak içine pipette.</li>
		<li>Şey başına 2.5 µL, multiplex PCR reaksiyon şablonu ekleyin. 
		Not: Kalan ilk PCR reaksiyon gereken mühürlü ve gerekli olursa ek şablon, bir kaynağı olarak hizmet için-20 ° C'de depolanan (4.3 Not adım bkz:).</li>
		<li>Plakaları, yavaşça girdap ve spin aşağı vasıl 1000 x g 5 min için saat 4'te mühür ° C.</li>
		<li>İç içe geçmiş PCR reaksiyon ile aşağıdaki devir çalıştırın: 95 ° C'de 5 dk 20 34 döngüsü tarafından takip s 95 ° c, 30 s 56 ° c ve 1 dk. 72 ° C'de 72 7 dakika izledi ° C.</li>
		<li>Çalıştırmak 5 µL % 1 özel olarak tepki son jel içeren etidyum bromür (negatif ve pozitif kontrol wells de dahil olmak üzere). 
		Not: Beklenen grup yaklaşık 500 bp boyutunda çalıştırmalısınız. Şekil 2 ' deki bir örnek tepki.</li>
		<li>Bir 96-şey biçimi PCR arıtma seti kullanarak ikinci reaksiyon (20 µL) kalan arındırmak, 70 ° C H 2 O şey başına 15 µL ile elute ve Sanger gerçekleştirmek sıralama. (Tablo 1) sıralama için uygun TCR-alfa veya TCR-beta adaptör ileri astar kullanın. 
		Not: Dizileri online kullanılabilir immunogenetics yazılımı ile çözümlenebilir.</li>
	</ol></li></ol> 4. PCR zincirleri Alfa ve beta alt klonlama.
 Not: ilk tepki olarak kullanılan ileri astar ve ikinci PCR reaksiyon geriye doğru astar havuzu kısıtlama siteleri birleştirmek için kullanılır. Bu nedenle, elde edilen alpha ve beta zinciri PCR ürünleri sırayla alt şablon retroviral vektör ( şekil 1) klonlanmış olmaya hazır mısınız.
Belgili tanımlık beta Urun <ol><li>Özet arıtılmış PCR iç içe tepki ile BstbI ve MfeI (Tablo 3). 
	Not: 5 µg Ekle aşmamaktadır.</li>
	<li>Paralel olarak, BstbI ve MfeI (Tablo 3) ile şablon vektör sindirmek. 1-2 µg şablon vektörünün TCR başına kullanın. Üzerinde bir özel jel sindirilir vektör çalıştırmak ve daha büyük grup (~ 7500 bp) yalıtır. Bir jel DNA arıtma kiti ile vektör arındırmak. 
	Not: restriksiyon enzimi Özet sırasında şablon fare TCR-beta değişken bölge, insan TCR-beta değişken bölge eklenmesi için izin kaldırılır.</li>
	<li>Arındırmak PCR arıtma kiti kullanılarak sindirilir PCR ürünleri. 
	Not: kit ile birlikte sütunları DNA arıtma kapasitesine doğrulayın; birden fazla sütun kullanın. Arıtılmış ekleme başarılı tüp ligasyonu reaksiyon için gerekli minimum meblağ 50 dır 10 ng/µL en az bir konsantrasyon, ng. Arıtılmış Ekle tutar için başarılı bir ligasyonu yeterli değilse, ikinci PCR reaksiyon tekrar edilebilir.</li>
	<li>37 ° C'de ısı inactivation 75 10 dk ardından kendini ligasyonu önlemek için şablon vektör 1 h için 10 U CIP enzim ile tedavi ° C. arındırmak DNA ile bir PCR arıtma Kiti (Tablo 3).</li>
	<li>Ligate TCR-beta takın ve oda sıcaklığında 30 dk için DNA ligaz 6 molar aşırı ucun 20 µL toplam birimi kullanarak vektör. 
	Not: Toplamda, yaklaşık 150 ligasyonu tepki içermelidir ng DNA (Tablo 3).</li>
	<li>Dönüştürmeleri için ligasyonu tepki 8 µL 80 µL kimyasal olarak yetkili E.coli DH5α hücrelerinin (Malzemeler tablo) ile karıştırın ve 30 dk. 45 s. eklemek 500 µL için 42 ° C'de ısı şok buz üzerinde kuluçkaya Super En iyi suyu Catabolite bastırma (S.O.C.) orta ve sallamak için 1,5 saat 37 ° c</li>
	<li>Plaka 250 dışarı µL bakteriyel kültür Lysogeny suyu (LB) agar plaka içeren bir Ampisilin üzerinde. Plaka gecede (~ 16 h) 37, kuluçkaya ° C.</li>
	<li>Ertesi gün bakteri kolonileri almak ve gecede Ampisilin içeren 3 mL LB ortamda büyümek. DNA plazmid arıtma kit kullanarak plazmid DNA izole.</li>
	<li>Beta zincirinin başarılı ekleme tarafından küçük ölçekli test Özeti enzimleri BstbI ve MfeI ile onaylayın. Bir 12 µL toplam reaksiyon hacminde 200-500 µg plazmid DNA, 0,25 µL her enzim ve 10 X enzim tampon (Tablo 3) oluşur. Reaksiyon dışarı Ekle grup boyutunu onaylamak için etidyum bromür içeren bir % 1'özel jel üzerinde çalıştırmak (~ 500 bp).</li>
	<li>Ekleme varlığı onayladıktan sonra sıra IRES ters astar (Tablo 1) kullanarak vektör TCR-beta bölümü.</li>
	<li>Sıra onay TCR-beta ucun takip Alfa değişken bölge ekleme için benzer işlemler gerçekleştirmek. Alfa iç içe tepki ve SnaBI ve SacII ile vektör içeren yeni oluşturulan TCR-beta INSERT arıtılmış PCR Urun sindirmek. 
	Not: restriksiyon enzimi Özet sırasında şablon fare TCR-Alfa değişken bölge, insan TCR-Alfa değişken bölge eklenmesi için izin kaldırılır.</li>
	<li>Ligate Alfa ekler içine oda sıcaklığında 30 dk için DNA ligaz 6 molar aşırı ucun 20 µL toplam birimi kullanarak karşılık beta değişken bölge kodlaması TCR vektörel çizimler. 
	Not: Toplamda, yaklaşık 150 ligasyonu tepki içermelidir ng DNA (Tablo 3).</li>
	<li>Dönüştürmeleri için ligasyonu tepki 8 µL 80 µL kimyasal olarak yetkili E.coli DH5α hücrelerinin (Malzemeler tablo) ile karıştırın ve 30 dk. 45 s. eklemek 500 µL S.O.C. için 42 ° C'de ısı şok buz üzerinde kuluçkaya Orta ve sallamak için 1,5 saat 37 ° c</li>
	<li>Plaka 250 dışarı µL bakteriyel kültür Lysogeny suyu (LB) agar plaka içeren bir Ampisilin üzerinde. Plaka gecede (~ 16 h) 37, kuluçkaya ° C.</li>
	<li>Ertesi gün bakteri kolonileri almak ve gecede Ampisilin içeren 3 mL LB ortamda büyümek. DNA plazmid arıtma kit kullanarak plazmid DNA izole.</li>
	<li>Alfa zinciri başarılı ekleme tarafından küçük ölçekli test Özeti enzimleri SnaBI ve SacII ile onaylayın. 12 µL toplam reaksiyon hacminde 200-500 µg plazmid DNA, 0,25 µL her enzim ve 10 x enzim tampon (Tablo 3) oluşur. Reaksiyon dışarı Ekle grup boyutunu onaylamak için etidyum bromür içeren bir % 1'özel jel üzerinde çalıştırmak (~ 500 bp).</li>
	<li>Ekleme varlığı onayladıktan sonra sıra MSCV2 ileri astar (Tablo 1) kullanarak vektör TCR-alfa bölümünü.</li>
	<li>Alfa zinciri sıra doğrulandıktan sonra sıralama ile TCR-beta-ters ve IRES mütedavil astar (Tablo 1) tarafından tam TCR Ekle doğrulayın.</li>
</ol> 5. TCR hücre yüzey ifade ve özgüllük doğrulayın.
 Not: HEK293T hücreleri başarılı TCR zincir PARI sınamak için kullanılırNG ve hücre ifade ( şekil 3A) 8 yüzey. Peptid-MHC tetramer boyama da gerçekleştirilebilir antijenik özgüllük yazı TCR gen yalıtımı ( şekil 3B) saklamak için test etmek için transfected HEK293T hücrelerde.
<ol><li>Plaka dışarı HEK293T hücreler 12-iyi doku kültürü plakaları, 1 mL tam DMEM medya içeren % 5 FCS kuyuda başına 1 x 10 5 hücre ve kültür gecede at 37 ° C. plaka ayrı wells her yeni TCR için tanımladığınız için yeterince hücre dışarı , denetim şablonu TCR vektör, CD3 vektör sadece, kontrol TCR vektör tek ve bir transfected de. 
	Not: Transfection bir şablonla tam olarak fare TCR vektör (mTCR-pMIA) kombinasyonu ile mCD3εγδζ-pMIG vektör, vektör yalnız, mTCR-pMIA ve mCD3εγδζ-pMIG vektör yalnız pozitif ve negatif denetimler kullanılır. 
	Not: Tam DMEM 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum Pyruvate, 100 µM içerir Sigara-esansiyel Amino asitler, 5 mM HEPES tampon, 5,5 x 10 -5 ünite 2-mercaptoethanol, 100 U/ml penisilin/streptomisin.</li>
	<li>Ertesi gün 1 µg chimeric h/mTCR-pMIA vektör, 1 µg fare CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) vektör ve üretici talimatları lipozom tabanlı transfection reaktif hücrelerle transfect.</li>
	<li>Her TCR için 6 µL transfection reaktif 100 µL oda sıcaklığına, serum-Alerjik DMEM ekleyin. Kısaca girdap ve 15 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
	<li>Ayrı 1,5 mL tüpler TCR-pMIA vektör 1 µg 1 µg fare CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) vektör veya denetimler için ayrı her vektör 1 µg birleştirin.</li>
	<li>Dropwise, vektör DNA içeren tüpler transfection reaktif/DMEM çözüm ekleyin. 15 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
	<li>Dropwise, HEK293T hücrelere transfection reaktif/DMEM/DNA çözüm ekleyin. Yavaşça karıştırın için plaka dokunun. 24 h için 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Sonra 24 h ortamı, değiştirin ve hücreler kültür ek 24 h için tutmak</li>
	<li>Kaldırmak hücreleri plaka dinç pipetting tarafından ve anti-fare CD3 antikor (2,5 µg/mL) Akış Sitometresi tarafından chimeric TCR yüzey ifade doğrulamak için hücrelerle leke.</li>
	CD3 ifade benzer bir seviyeye transfected hücreler arasında karşılaştırmak için <li>kapı hücreleri floresan muhabir molekülleri (CD3 kompleksinin için GFP ve Ametrine TCR ifade vektör için) benzer yüksek düzeyde ifade analiz. En iyi şekilde, analiz geçişli GFP + Ametrine + 10 içindeki hücreleri 4 ' e 10 5 floresan yoğunluğu ( şekil 3A). 
	Not: Sahip chimeric yapı transfected hücrelerin CD3 ifade düzeyini kontrol fare (özgün şablon) vektör ( şekil 3A) yakın olabilir. Oluşturulan TCR retroviral vektörler vivo içinde ifade sistemleri ile uyumlu yukarıda açıklanan 4.</li>
</ol>

<ol><li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+development+and+the+CD4-CD8+lineage+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision.</a> Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).</li>
<li>Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+fate+and+intense+debate%3A+myths%2C+models+and+mechanisms+of+CD4-+versus+CD8-lineage+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice.</a> Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).</li>
<li>Tubo, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+naive+CD4%2B+T+cells+from+a+diverse+repertoire+produce+different+effector+cell+types+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection.</a> Cell. 153 (4), 785-796 (2013).</li>
<li>Sprouse, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+and+expression+of+human+TCRs+in+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice.</a> J Immunol Methods. , (2016).</li>
<li>Lennon, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+islet+accumulation+in+type+1+diabetes+is+a+tightly+regulated%2C+cell-autonomous+event%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event.</a> Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).</li>
<li>Dash, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+analysis+of+TCRalpha+and+TCRbeta+chains+at+the+single-cell+level+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice.</a> J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).</li>
<li>Kobayashi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+cloning+and+expression+system+yields+and+validates+TCRs+from+blood+lymphocytes+of+patients+with+cancer+within+10+days%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days.</a> Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).</li>
<li>Szymczak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+multi-gene+deficiency+in+vivo+using+a+single+%27self-cleaving%27+2A+peptide-based+retroviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector.</a> Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).</li>
<li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li>
<li>Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+receptor+retrogenic+mice%3A+a+rapid%2C+flexible+alternative+to+T-cell+receptor+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice.</a> Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).</li>
<li>Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+T-cell+selection+in+vivo+using+T+cell-receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice.</a> Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).</li>
<li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).</li>
<li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen+specific+CD4%2B+T+cells+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+percentage+of+peripheral+T+cells+with+two+different+T+cell+receptor+alpha-chains+and+of+their+potential+role+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity.</a> J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).</li>
<li>Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+Transduction+of+Bone+Marrow+Progenitor+Cells+to+Generate+T-cell+Receptor+Retrogenic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li>
<li>Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+T+cell+receptor-retrogenic+mice%3A+improved+retroviral-mediated+stem+cell+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer.</a> Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).</li>
<li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+%28TCR%29+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR%2FCD3+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Geçerli protokol tek hücre TCR amplifikasyon ve sonraki eşleştirilmiş TCR alpha ve beta zincirleri bir şablon retroviral ifade vektör alt klonlama için verimli bir yöntem açıklanmaktadır. Her ne kadar bazı tek hücre PCR protokollerine geliştirilmiştir, hiçbiri defa hemen bir ifade vektör alt klonlama ile uyumlu olması. Çoğu durumda, son derece değişken CDR3 bölgeleri kapsayan bir kısmi sıra, değişken bölge ulaşmak için yeterli sırası ile güçlendirilmiş. Bu daha küçük PCR ürün boyutu yüksek PCR verimliliği destekler, anca...

T hücre reseptör (TCR) T hücre kaderi karar geliştirme, kararlı duruma/homeostazı ve çevre1,2,3' te antijenik stimülasyon sırasında belirler. Son teknolojileri sıralama derin genişlemesi antijen belirli T hücre yanıt içinde daha önce değersiz bir TCR çeşitlilik ortaya çıkardı. TCR çeşitlilik işlevsel olarak geniş T hücre yanıt için bir potansiyel göstermektedir. TCR dizi repertuar analizi TCR fonksiyonel deneyleri ile entegrasyon için sıralama yaklaşımlar deneysel sistemleri ve seçin sonraki fonksiyonel analiz için kullanılan vivo içinde modelleri ile uyumlu olacak şekilde tasarlanmış olmalıdır TCRs. Biz insan TCR sıra izolasyonu için etkili bir yaklaşım geliştirdik ve TCR ifade HLA insanlaşmış fareler4ile uyumlu bir chimeric insan/fare TCR şablon vektör içine alt klonlama aerodinamik. Heterodimeric TCRs karşılık gelen alpha ve beta zincirleri yalıtımı PCR güçlendirme tek bir hücreden her iki zincirlerinin gerektirir. Rağmen birkaç tek hücreli TCR klonlama protokol geliştirilen ve kullanılan, hiçbiri defa kolayca yüksek üretilen iş kolaylaştırılmış doğrudan bilinmeyen Vα/Vβ TCRs retroviral vektörler yeniden ifade için içinde vivo gerekli içine klonlama ile uyumlu olması 4,5,6,7. Önceki çalışmalarda iki ana yaklaşım, ya seçerek sıra tahmin veya tüm TCR sıra4,5,6 yükseltmek için yeterli TCR sınırlı bir bölümünü yükseltmek için kullanılan , 7. ilk yaklaşım elde edilen TCR sıralarının aşağı akım fonksiyonel analiz gerektirir pahalı silico montaj ve de novo inşaat TCR. İkinci yaklaşım tam TCR sıra sağlamasına karşın, insan sabit bölge fare modellerinde klonlanmış TCRs vivo içinde ifade ile uyumlu değildir. Yaklaşımımız TCRs in vivo fare modelleri fonksiyonel analiz ile uyumlu olacak şekilde özel olarak tasarlanmıştır. Bir verimli ve rahat tek hücre doğrudan PCR parçalarının şablon ifade vektör alt klonlama için sağlar PCR Protokolü geliştirdik.
Bizim yaklaşım iki adımda gerçekleştirilen bir son derece hassas multiplex iç içe PCR reaksiyon kullanır. İlk multiplex tepki adım 40 astar V-beta zincirler için belirli bir havuz ve 44 astar tüm V-Alfa zincirleri TCR-alfa veya TCR-beta (Tablo 1) serisi ön bilgi olmadan yükseltmek için kullanılan belirli bir havuz. İleri astar 5' PCR ürününün dahil bir adaptör sırası vardır. Ters astar TCR sabit bölge üzerinde temel alır. Biz belirledik benzersiz kısıtlama siteleri yok insan değişken veya kavşak TCR bölgeler ve bunlar yeni redesigned TCRα ve TCRβ astar (şekil 1) içine dahil. İkinci iç içe geçmiş tepki olarak bir astar olarak adaptörü sırası için belirli ve sürekli bölgesi içinde iç içe geçmiş bir ters astar daha da artan özgüllük ile (Tablo 1, şekil 1) TCR zincir yükseltmek için kullanılır. Tek hücre izolasyon sonra iki PCR yuvarlar (ilk tepki Vα ve Vβ astar havuzu olan ve ikinci adaptör astar ile) neden doğrudan şablon retroviral vektör alt klonlanmış bir PCR ürünü olup. Son TCR yapı, bir tek açık okuma çerçevesi (ORF), 'kendi kendine sıyırmada' protein sırayla bağlı fare sürekli bölgeleri ile birlikte insan değişken bölgeler içinde kodlar P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. P2A sırası birden çok sistemlerinde kullanılan ve TCRs8,9,10,11Ifade özellikle kapsamlı olarak sınanmıştır. Her ne kadar sonra çeviri P2A sıra kalır çoğu bağlı için C-terminus beta zinciri sinyal sıra ek bir prolin, bu değişiklik ise esnek bir bağlayıcı tarafından bağlı Alfa zincirinin TCR işlevi üzerinde zararlı bir etkisi yoktur. Fare sürekli bölgesi insan yerine yapısında sinyal akış yönündeki bileşenlere ile potansiyel değişmiş etkileşimleri önlemek için kullanılır ne zaman fare hücrelerinde yeniden dile getirdi. Tek ORF alpha ve beta zincirleri9,11stokiometrik ayrı ifade neden olur. Geçerli protokol reaktifler ve yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar dayanmaktadır ve aerodinamik ve verimli bir şekilde yapılması için tasarlanmıştır. Biz özellikle otoimmün diyabet karıştığı self-reactive T hücrelerden TCRs tahlil için bu tekniği kullanmış olsa da, biz bu protokolü kimlik ve insan TCRs için belirli bir işlevsel değerlendirme için yaygın olarak uygulanabilir olabilir tahmin Otoimmün epitopları, kanser epitopları veya yanıt patojenlerin ve aşılar.

<table><tbody><tr><td>CFSE&nbsp;</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>65-0850-84</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>anti-insan CD4 (OKT4) BV421</td><td>Biyoefsane &</td><td>317433</td><td>2 mg / mL</td></tr><tr><td>anti-insan CD3 (OKT3) PerCP / Cy5.5</td><td>Biolegend & nbsp;</td><td>317336</td><td>2 mg / mL</td></tr><tr><td>anti-fare CD3 AF647</td><td>Biolegend &nbsp;</td><td>100322</td><td>2.5 mg/mL</td></tr><tr><td>Rekombinant RNAse inhibitörü biyoteknolojik grd 2.5KU&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>97068-158</td><td>0.7 U</td></tr><tr><td>Uygulamalı Biyosistemler Yüksek kapasiteli cDNA RT kiti ve nbsp;</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>4368814</td><td>9 U (RT enzimi)&nbsp;</td></tr><tr><td>NF-H2O: Nükleaz içermeyen su 1000mL</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq DNA polimeraz 2500U</td><td>VWR</td><td></td><td>PAM3008 1 U</td></tr><tr><td>96 Kuyu Yarım Etek PCR Plakası</td><td>Phoenix</td><td>MPX-96M2</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Şeffaf Yapışkan Film&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>4306311</tr><tr><td>UltraPure Agaroz&nbsp;</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>SnaBI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0130</td><td>15 U (kesici uç) 30 U (vektör)</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0157</td><td>40 U (insert) 80 U (vektör)</td></tr><tr><td>MfeI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R3589S</td><td>40 U (kesici uç) 80 U (vektör)</td></tr><tr><td>BstBI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0519</td><td>40 U (insert) 80 U (vektör)</td></tr><tr><td>Calf Intestinal Fosfataz (CIP)</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>M0290S</td><td>10 U</td></tr><tr><td>Hızlı ligaz&nbsp;</td><td>New England Biolabs &</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus minipreps DNA saflaştırma sistemleri&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>A1460</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus midipreps DNA saflaştırma sistemleri&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>A7640</td><td></td></tr><tr><td>DNA temizleme ve yoğunlaştırıcı-25 kiti</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>11-304C</td><td></td></tr><tr><td>ZR-96 DNA temiz ve yoğunlaştırıcı-5 kiti</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>11-306A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick jel ekstraksiyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR saflaştırma kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Alt Klonlama Verimliliği DH5a Yetkili Hücreler&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>18265017</tr><tr><td>Transit LT-1 Reaktifi 1 mL (transfeksiyon reaktifi)</td> <td>Mirus&nbsp;</td><td></td><td></td>MIR2300</tr><tr><td>BD FACS Aria II (sıralayıcı)</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Fortessa (akış sitometresi)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tek hücre tcr yalıtım ve üretme-in vitro için retroviral vektörler ve in vivo ifade insan tcrs aerodinamik

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Sıralama eşleştirilmiş T hücre reseptör (TCR) Alfa ve beta zincirleri tek T hücrelerden için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir rağmen hiçbiri defa TCR heterodimers aşağı akım için elverişli vivo içinde fonksiyonel analiz edilmiştir. Biz neden olan bir insan TCR alpha ve beta zincirleri değişken bölgeleri kapsayan bir PCR ürünü bir iki adım multiplex iç içe PCR, dayalı gelişmiş bir iletişim kuralı geliştirdik. Benzersiz kısıtlama siteleri tanımlama ve onları PCR astar birleşmeyle, PCR ürünü doğrudan şablon retroviral vektör alt klonlama ile uyumlu yaptık. Elde edilen retroviral yapı chimeric insan/fare TCR fare hücreleri veya vivo içinde fare modelleri fonksiyonel bir fare hücre içi etki ile kodlar. Genel olarak, burada açıklanan protokol eşleştirilmiş insan tek hücre TCR alpha ve beta zinciri kimlik retroviral vektörler kolayca uyarlanabilir aerodinamik nesil vitro ve in vivo TCR ifade ile birleştirir. Böylece kritik adımları takip ve potansiyel tuzaklar kaçınılmalıdır olabilir video ve eşlik eden malzeme tek hücre PCR, son derece ayrıntılı bir tanımını vermek için tasarlanmıştır. Ayrıca, biz klonlama ifade vektör oluşturmak için gereken adımları ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Kez hakim, tüm prosedürü tek hücreden TCR ifade için sıralama kısa bir iki haftalık süre içinde gerçekleştirilebilir.

Multiplex iç içe PCR reaksiyon verimliliğini adım 3.2.7 (Şekil 2) bir özel jel ikinci reaksiyon 5µL çalıştırarak kontrol edilir. Ortalama TCR-beta amplifikasyon verimliliğini TCR-Alfa tepki verimliliğini yaklaşık %50 genellikle düşük ise yaklaşık % 80, olması bekleniyor4. Sadece eşlenmiş zincirleri TCR-Alfa ve TCR-beta-ebilmek var olmak kullanılmış için TCR ifade; Ancak, tüm PCR ürünleri TCR sıra ve repertuar bilgi edinmek için sıralı....

Geçerli protokol birleştiren tek hücre insan TCR alpha ve beta zinciri sıralama ile eşleştirilmiş retroviral vektörler vitro ve in vivo TCR ifade ile uyumlu nesil aerodinamik.

Tek hücre TCR yalıtım ve üretme-in Vitro için Retroviral Vektörler ve In Vivo ifade insan TCRs aerodinamik

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Bu yöntem, bir antijenin spesifik popülasyonunun TCR alfa ve beta repertuarının yanı sıra insan TCR'lerinin in vivo işlevselliği gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajları, PCR reaksiyonunun nispeten yüksek verimliliğinin yanı sıra sonraki TCR klonlaması ile uyumluluğudur. Bu protokol, TCR dizisi hakkında önceden bilgi sahibi olmadan tek bir hücreden TCR alfa ve beta zincirlerini amplifiye etmek için iki aşamalı bir PCR kullanır.İlk PCR, sabit bölgeye özgü bir primer ile birlikte alfa veya beta değişken bölgeye özgü primerlerden oluşan bir havuz kullanan bir multipleks reaksiyondur. İkinci PCR, PCR ürününün beş ana ucunda bulunan adaptör dizisinden ve ayrıca bir dahili sabit bölge dizisinden ayrılan iç içe geçmiş bir reaksiyondur. Bu primerler ayrıca, sonraki klonlamayı kolaylaştırmak için PCR ürününün beş ana ve üç ana ucuna benzersiz kısıtlama bölgeleri içerir.Şablon vektörüne klonlandıktan sonra, kodlanmış TCR dizisi, yansıtma sabit bölgelerine sahip insan değişken bölgelerinden oluşan kimeriktir. Kimerik TCR yapısı, TCR ile yansıtma CD3 sinyal kompleksi arasında etkileşime izin vererek, bu TCR klonlama protokolünü, hücre hatlarını yansıtmada ve insanlaştırılmış fare modellerinde sonraki fonksiyonel çalışmalarla uyumlu hale getirir. Ters transkripsiyon reaktiflerini temiz, şablonsuz bir alanda hazırlayarak tek hücre sıralaması için ayarlayın.Genel olarak, tek hücreli PCR yöntemine yeni başlayan kişiler, düşük şablon seviyeleri nedeniyle mücadele edeceklerdir. Öte yandan, multipleks iç içe PCR'nin hassasiyeti, düşük şablon kontaminasyon seviyelerine karşı hassastır. Bu nedenle, PCR reaksiyonlarını kuracağınız alanları iyice temizlemeniz gerekir.Bu reaksiyonda, alfa ve beta zincirlerinin sabit bölgesi için spesifik üç ters primerin bir karışımı kullanılır. Reaktifleri bir pipetleme haznesinde birleştirerek ters transkripsiyon ana karışımını hazırlayın. Pipetleme hatasını hesaba katmak için, fazladan on kuyucuk için yeterli reaksiyon karışımı yapın.96 oyuklu bir PCR plakasına kuyucuk başına altı mikrolitre pipetlemek için çok kanallı bir cihaz kullanın. Plakayı bir conta ile gevşek bir şekilde örtün ve plakayı buz üzerinde tutun. Hücreleri hücre yüzeyi belirteçlerine karşı antikorlarla boyayarak tek hücre sıralaması için T hücrelerini hazırlayın.On iki satırı boş bırakırken T hücrelerini bir kerede hücre başına sıralayın, bu da negatif bir kontrol görevi görecektir. Plakayı yapışkan film ile kapatın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1000 g'da döndürün. Hemen ters transkripsiyon reaksiyonunu çalıştırın.Mümkünse, ilk PCR reaksiyonunu aynı gün çalıştırın. Multipleks reaksiyonu çalıştırmak için, V alfa ve V beta PCR ana karışımlarını pipetleme rezervuarlarında ayrı ayrı karıştırın. cDNA içeren plakayı buz üzerinde veya soğuk bir blok üzerinde tutun.22.5 mikrolitre TCR beta reaksiyonunu 96 oyuklu yeni bir PCR plakasına aktarın. Ardından, 2,5 mikrolitre cDNA'yı PCR plakasına aktarmak için çok kanallı bir kanal kullanın. 22,5 mikrolitre TCR alfa reaksiyonunu doğrudan cDNA'nın geri kalanını içeren plakaya pipetlemek için çok kanallı bir kanal kullanın.Plakaları yapıştırıcı ile kapatın, hafifçe girdap yapın ve kısaca aşağı döndürün. İlk PCR reaksiyonunu çalıştırın. Plakalar 20 santigrat derecede saklanabilir.Ertesi gün, ikinci iç içe PCR reaksiyonlarını hazırlayın. Çok kanallı bir cihaz kullanarak, TCR alfa ve TCR beta reaksiyonları için ana karışımları kuyucuk başına 22,5 mikrolitre olacak şekilde iki yeni 96 oyuklu PCR plakasına pipetleyin. Multipleks PCR reaksiyon şablonunu kuyucuk başına 2,5 mikrolitre olarak ekleyin.Plakaları kapatın, hafifçe girdap yapın ve kısaca aşağı döndürün. Kalan ilk PCR reaksiyonu, bir yedekleme şablonu kaynağı olarak hizmet etmek için mühürlenmeli ve 20 santigrat derecede saklanmalıdır. İkinci PCR reaksiyonunu gerçekleştirin.İkinci iç içe PCR reaksiyonu tamamlandıktan sonra,% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde reaksiyonun beş mikrolitresini boşaltın. Pozitif ve negatif kontrol kuyularını dahil edin. Beklenen bant, boyut olarak yaklaşık 500 baz çiftinde çalışmalıdır.İkinci reaksiyonun geri kalanını, yirmi mikrolitreyi, 96 oyuklu formatlı bir PCR saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın ve Sanger dizilimi gerçekleştirin. Elde edilen TCR dizileri, çevrimiçi olarak mevcut immünogenetik yazılım kullanılarak analiz edilebilir. Dizi bilgisi, T hücresi popülasyonunun repertuarını ve klonalitesini değerlendirmek için kullanılabilir.Eşleştirilmiş TCR alfa ve beta dizileri daha ileri fonksiyonel analizlerde kullanılabilir. Şablon vektörüne TCR beta ve TCR alfa'nın ardışık ligasyonlarını gerçekleştirin. TCR beta ve TCR alfa şablonu, PCR güçlendirilmiş zincirlerle değiştirilir.İlk ligasyonda, TCR beta şablonu, PCR amplifiye edilmiş beta zinciri ile değiştirilir. TCR beta'nın başarılı bir şekilde eklenmesi, test-özet dizilimi ile doğrulandıktan sonra, TCR alfa şablonunu PCR amplifiye alfa zinciriyle değiştirin. HEK293T hücreler, başarılı TCR zincir eşleştirmesini ve hücre yüzeyi ifadesini test etmek için kullanılır.HEK293T hücreler, ametrin floresan raportör tarafından işaretlenen TCR vektörü ve GFP ile işaretlenmiş CD3 kompleksini kodlayan bir vektör ile birlikte transfekte edilir. Kimerik TCR'nin yüzey ekspresyonu, hücrelerin anti-fare CD3 antikoru ile boyanmasıyla akış sitometrisi ile doğrulanır. Kimerik TCR yapısı ile transfekte edilen hücrelerdeki yüzey CD3 ekspresyonunun seviyesi, tam yansıtma kontrol şablonu vektörü ile transfekte edilenlerle karşılaştırılabilir olmalıdır.Özetle, tek hücrelerden eşleştirilmiş TCR zincirlerinin tanımlanması ve klonlanması için etkili bir PCR tabanlı protokol tanımladık. Bunun, otoimmünite, tümör sürveyansı ve patojen eliminasyonunda insan T hücresi tepkilerini incelemek için değerli bir araç olacağını tahmin ediyoruz. Burada açıklanan PCR protokolünün ana avantajı, sonraki in vitro ve in vivo çalışmalarla uyumluluğudur.

streamlined-single-cell-tcr-isolation-generation-retroviral-vectors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Somatik Hücre Nükleer Transferi (SCNT) üzerinden epigenetik yeniden programlama önceden tanımlanmış T hücre reseptör (TCR) özgüllükleri fare modelleri oluşturmak için bir araç olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Bu transnuclear fareler, endojen endojen organizatörü kontrol altında lokus karşılık gelen TCR ifade eder.

Karşı Önceden tanımlanmış T Hücre Reseptör özgüllükleri Transnuclear Fare Toxoplasma gondii SCNT ile Elde Edilen

Biz retroviral transdüksiyon kullanarak fare antijen spesifik T-hücrelerinin üretmek için bir protokol...

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

Embriyonik kök hücrelerin (ESC'ler) farklılaşmasında zamansal gen ekspresyonunun manipüle edilmesi, indüklenebilir gen sistemleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, bu hücre hatlarının oluşturulması maliyetli ve zaman alıcıdır. Bu protokol, ES'den türetilmiş hücrelerin ayırt edilmesinde bir transgenin hızlı ekspresyonunu ve ardından aşağı akış hematopoietik farklılaşmasının analizini sağlar.

Kemirgen Embriyonik retroviral Enfeksiyon Hematopoetik Farklılaşma Analizi için Hücre Türetilmiş embriyoidlerin Vücut Kök Hücreler

Tek bir T hücre reseptörü (TCR) retroviral tabanlı in vivo ekspresyon sistemi için hızlı ve esnek bir protokol sunuyoruz.  Retroviral vektörler, TCR transgenik farelere alternatif olarak in vivo olarak tek bir TCR'nin T hücresi gelişimini ve işlevini incelemek için kemik iliği progenitör hücrelerini dönüştürmek için kullanılır.

Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için

Bu yazıda, mevcut bir TCR'nin TCRα ya TCRβ eşleştirme periferal T hücresi reseptör repertuvarının tamamlayıcı hemichain ile, ilgi konusu antijen spesifikliğini sahip antijen-spesifik T hücre reseptörleri (TCR'ler) oluşturmak için yeni bir metot açıklamaktadır. De novo oluşturulan TCRler afiniteye değişen antijen spesifikliğini muhafaza eder.

Yaratma<em&gt; De Novo</em&gt; Merkezli Hemichain retroviral transdüksiyonu ile antijen-özel insan T hücre reseptörleri

Bu protokol, retroviral vektör üretimini ve murin T hücresi transdüksiyonunu kolaylaştırarak fare CAR-T hücrelerinin verimli bir şekilde üretilmesini kolaylaştırır.

Murin kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin verimli üretimi

Th17 farklılaşmasının incelenmesinde gen düzenleme için etkili bir alternatif sağlayan, Cas9 transgenik farelerden alınan birincil T hücrelerine kılavuz RNA'nın retroviral transdüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

İn vitro Th17 farklılaşmasının incelenmesi için retroviral CRISPR/Cas9 aracılı gen hedeflemesi

Bu protokol, insan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücreleri (CAR Treg'ler) oluşturmak ve test etmek için kolaylaştırılmış bir iş akışı sağlar.

İnsan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücrelerinin üretimi

Kaçakçılık reseptörlerinin retroviral transdüksiyonu ve reseptör aracılı organ ve mikroçevreye özgü lenfosit konumlandırmasını incelemek için rekabetçi hedef arama için geliştirilmiş protokoller sunuyoruz. Bu yöntem, bağışıklık hücresi kaçakçılığı mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sunar ve gelecekteki temel ve terapötik araştırmalarda potansiyel uygulamalara sahiptir.

Farklı Doku Mikroortamlarında GPCR Aracılı T Hücresi Lokalizasyonunu Araştırmak için Verimli Retroviral Transdüksiyon ve Rekabetçi Hedef Arama

Homoloji aracılı uç birleştirme (HMEJ) DNA onarım yolu yoluyla birincil insan T hücrelerinde büyük, multisistronik yapıların yüksek verimli hedefli knock-in'ini elde etmek için CRISPR / Cas9 teknolojisini kullanmak için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu cGMP'ye uyarlanabilir protokolle tasarlanan T hücreleri, mükemmel hücre genişlemesi, sitotoksisite ve sitokin üretimini korur.

Büyük DNA Şablonlarının Homoloji Aracılı Uç Birleştirme Hedefli Entegrasyonu Yoluyla Birincil İnsan T Hücrelerinin Viral Olmayan Mühendisliği

Bu protokol, birincil T hücrelerinin yetiştirilmesi için temel adımları tanımlar; bunların izolasyonu, aktivasyonu, genişlemesi ve mRNA elektroporasyonu ile geçici transfeksiyonu dahildir. Ayrıca, fenotip, aktivasyon belirteçleri, canlılık ve kimerik antijen reseptörü (CAR) ekspresyonunun akış sitometrik analizi için bir iş akışı ve antikor paneli önerilmektedir.

Birincil insan T hücrelerinin izolasyonu, yetiştirilmesi ve geçici transfeksiyonu için kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri üretmek

Öğrenin tek hücre TCR alfa ve beta zincir izolasyonu ve retroviral vektör üretimi yöntemini. Bu protokol insan TCR'lerinin in vivo fonksiyonelliğini analiz etmek için immünoloji araştırmalarında kullanılır.

Tek hücre TCR yalıtım ve üretme-in Vitro için Retroviral Vektörler ve In Vivo ifade insan TCRs aerodinamik

Daha fazla video keşfet