Tek hücre TCR yalıtım ve üretme-in Vitro için Retroviral Vektörler ve In Vivo ifade insan TCRs aerodinamik

Bu yöntem, bir antijenin spesifik popülasyonunun TCR alfa ve beta repertuarının yanı sıra insan TCR'lerinin in vivo işlevselliği gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajları, PCR reaksiyonunun nispeten yüksek verimliliğinin yanı sıra sonraki TCR klonlaması ile uyumluluğudur. Bu protokol, TCR dizisi hakkında önceden bilgi sahibi olmadan tek bir hücreden TCR alfa ve beta zincirlerini amplifiye etmek için iki aşamalı bir PCR kullanır.

İlk PCR, sabit bölgeye özgü bir primer ile birlikte alfa veya beta değişken bölgeye özgü primerlerden oluşan bir havuz kullanan bir multipleks reaksiyondur. İkinci PCR, PCR ürününün beş ana ucunda bulunan adaptör dizisinden ve ayrıca bir dahili sabit bölge dizisinden ayrılan iç içe geçmiş bir reaksiyondur. Bu primerler ayrıca, sonraki klonlamayı kolaylaştırmak için PCR ürününün beş ana ve üç ana ucuna benzersiz kısıtlama bölgeleri içerir.

Şablon vektörüne klonlandıktan sonra, kodlanmış TCR dizisi, yansıtma sabit bölgelerine sahip insan değişken bölgelerinden oluşan kimeriktir. Kimerik TCR yapısı, TCR ile yansıtma CD3 sinyal kompleksi arasında etkileşime izin vererek, bu TCR klonlama protokolünü, hücre hatlarını yansıtmada ve insanlaştırılmış fare modellerinde sonraki fonksiyonel çalışmalarla uyumlu hale getirir. Ters transkripsiyon reaktiflerini temiz, şablonsuz bir alanda hazırlayarak tek hücre sıralaması için ayarlayın.

Genel olarak, tek hücreli PCR yöntemine yeni başlayan kişiler, düşük şablon seviyeleri nedeniyle mücadele edeceklerdir. Öte yandan, multipleks iç içe PCR'nin hassasiyeti, düşük şablon kontaminasyon seviyelerine karşı hassastır. Bu nedenle, PCR reaksiyonlarını kuracağınız alanları iyice temizlemeniz gerekir.

Bu reaksiyonda, alfa ve beta zincirlerinin sabit bölgesi için spesifik üç ters primerin bir karışımı kullanılır. Reaktifleri bir pipetleme haznesinde birleştirerek ters transkripsiyon ana karışımını hazırlayın. Pipetleme hatasını hesaba katmak için, fazladan on kuyucuk için yeterli reaksiyon karışımı yapın.

96 oyuklu bir PCR plakasına kuyucuk başına altı mikrolitre pipetlemek için çok kanallı bir cihaz kullanın. Plakayı bir conta ile gevşek bir şekilde örtün ve plakayı buz üzerinde tutun. Hücreleri hücre yüzeyi belirteçlerine karşı antikorlarla boyayarak tek hücre sıralaması için T hücrelerini hazırlayın.

On iki satırı boş bırakırken T hücrelerini bir kerede hücre başına sıralayın, bu da negatif bir kontrol görevi görecektir. Plakayı yapışkan film ile kapatın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1000 g'da döndürün. Hemen ters transkripsiyon reaksiyonunu çalıştırın.

Mümkünse, ilk PCR reaksiyonunu aynı gün çalıştırın. Multipleks reaksiyonu çalıştırmak için, V alfa ve V beta PCR ana karışımlarını pipetleme rezervuarlarında ayrı ayrı karıştırın. cDNA içeren plakayı buz üzerinde veya soğuk bir blok üzerinde tutun.

22.5 mikrolitre TCR beta reaksiyonunu 96 oyuklu yeni bir PCR plakasına aktarın. Ardından, 2,5 mikrolitre cDNA'yı PCR plakasına aktarmak için çok kanallı bir kanal kullanın. 22,5 mikrolitre TCR alfa reaksiyonunu doğrudan cDNA'nın geri kalanını içeren plakaya pipetlemek için çok kanallı bir kanal kullanın.

Plakaları yapıştırıcı ile kapatın, hafifçe girdap yapın ve kısaca aşağı döndürün. İlk PCR reaksiyonunu çalıştırın. Plakalar 20 santigrat derecede saklanabilir.

Ertesi gün, ikinci iç içe PCR reaksiyonlarını hazırlayın. Çok kanallı bir cihaz kullanarak, TCR alfa ve TCR beta reaksiyonları için ana karışımları kuyucuk başına 22,5 mikrolitre olacak şekilde iki yeni 96 oyuklu PCR plakasına pipetleyin. Multipleks PCR reaksiyon şablonunu kuyucuk başına 2,5 mikrolitre olarak ekleyin.

Plakaları kapatın, hafifçe girdap yapın ve kısaca aşağı döndürün. Kalan ilk PCR reaksiyonu, bir yedekleme şablonu kaynağı olarak hizmet etmek için mühürlenmeli ve 20 santigrat derecede saklanmalıdır. İkinci PCR reaksiyonunu gerçekleştirin.

İkinci iç içe PCR reaksiyonu tamamlandıktan sonra,% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde reaksiyonun beş mikrolitresini boşaltın. Pozitif ve negatif kontrol kuyularını dahil edin. Beklenen bant, boyut olarak yaklaşık 500 baz çiftinde çalışmalıdır.

İkinci reaksiyonun geri kalanını, yirmi mikrolitreyi, 96 oyuklu formatlı bir PCR saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın ve Sanger dizilimi gerçekleştirin. Elde edilen TCR dizileri, çevrimiçi olarak mevcut immünogenetik yazılım kullanılarak analiz edilebilir. Dizi bilgisi, T hücresi popülasyonunun repertuarını ve klonalitesini değerlendirmek için kullanılabilir.

Eşleştirilmiş TCR alfa ve beta dizileri daha ileri fonksiyonel analizlerde kullanılabilir. Şablon vektörüne TCR beta ve TCR alfa'nın ardışık ligasyonlarını gerçekleştirin. TCR beta ve TCR alfa şablonu, PCR güçlendirilmiş zincirlerle değiştirilir.

İlk ligasyonda, TCR beta şablonu, PCR amplifiye edilmiş beta zinciri ile değiştirilir. TCR beta'nın başarılı bir şekilde eklenmesi, test-özet dizilimi ile doğrulandıktan sonra, TCR alfa şablonunu PCR amplifiye alfa zinciriyle değiştirin. HEK293T hücreler, başarılı TCR zincir eşleştirmesini ve hücre yüzeyi ifadesini test etmek için kullanılır.

HEK293T hücreler, ametrin floresan raportör tarafından işaretlenen TCR vektörü ve GFP ile işaretlenmiş CD3 kompleksini kodlayan bir vektör ile birlikte transfekte edilir. Kimerik TCR'nin yüzey ekspresyonu, hücrelerin anti-fare CD3 antikoru ile boyanmasıyla akış sitometrisi ile doğrulanır. Kimerik TCR yapısı ile transfekte edilen hücrelerdeki yüzey CD3 ekspresyonunun seviyesi, tam yansıtma kontrol şablonu vektörü ile transfekte edilenlerle karşılaştırılabilir olmalıdır.

Özetle, tek hücrelerden eşleştirilmiş TCR zincirlerinin tanımlanması ve klonlanması için etkili bir PCR tabanlı protokol tanımladık. Bunun, otoimmünite, tümör sürveyansı ve patojen eliminasyonunda insan T hücresi tepkilerini incelemek için değerli bir araç olacağını tahmin ediyoruz. Burada açıklanan PCR protokolünün ana avantajı, sonraki in vitro ve in vivo çalışmalarla uyumluluğudur.