Name: Amerikan Bullfrog of sacculus (Saç Hücrelerinin fizyolojik hazırlanması Rana catesbeiana) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Keşfedin Amerikan boğa kurbağası sakkulusunun diseksiyon ve hazırlama yöntemini, saç hücreleri fizyolojisi ve biyofiziksel çalışmalar için. Bu teknik duyusal sinirbilim araştırmalarında sağlıklı hücre erişimi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, bu makalede açıklanan hazırlıkları geliştirmedeki finansmanı ve uzmanlığı için Dr. A. J. Hudspeth'e teşekkür etmek istemektedir. Ayrıca, bu protokolde kullanılan özel ekipman ve yazılımların çoğunu oluşturduğu ve sürdürdüğü için Brian Fabella'ya teşekkür etmek istiyoruz.
J. B. A. hibe F30DC014215 tarafından desteklenmektedir, JD S. hibe F30DC013468 tarafından desteklenmektedir ve hem J. B. A. hem de J. D. S. Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden T32GM07739 hibe ile desteklenmektedir.

Etik Beyanı: Tüm işlemler Rockefeller Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Ön deney Prespanparation <ol><li> Çözümler <ol><li> Eugenol çözüm hazırlayın (2.5 g · L -1 kg-1 kurbağa). Salin çözeltileri (Tablo 1) hazırlayın. NOT: Bir tek odacıklı hazırlanması için yapay perilenf hazırlamak; İki bölmeli hazırlanması için, suni perilenf ve yapay endolymph hem hazırlanması. </li></ol></li></ol> 2. Deneysel Araçlar <ol><li> Cam stimülasyon elyaf hazırlanması <ol><li> yüksek ısı ve yüksek hızda tek satırlık çekme bir elektrot çektirmesi ile borosilikat cam kılcal daraltın. solenoid odaklı çektirmenin içine çekti kılcal yükleyin. </li><li> Bir cam boncuk ile bir filamanın doğru kapilariteyi en ucu getirKılcal temas cam boncuk kadar bunun üzerine erimiş. </li><li> Cam boncuk halinde kılcal ucu eritmek için filaman açın. kılcal ve boncuk arasındaki cam formları ince bir köprü kez filament kapatın ve aynı zamanda etrafında selenoid çektirme etkinleştirin. NOT: Bu uzun eksenine dik açıyla cam kapiller çekin ve sağlam bir lif yaratacaktır. </li><li> elyafın çapı en fazla 0.5 daha emin olun - 1 mikron ve uzunluğu 100 aşmadığı - 300 mikron. elyafın uzunluğu bu boyutu aşarsa, iris makası ile kırpın. Zaten diseksiyon araçlarını zarar görmemesi için sıkıcı makas kullanın. </li><li> Optik kontrastı artırmak için, kaplamaz lif sputter. altın paladyum kaynağı ile, bir püskürtme kaplayıcıda kullanın. Dikey kaynağına doğru olan konik ucu ile bir püskürtme kaplayıcı içine her lif yükleyin. altın palladyum kaynağının 2 cm - 1 bir mesafeye fiberin ucunu getirmek. </li><li> KapatBir mühür formu ve açmak için kaplayıcının odasına sputter. Tekrar tekrar argon ile ortam havasını dışarı yıkayın. havayı kızarma sonra, 10 Pa (70 mTorr&#39;luk) odanın içindeki basıncı azaltır. </li><li> 120 s boyunca 10 sn gecikme ile 10 s bakliyat kat sputter. NOT: püskürtmeli kaplama başarılı oldu ise fiberin ucu bu protokolün süresi boyunca kararacak. </li></ol></li><li> Keskin Mikroelektronlar hazırlanması <ol><li> tek satırlık yüksek ısı çekme kullanarak bir iç filamanın bir cam kılcal çekin. 3 M KCl ile doldurulduğunda 300 MQ - elektrotlar 100 arasında bir dirence sahip olmalıdır. 3 M KCl ile her elektrot doldurun. </li><li> Amplifikatör headstage 16 monte edildiğinde bend microforge her elektrot ucu saç hücresi apikal yüzeye çok dik hale getirmek. </li></ol></li><li> Iyontoforez pipetler hazırlanması <ol><li> bir iç bir cam kılcal çek50 M? ucu filamanın. Konsantre çözünen (örneğin, 500 mM gentamisin sülfat) ile doldurun. </li></ol></li><li> Alüminyum montaj meydanın hazırlanması <ol><li> alüminyum folyodan bir 1 cm x 1 cm kare kesin. Bir pithing çubuğu veya diğer sivri nesnenin ucuyla merkezinde folyo Perfore. dairesel ve çapı yaklaşık 1 mm olacak şekilde perforasyon şekillendirin. </li></ol></li><li> Vakum gres şırınga hazırlanması. <ol><li> 5 ml şırınga pistonu çıkarın. vakum gres ile arkasından şırınga doldurun. pistonu değiştirin. </li></ol></li><li> Politetrafluoroetilen yapıştırıcı uygulayıcının hazırlanması <ol><li> Bir tahta aplikatör çubuk sonuna oyulmuş 2 mm uzunluğunda eksenel olun. son görüntülendiğinde yarık uygulayıcının merkezinde olmalıdır. </li><li> keskin bir makas veya bir jilet ile, 1 mm kalınlığındaki bir tabakadan politetrafloroetilen 2 mm x 4 mm dikdörtgen kesin. </li&gt; <li> politetrafloroetilen dikdörtgenin 2 mm-uzun kenarlarından ince birine bir jilet kullanın. dikdörtgenin ortasında başlayarak, dikdörtgenin ucunda bir eğim oluşturmak için dışa dilimleme dikdörtgen kalınlığını azaltır. </li><li> Eğimli kenarın uzak sopa bakacak şekilde ahşap aplikatör yarık içine politetrafloroetilen dikdörtgen yerleştirin. yerine sabitlemek için politetrafloroetilen dikdörtgenin tabanına 5 dk epoksi uygulayın. Tutkal uygulama, oda sıcaklığında 1 saat boyunca bekletilmelidir. </li></ol></li><li> İki bölmenin alt yarısının hazırlanması monte <ol><li> Makine veya 3D iki odasının alt yarısı (İlave dosya 2) monte yazdırın. odasının alt yüzeyi üzerinde 20 mm çaplı gömme daire tanımlar. </li><li> girintili dairenin en yanal 3 mm epoksi ince bir tabaka sürün. epoksi bir 18 mm yuvarlak cam lamel uygulayın. epoksi 1 için kurumaya bırakınızh. </li></ol></li></ol> İç kulak Organ 3. Ekstraksiyon <ol><li> 10 dakika eugenol anestezik solüsyon içeren küçük bir kova yerleştirerek bir Amerikan bullfrog uyutmak. çözümün ses seviyesini ayarlamak, böylece sadece sıvı-hava arayüzü üzerinde kurbağa humero-skapular ortak yatıyor. </li><li> çift ​​pithing tarafından anestezi bullfrog euthanize. <ol><li> çene altında biri kendi burnunun üstüne parmak ve birbirleri ile anestezi kurbağa kavrayın ve ileri kurbağa kafasını döndürün. </li><li> Hızla kurbağa oksipital süreçleri arasındaki orta hat bulunan foramen magnum, kranial tonoz içine pithing çubuğunu dalma. </li><li> Yavaş yavaş çekilme ve ucu foramen magnum yola kadar çubuk döndürün. omurilik yok etmek için vertebra foraminalardan yoluyla kaudal çubuk zorlayın. </li><li> Kurbağa düzgün iki kat alt ekstremite genişletilmiş olduğunu gözlemleyerek pithed olduğunu onaylayın. </li></ol></li><li> Geliştirilmiş istikrar için vomerine diş kavrama burun ve ilk parmağı üzerinde bir başparmak ile kurbağa kavrayın. bilateral temporomandibular eklem kesilmesinin ve daha sonra rostro eksene dik keserek kurbağa başını kesmek. kafatası içinde iç kulak organları sağlam kalmasını sağlamak için, kesim hem tympana aşağısındaki olduğundan emin olun. </li><li> Bir stereodissection mikroskop kullanarak, doku (Şekil 1A) en arka ölçüde vomerine dişlerin damak dokusu kesti bir orta hat yürütmek. </li><li> Sever ve posterior kıkırdak ortaya çıkarmak için damak dokusu altında yatan neşter yatay kesim herhangi bir kas net. kas çıkardıktan sonra, otik kapsülün sınır oluşturan zamansal kıkırdak lolipop şeklini gözlemlemek. </li><li> otik kapsülün kıkırdak ile temas noktasındaki columella Sever. </li><li> Defalarca shallo yaparak bu kıkırdak ince tabakalar tıraşiçinden w yatay keser. iç kulak organlarına zarar görmesini önlemek için derin kesikler kaçının. Bu zamansal kıkırdak (Şekil 1B) lolipop yapısı içinde bulundu otik kapsül açılır. Otik kapsül içinde kurbağanın iç kulak organlar (Şekil 1C) bulunmaktadır. </li><li> iç kulak organlara zarar vermemeye özen, posterior ve otik kapsülün yanal kenarları kırpın. disseksiyonda sıklıkla batık ve sulu kalmasını sağlamak için iç kulak organları üzerinde tuzlu su akar. </li><li> orta hatta kıkırdak medial bağlantısında temporal kemiğin iki dairesel açıklıklar bulun. Temporal kemik yırtmak için en medial açıklıktan aşağı doğru kesin. </li><li> onun arka-yan kenarında otik kapsül içinden ikinci bir aşağı kesim olun. iç kulak organlarına erişim sağlamak için bu ve bundan önceki kesim arasındaki kıkırdak parçasını çıkarınız. </li><li> adımlar 3.8 a gelen kesimler arasındaki kıkırdak gevşek gözetlemeknd 3.9 ve otik kapsül uzak kesti. Bu işlem, daha sonra manipülasyonlar için bir sap olarak kullanılabilir yakın yarı dairesel kanal, koparır. </li><li> Sacculus dokunmamaya özen kranial sinir inci VIII sever. </li><li> En yakın semisirküler kanalın ampulla tutun. Yavaşça kalan iki yarı dairesel kanallar ortaya çıkarmak için iç kulağı döndürün. Her kanal açığa üzerine, onu sever. </li><li> sinir veya bir semisirküler kanal ampulla Holding, baş iç kulak ayıklamak ve soğutulmuş oksijenlenmiş yapay perilenf ile dolu bir tabak koyun. Iç kulak çıkarılması semisirküler kanallar kez geçtikleri temporal kemik (Şekil 1D) içinde pasajlar görselleştirme izin verir. NOT: İkinci kulak ayıklamak için bu adımları tekrarlayın. </li></ol> 4. Tek odacıklı Hazırlık <ol><li> Sacculus izolasyonu <ol><li> Geniş katiyen belirleyerek sacculus bulunE otokonin kütlesi ve bunu üstüne yer alan sakküler sinir (Şekil 1 E). Fiziksel Sakküler saç hücrelerinin bütünlüğünü korumak için aşağıdaki adımları sırasında sacculus travmatize özen gösterin. </li><li> iç kulak daha manevra hale getirmek için yarım daire kanalları Trim. </li><li> sacculus nöral tarafını örten perilenfatik sarnıç çıkarın. sarnıç çevresinde yumuşak kesim yapmak. Sonraki sacculus sinirsel tarafına sarnıcın en membran köprü küçük doku ayağı sever. </li><li> lagena ve ilişkili sinir çıkarın. </li><li> sakküler sinir Holding, hafifçe sacculus kaldırın ve otoconial kesenin ince zarından kesti. kesenin dışına otokonin sızıntısı olarak, kendi çevresi etrafında keserek sacculus özgür. NOT: İstenirse sacculus izole sonra, kalan iç kulak organları kaydedilebilir. sacculus çıkarılması gibi başka yapıların belirlenmesini kolaylaştırıramfibi ve baziler papillalar. </li><li> dikkatle sacculus üzerinde kalan otokonin silip makas veya forseps kullanabilir. Bu işlem sırasında sacculus dokunmamaya özen gösterin. </li><li> sacculus &#39;kenarından kalan otoconial-sac membran kesin. Bu zar, plastik ve cam yüzeylerde yapışma eğilimi ve kaldırma dokusunu ele zorlukları en aza indirir. </li><li> Yavaşça kalan otokonin (Şekil 1F) çıkarmak için bir Pasteur pipeti ile sacculus fazla tuzlu su akar. NOT: İlk bir ayna görüntüsü olan ikinci sacculus, bu işlemi tekrarlayın. </li></ol></li><li> Sindirim ve montaj <ol><li> Kırık ucu olan bir Pasteur pipeti arka ucunu kullanarak, suni perilenf 67 mg ∙ L-1 proteaz XXIV 3 mL içeren bir Petri kabı izole sacculi aktarın. NOT: Bu proteaz tedavi otolithic her kinociliary ampul hayvan zinciri bağlantıları sindirirMembran, duyusal saç demetleri zarar vermeden membranın çıkarılmasını sağlayan. </li><li> 22 ° C (veya 21 ° C&#39;de 35 dakika), 30 dakika boyunca doku inkübe edin. Açık yüzlü deneysel odasına her sindirilmiş sacculus aktarın ve manyetik pimleri ile doku sabitleyin. </li><li> sakküler makula doğrudan otolithic membranın altında yatıyor ve saç hücreleri içeren sacculus kısmıdır. tanımlamak ve dikkatle sakküler makulayı dokunmamaya özen ince bir kirpik kullanarak üstte otolithic membran kaldırmak. </li></ol></li></ol> 5. İki odalı Hazırlık <ol><li> Sacculus izolasyonu <ol><li> Bölüm 4.1 gibi iç kulak organlarından sacculus izole edin. </li></ol></li><li> Montaj ve sindirim <ol><li> Vakum iki noktalar kullanarak, suni perilenf montaj bloğu (Company dosya 3) doldurun ve bir açılış delikli alüminyum folyo koyunyerinde tutun ve zayıf mühür oluşturacak şekilde yağlayın. </li><li> Transferi bir folyoya sakkuluslar ve aşağı bakacak makula ve yukarı bakacak şekilde sinir güdük ile deliğin üstünde ortalamak. </li><li> bükülmüş doku parçası ile sacculus çevreleyen tuzlu su çıkarın. sacculus çevreleyen alüminyum kare yüzeyini kuru tuzlu fitil. </li><li> sacculus kenarında ve alüminyum meydanı arasındaki sınır boyunca sıkı bir mühür oluşturmak için siyanoakrilat tutkal uygulamak için politetrafloroetilen aplikatör kullanın. sacculus tüm çevresi yapıştırıcı ile kaplanmış olduğundan emin olun. NOT: çok yavaş ilerleyerek siyanoakrilat yapıştırıcı sacculus nöral tarafı üzerinde sürünme ve sonunda onu karşılamak için izin verir. Hızla bu görevi tamamlamak için zorunludur. </li><li> tutkal tedavi monte dokusunun üstüne bir damla serum fizyolojik yerleştirin. tutkal ince bir film tuzlu su damlasının üzerine oluşturabilir; forseps ile çıkarın. </li><li> Dikkatle t kaldırmakO bağlantı bloğundan bozarlar. sacculus maküler tarafı yukarıya bakacak şekilde üzerine monte doku çevirin ve yapay perilenf dolu Petri kabı üzerine yüzer. </li><li> makula üstünde proteaz XXIV solüsyondan bir damla ilave edin ve 22 ° C (veya 21 ° C&#39;de 35 dakika), 30 dakika boyunca inkübe edin. Merkez odasının etrafında perilenf ve yer vakum gres ile iki odalı aparatı (Company dosya 2) alt kanal doldurun. </li><li> bölmenin bakan yüzeyinde sinir alt odasının folyo monte sacculus yerleştirin. folyo çevresinde yağ ekleyin. </li><li> Vakum yağ ile tam bir sızdırmazlık oluşturmak için özen, folyo hazırlık üst bölmeyi (Company Dosya 1) yerleştirilir. kabarmış yapay endolymph üst bölmeyi doldurun ve yavaşça bir kirpik ile otolithic membran kaldırmak. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Adult+Mouse+Utricle+and+Adenovirus-mediated+Supporting-cell+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%29%22%5BJournal%5D)">Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3734-e3734 (2012).</li>
<li>Howard, J., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compliance+of+the+hair+bundle+associated+with+gating+of+mechanoelectrical+transduction+channels+in+the+bullfrog%27s+saccular+hair+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Compliance of the hair bundle associated with gating of mechanoelectrical transduction channels in the bullfrog's saccular hair cell.</a> Neuron. 1 (3), 189-199 (1988).</li>
<li>Jaramillo, F., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+hair+cell%27s+transduction+channels+at+the+hair+bundle%27s+top+by+iontophoretic+application+of+a+channel+blocker%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Localization of the hair cell's transduction channels at the hair bundle's top by iontophoretic application of a channel blocker.</a> Neuron. 7 (3), 409-420 (1991).</li>
<li>Assad, J. A., Hacohen, N., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+dependence+of+adaptation+and+active+bundle+movement+in+bullfrog+saccular+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Voltage dependence of adaptation and active bundle movement in bullfrog saccular hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (8), 2918-2922 (1989).</li>
<li>Benser, M. E., Issa, N. P., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair-bundle+stiffness+dominates+the+elastic+reactance+to+otolithic-membrane+shear%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Hair-bundle stiffness dominates the elastic reactance to otolithic-membrane shear.</a> Hearing research. 68 (2), 243-252 (1993).</li>
<li>Martin, P., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+hair-bundle+movements+can+amplify+a+hair+cell%27s+response+to+oscillatory+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Active hair-bundle movements can amplify a hair cell's response to oscillatory mechanical stimuli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (25), 14306-14311 (1999).</li>
<li>Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Fabella, B. A., Tobin, M., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+a+hair+bundle%27s+mechanosensory+function+by+its+mechanical+load%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Control of a hair bundle's mechanosensory function by its mechanical load.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (9), E1000-E1009 (2015).</li>
<li>Martin, P., Bozovic, D., Choe, Y., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Oscillation+by+Hair+Bundles+of+the+Bullfrog%27s+Sacculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Oscillation by Hair Bundles of the Bullfrog's Sacculus.</a> Journal of Neuroscience. 23 (11), 4533-4548 (2003).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+electrical+resonance+and+frequency+tuning+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> The Journal of physiology. 400, 275-297 (1988).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+voltage-and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of voltage-and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> The Journal of physiology. , (1988).</li>
<li>Fisher, J. A. N., Kowalik, L., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+electrical+resonance+in+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging electrical resonance in hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1651-1656 (2011).</li>
<li>Patel, S. H., Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-selective+exocytosis+by+ribbon+synapses+of+hair+cells+in+the+bullfrog%27s+amphibian+papilla%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Frequency-selective exocytosis by ribbon synapses of hair cells in the bullfrog's amphibian papilla.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (39), 13433-13438 (2012).</li>
<li>Gale, J. E., Meyers, J. R., Periasamy, A., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+bundleless+hair+cells+and+subsequent+bundle+replacement+in+the+bullfrog%27s+saccule%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Survival of bundleless hair cells and subsequent bundle replacement in the bullfrog's saccule.</a> Journal of neurobiology. 50 (2), 81-92 (2002).</li>
<li>Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanoelectrical+transduction+by+hair+cells+of+the+bullfrog%27s+sacculus%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+brain+research%22%5BJournal%5D)">Mechanoelectrical transduction by hair cells of the bullfrog's sacculus.</a> Progress in brain research. 80, 129-135 (1989).</li>
<li>Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+the+active+process+of+hair+cells+with+cochlear+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integrating the active process of hair cells with cochlear function.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (9), 600-614 (2014).</li>
<li>Corey, D. P., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+latency+of+vertebrate+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Response latency of vertebrate hair cells.</a> Biophysical journal. 26 (3), 499-506 (1979).</li>
<li>Cheung, E. L. M., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2BChanges+the+Force+Sensitivity+of+the+Hair-Cell+Transduction+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Ca2+Changes the Force Sensitivity of the Hair-Cell Transduction Channel.</a> Biophysical journal. 90 (1), 124-139 (2006).</li>
<li>Choe, Y., Magnasco, M. O., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+amplification+of+hair-bundle+motion+by+cyclical+binding+of+Ca2%2B+to+mechanoelectrical-transduction+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A model for amplification of hair-bundle motion by cyclical binding of Ca2+ to mechanoelectrical-transduction channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15321-15326 (1998).</li>
<li>Assad, J. A., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+motor+model+for+adaptation+by+vertebrate+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An active motor model for adaptation by vertebrate hair cells.</a> Journal of Neuroscience. 12 (9), 3291-3309 (1992).</li>
<li>Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+adaptation+of+transducer+currents+in+turtle+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Activation and adaptation of transducer currents in turtle hair cells.</a> The Journal of physiology. , 405-434 (1989).</li>
<li>Howard, J., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+relaxation+of+the+hair+bundle+mediates+adaptation+in+mechanoelectrical+transduction+by+the+bullfrog%27s+saccular+hair+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical relaxation of the hair bundle mediates adaptation in mechanoelectrical transduction by the bullfrog's saccular hair cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (9), 3064-3068 (1987).</li>
<li>Purves, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+release+of+drugs+from+iontophoretic+pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">The release of drugs from iontophoretic pipettes.</a> Journal of Theoretical Biology. 66 (4), 789-798 (1977).</li>
<li>Tinevez, J. Y., Jülicher, F., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unifying+the+various+incarnations+of+active+hair-bundle+motility+by+the+vertebrate+hair+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Unifying the various incarnations of active hair-bundle motility by the vertebrate hair cell.</a> Biophysical journal. 93 (11), 4053-4067 (2007).</li>
<li>Ó Maoiléidigh, D., Nicola, E. M., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+effects+of+mechanical+loading+on+active+hair+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The diverse effects of mechanical loading on active hair bundles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (6), 1943-1948 (2012).</li>
<li>Kennedy, H. J., Crawford, A. C., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+generation+by+mammalian+hair+bundles+supports+a+role+in+cochlear+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Force generation by mammalian hair bundles supports a role in cochlear amplification.</a> Nature. 433 (7028), 880-883 (2005).</li>
<li>van Netten, S. M., Khanna, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffness+changes+of+the+cupula+associated+with+the+mechanics+of+hair+cells+in+the+fish+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stiffness changes of the cupula associated with the mechanics of hair cells in the fish lateral line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1549-1553 (1994).</li>
<li>Bormuth, V., Barral, J., Joanny, J. F., Jülicher, F., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+channels%27+gating+can+control+friction+on+vibrating+hair-cell+bundles+in+the+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transduction channels' gating can control friction on vibrating hair-cell bundles in the ear.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7185-7190 (2014).</li>
<li>Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actions+of+calcium+on+the+mechano-electrical+transducer+current+of+turtle+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">The actions of calcium on the mechano-electrical transducer current of turtle hair cells.</a> The Journal of physiology. , 369-398 (1991).</li>
<li>Kozlov, A. S., Risler, T., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+motion+of+stereocilia+assures+the+concerted+gating+of+hair-cell+transduction+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coherent motion of stereocilia assures the concerted gating of hair-cell transduction channels.</a> Nature Neuroscience. 10 (1), 87-92 (2007).</li>
<li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+free+Ca2%2B+concentration+in+hair-cell+stereocilia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of free Ca2+ concentration in hair-cell stereocilia.</a> Journal of Neuroscience. 18 (16), 6300-6318 (1998).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Bullfrog en sacculus içinde birkaç bin kolayca erişilebilir duyusal saç hücrelerinin yalan. Burada tek ve iki odacıklı kayıtları için çıkarma ve sacculus hazırlanmasını göstermektedir. Bu iki hazırlıkları saç hücreleri ve bunların ilişkili demetleri hem mikromekanik ve elektrofizyolojik çalışmalar izin verir. Doku oksijenli tuz sık değiştirilmesi ile birkaç saat yaşayabilir olduğundan, deneyler uzun süreler için devam edebilir. saç demetleri Ekstraksiyon sonra 24 saat süreyle kendiliğinden salınım yaparken bu hazırlıkların içinde saç hücreleri genellikle, diseksiyon sonra 6 saat süreyle mikroelektrot kayıt için geçerli kalır. sacculus Başarılı çıkarma ve montaj birkaç ortak zorlukları aşıp dayandırılmıştır. İlk olarak, sakküler makula apikal yüzeyi ile doğrudan temas hazırlık prosedürü boyunca kaçınılmalıdır. sakküler sinir güvenli manipu için uygun bir tanıtıcı sağlarsacculus bir yon. iç kulak organlarının geri kalan kurtulmuş sonra sakkuluslar sıvısında dalmış kalan onun duyusal epiteli mekanik zarar görmesini önlemek için ise bir büyük kalibreli pipet kullanarak transfer edilmelidir. maküler yüzeyinden otokonin çıkarılması saç hücreleri mekanik zarar vermeden tamamlanmalıdır. otokonin makula üstünde doğrudan yalan, çünkü saç hücreleri diseksiyon araçları ve otokonin sökerken otolithic membranı arasındaki kazara temas ile hasar görebilir. zarar görmemesi için, biz otokonin jelatinimsi kütle makula uzak bir yerde tutulan ve tek bir kütle olarak kaldırılmasını öneriyoruz. Bu bireysel çıkarılan olacağını her biri çok sayıda kümeler içine otoconial kütlenin parçalanmasını önler. otokonin küçük kümeler kalırsa onlar Pasteur pipeti tarafından teslim hafif sıvı basıncı ile kaldırılabilir. Son bir meydan okuma olarak sakkuluslar ve alüminyum montaj Meydanı arasında sıkı bir mühür oluşumuyla ilgilidirİki odacıklı preparat. yaklaşık 100 mikron sacculus ve çevresindeki alüminyum izinlerinin doku tam sızdırmazlık arasındaki örtüşme izin vermek için yeterince küçük bir perforasyon bir kare çalışanı. Tutkal sıkı bir mühür oluşturmak üzere, yaklaşık 100 um, maküler en çevresinde sakküler doku ile temas haline getirilmesi gerekmektedir. Serbest Ca konsantrasyonu 2+ saç hücrelerinin çalışmasında önemli bir husustur. Ca 2 + böylece kendiliğinden paket hareketi 8, 23 de dahil olmak üzere mechanotransduction aygıtının kinetik ve saç demeti aktif işlem olayların özelliklerini belirleyen, hızlı ve yavaş hem de adaptasyon düzenler. In vivo Endolenfatik kalsiyum nedenle çoğu fizyolojik ilgili kinetik bu konsantrasyonda (Maunsell JHR, R. Jacobs ve AJ Hudspeth değerlendirilir, 250 uM&#39;de mevcuttur. Unpublished gözlemler 16). Ancak, saç hücrelerinden mikroelektrot kayıtları mikroelektrot etrafında hücre zarının uygun sızdırmazlık için 2 mM aşan bir dış kalsiyum konsantrasyonunu gerektirir. Deneyler için, yüksek kalsiyum tuz kullanmak zorunludur. Son olarak, bir kalsiyum konsantrasyonları kullanarak çeşitli mechanotransduction üzerine harici kalsiyum etkilerini incelemek isteyebilirsiniz. Bu durumlarda, genellikle uç bağlantı rüptürü ve transdüksiyon 28 geri dönüşümsüz kaybına yol 1 uM&#39;nin altında kalsiyum konsantrasyonlarını hatırlamak önemlidir. Burada tarif edilen iki deney preparatlar kılı hücrelerinde biyofiziksel ölçümlerin bir dizi sağlar. Bununla birlikte, ilave ölçümler bu preparatların küçük değişiklikler yapılabilir. Katlanmış sakküler hazırlanmasında, saç demetleri yanal görüntülenmiştir. Bu noktadan görüntüleme saç demeti hareket tutarlı mot ortayaHem kısa hem de uzun boylu stereocilia 29 iyon. Burada sakküler makula ilk olarak alttaki dokuya ayrılır ve daha sonra, saç demetleri dışarı doğru bakar ve kırışık yanal görselleştirildiği şekilde sakküler sinir tarafından tanımlanan bir eksen boyunca katlanır. İkinci değişiklik, saç hücre ayrışma, saç hücrenin paket ve soma hem çalışma sağlar. Saç hücreleri mekanik görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıt 30 bir cam slayt üzerine ayrışmış bulunmaktadır. Son olarak, saç hücreleri de benzer bir ayrıştırma protokolü izlenerek, ancak, mekanik ayrıştırma aşaması olmadan epitel ekstrüde edilebilir. mekanik hasar en aza indirirken yavaş yavaş elektrofizyolojik kayıtlar için bazolateral erişim sağlayan, epitel dışarı a&#39;ya saç hücreleri Bu tedavi sonuçları. Bu preparatlar, ve pek çok değişiklik biyofiziksel için bir model sistem olarak kurbağa sacculus çok yönlülüğü göstermektedirduyusal saç hücrelerinin çalışma.

Memelilerin acousticolateralis organları karmaşık bir mimari sahip ve erişim zor olabilir anatomik bir niş içinde yalan. Örneğin, memeli koklea bir sarmal labirent oluşur ve kalın temporal kemik içinde gömülü. Koklea izolasyonu sık sık içinde yatan duyusal hücrelerin mekanik hasara neden olur ve bu nedenle zor bir görev 1 olduğu kanıtlanmıştır. Sinirbilimciler böylece daha kolay kulak kutsal ayıklanır sistemlerin modellenmesi döndü. Bu model sistemlerinde biri, Amerikan bullfrog (Rana catesbeiana) ve sakkuluslar, yıllardır işitsel ve vestibüler sistemin işlevi içine genellenebilir fikir vermiştir için vardır. sakkuluslar düşük frekanslı işitme ve sismik hissi hem de duyusal rolleri olan bir karma işlev organıdır. sacculus duyusal hücrelerin kendi saç hücreleri, mekanik enerjiyi dönüştürmek uzman dönüştürücüler vardırBizim işitsel ve vestibüler organları içinde elektrik sinyallerine. Her saç hücresinin apikal yüzeyinde çıkıntı stereocilia denilen genişlemiş mikrovilluslar kademeli bir tutam içeren bir mechanosensitive saç demetidir. Bitişik stereocilia uçları lifli uç bağlantı proteinleri ile birbirine mekanik olarak kapısı iyon kanalları mekanik uyarıcılara 2, 3 yanıt olarak. İşitsel ve vestibüler organlar uyaranlara farklı yanıt da, ortak bir algılama mekanizması paylaşır. Bu ortak nokta bullfrog sacculus çalışmaları sayesinde saç hücre mechanotransduction içine aldığı birçok anlayışlar yatmaktadır. Örneğin, saç hücrenin etkin bir süreç bu organ 4, 5, 6, 7 yaygın olarak incelenmiştir, ve saç demeti, mekanik üretmek için bir enerji tüketen işlemini kullanmaktadıriş. Sadece saç hücreleri aktif çalışma 6 oluşturmak olduğu gösterilmiştir, ancak farklı etken sürecini altında yatan mekanizmalar ve saç hücrenin akort özellikleri organlarının acousticolateralis bullfrog çalışmaları ile tanıtıldı edilmiştir. Amfibi papilla saç hücrenin şerit sinaps 12 aktif saç demeti motilite 8 ve saç hücresi elektrik rezonans 9, 10, sacculus 11 ve frekans seçiciliği bulunmaktadır. Bullfrog en sakkuluslar çeşitli nedenlerle duyusal sinirbilimciler hitap ediyor. Memeli koklea aksine, bu organın kolayca erişilebilir otik kapsül içinde yatıyor. İkincisi, bu organın içindeki saç hücreleri, 14 uygun koşullar 13 altında birkaç saat sağlıklı kalabilir. Bu experimentat izinonların memeli meslektaşları göre uzun zaman ölçekleri üzerinde bu hücrelerin iyon. Üçüncü olarak, organ kolay manipülasyon izin, küçük eğrilik taşır. Dördüncü, her organ, yüksek verimlilik ve belirli bir deney için saç hücrelerinin uygun bir dizi bulma olasılığı yüksek hem de sağlayarak, bin ya da daha fazla saç hücrelerinin 15 içermektedir. Son olarak, Bullfrog en sakkuluslar kolayca nedeniyle saç hücrelerinin bu organ ve büyük boy inceliği ile görüntülenmiştir. Bu özellikler Bullfrog en sacculus içinde duyu hücrelerinin çalışma için büyük bir çok yönlülük sağlar. eldeki soruya bağlı olarak, bir çok deneysel preparatlarının bir sacculus elde edilebilir. Bu en basit bir bölme hazırlığı olduğunu. Burada sacculus yapay perilenf bir sodyum-zengin ve yüksek kalsiyum tuzlu su ile doldurulmuş bir odacığm içine tesbit edilir. Bu hazırlık saç hücre akımları ve temel saç demeti mekaniği çalışma sağlar. Ikinci bir konfigürasyon, iki odacıklı preparat, kendiliğinden saç demeti hareketleri incelemek için kullanılabilir. bazolateral tarafı yapay perilenf yıkandığı ise burada saç hücrelerinin apikal tarafı potasyum bakımından zengin ve kalsiyum bakımından fakir tuzlu maruz kaldığı, yapay endolymph olarak adlandırılan. Bu iki bölme salines in vivo düzenleme taklit ve saç demetleri kendiliğinden salınım sağlayan bir ortam sağlar. Bu yazıda duyusal saç hücrelerinin biyofiziksel çalışma için BULLFROG en sacculus hazırlanmasını tarif etmektedir. Biz ilk Kurbağanın iç kulak bu organın izole ayrıntılı bir tasvirini sunar. Daha sonra tek ve iki odacıklı hem deneysel hazırlıkları tanımlamak ve her yapılandırma için temsili sonuçlar içermektedir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > her iki preparat için de ortak< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Stereo-diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Trikain metansülfonat</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Metal pithing çubuğu</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Vannas yaylı makas</td><td>Güzel Bilimler Araçlar</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Cam Pasteur pipeti ve ampulü (x2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-042816</td><td></td></tr><tr><td>Hipodermik iğneye monte edilmiş ince kirpik</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-557-172</td><td></td></tr><tr><td>Dow-corning vakum gresi</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5C</td><td></td></tr><tr><td>Vakum için şırınga gres</td><td>yağı Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>35 mm Petri kabı (x2 - 3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme</td><td>Sutter</td><td>P-97 veya P-2000</td><td></td></tr><tr><td>120 V Solenoid çektirme</td><td></td><td></td><td>Ev yapımı, parça listesine bakın</td></tr><tr><td>Püskürtme kaplayıcı</td><td>Anatech USA</td><td>Hummer 6.2</td><td></td></tr><tr><td>İyontoforez için akım kaynağı</td><td>Axon Instruments</td><td>AxoClamp 2B</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Piezoelektrik aktüatör</td><td>Piezosystem Jena</td><td>P-150-00</td><td></td></tr><tr><td>Piezoelektrik aktüatör için amplifikatör</td><td>Piezosystem Jena</td><td>ENV800</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>1B120F-3</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Tek odacıklı hazırlık için</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroelektrot amplifikatörü</td><td>Axon Instruments</td><td>AxoClamp 2B</td><td>Aynı anda iyontoforez ve mikroelektrot kayıtları için kullanılabilir</td></tr><tr><td>Manyetik pimler (x2)</td><td></td><td></td><td>Ev yapımı, parça listesine bakın</td></tr><tr><td>Manyetik levhalı</td><td></td><td></td> üstü açık hazne <td>Ev yapımı, parça listesine bakın</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Katalog Numarası</td><td>Comments< / strong</td></tr><tr><td>> İki odacıklı hazırlık için< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Üst hazne</td><td></td><td></td><td>Ek dosya 1</td></tr><tr><td>Oluklu alt hazne</td><td></td><td></td><td>Ek dosya 2</td></tr><tr><td>Alüminyum folyo</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Montaj bloğu</td><td></td><td></td><td>Ek dosya 3</td></tr><tr><td>Ahşap aplikatör çubukları</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-112</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Teflon levha</td><td>McMaster-Carr</td><td>8545K12</td><td>Teflon aplikatörü için</td></tr><tr><td>Siyanoakrilat yapıştırıcı</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar dokuları (Kimwipes)</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Gentamisin sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Hızlı sertleşen epoksi</td><td>McMaster-Carr</td><td>7605A18</td><td></td></tr><tr><td>18 mm cam lameller</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-546</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Tuzlu bileşenler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504-500G</td><td>Diğer kaynaklar</td></tr><tr><td>kullanılabilir CaCl2 &bull; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>10035-04-8</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-100G</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>D- (+) -glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td><güçlü > İsim< / güçlü > <</td> <td>güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar / Açıklama< / güçlü ></td></tr> <tr><td>< güçlü > ev yapımı ekipman için parça listeleri< / güçlü > <</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>güçlü > Solenoid çektirme < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Solenoid Koruyucu Elektrik</td><td>A420-065426-00</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Ayak pedalı anahtarı</td><td>Linemaster</td><td>T-51-SC36</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Pipet tutucu</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH900R</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Kaba manipülatör</td><td>Narishige Group</td><td>MM-3</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Platin tel</td><td>Alfa Aesar</td><td>25093</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Güç kaynağı</td><td>Leica</td><td>Z050-261</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td> Yorumlar / Açıklama< / strong</td></tr><tr><td>> Manyetik pimler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Epoksi</td><td>McMaster-Carr</td><td>7556A33</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>1 mm kalınlığında alüminyum</td><td>McMaster-Carr</td><td>89015K45</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Böcek pimleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26000-40</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar/Açıklama</strong</td></tr><tr><td>>Üstü açık manyetik hazne</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esnek manyetik şerit</td><td>McMaster-Carr</td><td>5759K75</td><td>Diğer kaynaklar</td></tr><tr><td>kullanılabilir 1 mm kalınlığında alüminyum</td><td>McMaster-Carr</td><td>89015K45</td><td>Diğer kaynaklar kullanılabilir</td></tr></tbody></table>

amerikan bullfrog of sacculus (saç hücrelerinin fizyolojik hazırlanması<em&gt; rana catesbeiana</em&gt;)

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

işitme ve denge çalışma modeli sistemlerinde biyofiziksel çalışmalardan alınan bilgilerle üzerine oturmaktadır. Böyle bir model Amerikan bullfrog sakkuluslar, işitsel ve vestibüler araştırma bir dayanak noktası haline gelmiştir. Bu organın Çalışmalar aktif ortamdan sinyalleri tespit nasıl duyusal hücrelerin saç ortaya koymuştur. Çünkü bu çalışmaların, şimdi daha iyi mekanik yolluk ve saç hücrenin transdüksiyon kanalları, mekanik uyarlamasında Kalsiyum rolü lokalizasyonu ve saç hücresi akımların kimliğini anlıyorum. Bu son derece erişilebilir bir organ saç hücrelerinin işleyişini içgörü sağlamaya devam etmektedir. Burada da saç hücreleri üzerinde biyofiziksel çalışmalar için BULLFROG en sacculus hazırlanmasını tarif etmektedir. Biz tam diseksiyon prosedürü içeren ve belirli bağlamlarda sacculus hazırlanması için özel protokolleri sağlar. Biz ayrıca hesaplanması dahil olmak üzere bu hazırlık kullanılarak temsilcisi sonuçları içerirsaç Paketin anlık kuvvet-deplasman ilişkisi ve Paketin kendiliğinden salınım ölçümü.

Bullfrog en sacculus duyusal epitel saç hücrelerinin fizyolojisini prob çeşitli konfigürasyonlarda kullanılabilir. Doku nispeten düz olduğu için, tek ve iki-odacıklı preparatlar hem de monte edilebilir. tek odalı yapılandırma saç hücreleri elektrofizyolojik ve mikromekanik kayıtlar için basit bir kurulum sağlar. iki odacıklı hazırlık yerine Endolenfatik ve saç hücrelerinin sırasıyla apikal ve bazal tarafta perilenfatik bölmeleri simüle eder. Bu bölmeler birbirine saç hücreleri tarafından mechanotransduction çalışma için fizyolojik olarak uygun bir ortam sağlar. saç hücrelerinin duyarlılığı ve transdüksiyon özellikleri, mekanik stimülasyon elektrik tepki temelini oluşturur. Bu özellikleri prob, biz aynı anda tek bir saç kaydedilen onun paket konumunu hücre veHücrenin reseptör potansiyeli (Şekil 2). Biz ilk kuvvet darbelerini uygulamak için saç demeti kinociliary ampul için esnek bir cam elyaf bağlı. Daha sonra çift fotodiyot sistemi 2 (Şekil 2A) ile saç demeti en deplasman ölçüldü. Biz aynı anda keskin bir mikroelektrot ile hücreyi impaling saç hücrenin potansiyelini satın aldı. Bu saç demeti karşılık gelen yer değiştirme (Şekil 2B) karşı her bir mekanik uyarıma neden tepe voltaj yanıt işaretlenmesiyle bir yer değiştirme-yanıt eğrisi elde edilmiştir. saç hücrenin elektriksel tepki hem pozitif-negatif-deplasman ekstramumların için doyurur. Negatif değiştirme adımları ile membran potansiyelinin azalmasına mechanotransduction akım içeri doğru, bir dinlenme varlığını gösterir. Bu dinlenme akımı, hem hızlı hem de yavaş adaptasyon 17 Ca 2+ hareketi ile modüle edilir 18, 19, 20, 21. Bir saç hücrenin davranışı elektrik özellikleri üzerine değil, aynı zamanda onun duyusal saç demetinin mikromekanik üzerine sadece bağlıdır. İki odalı yapılandırma taklit bir saç demeti mekaniği çalışmaları için ideal koşullar sağlayan in vivo endolymph ve perilenf ayrılması. Bu koşullar altında ve kaldırılır otolithic membran ile, saç demetleri kendiliğinden 6 salınım olabilir. Burada bireysel demetleri mikromekanik değerlendirmek için iki odacıklı hazırlık kullandı. Biz bir çift fotodiyot deplasman monitör (Şekil 3) üzerindeki gölge döküm bir saç demeti spontan salınımların kaydedildi. mechanotransduction üzerinde antibiyotik aminoglikozid gentamisin rolünü değerlendirmek için, iyontoferik rele<html> saç demeti doğrudan gentamisin ased (Şekil 3). serbest gentamisin konsantrasyonu mikropipet geçti akım ile orantılı artar. Gentamisin saç Paketin salınımları inhibe ederek uzun tarafına doğru demetin ofset statik neden olur. Bu etkiler kendi nüfuz gözenek bloke ederken mechanotransduction kanalların açık durumunu koruyan bir açık kanal blokörü olarak gentamisin rolünü yansıtmaktadır. Yüklü kimyasal iyontoforez lokalize ve sıvı akış kaynaklı mekanik bozulma olmaksızın çeşitli konsantrasyonlarda kimyasal ölçülebilir salma ve bu nedenle ideal olarak saç demeti 22 ile mechanosensitive organellerin çalışma için uygundur izin verir. Bir saç demeti spontan hareket, uyum ve doğrusal olmayan demet sertlik 7 arasındaki etkileşim doğarxref &quot;&gt; 8, 23, 24. Bu kendiliğinden hareket viskoz sürükle aşmak için mekanik çalışma içine sinyal enerjisini dönüştüren bir saç demeti aktif sürecin, bir imza. Saç demetleri vestibüler 2, işitsel nonlineer anlık sertliği sergiledikleri görülmüştür 25, ve lateral hattı sistemleri 26. Bu doğrudan BULLFROG en sacculus (Şekil 4) bağımsız bir saç demeti ani sertlik ölçülmüştür. Bu amaca ulaşmak için, saç demeti en kinociliary ampul (Şekil 4A) için esnek bir cam elyaf ucu bağlanmış. Biz elyafın tabanını yerinden saç demeti kuvvetleri teslim. uyarıcı fiber saç demeti üzerine uygulanan kuvvet elyafın bas deplasmanları arasındaki farka tekabüle ve ucu, fiberin sertlik 2, 27 ile çarpılır. güçlerin bir dizi genelinde bakliyat teslim paket ve Paketin takip eden yerinden üzerine uygulanan kuvvet arasındaki ilişkiyi ortaya koymaktadır. Bu kuvvet-deplasman ilişkisi eğimi saç Paketin anlık sertlik (Şekil 4A) karşılık gelir. Bu yöntem kendi sapma (Şekil 4B) &#39;in bir fonksiyonu olarak tek bir grubu en anlık sertliği ölçmek için izin verdi. ani kuvvet-yer değiştirme eğrisinin dinlenme konumu etrafında yaklaşık 20 nm aralığında demetin lineer olmayan bir sertlik ortaya, doğrusal olmayan bir ilişkiyi gösterir. bu kapsam dışında, saç demeti, bir Hookyen malzeme gibi, kendi sertliği büyük büyüklüğü saptırma lineer şekilde hareket eder. Bu sonuçlar, demonstsaç hücre fizyolojisinin çalışmada bullfrog sacculus çok yönlülüğünü oranı. Bu ve diğer hazırlıkları kullanarak, bir beyne doğru paket bilgilerin iletimi birden aşamalarında mekanotransdüksiyonu keşfedebilirsiniz. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55380/55380fig1.jpg" /> Şekil 1: Bullfrog Inner Kulak diseksiyonu. Ventral taraftan Bullfrog üst damak görüntüleme (A) Östaki borusu (daire) tanımlanmasına izin verir. Üst damak sağ tarafını kaplayan derinin yan yansıma iç kulak (kesik kutu) yerini ortaya koymaktadır. Kurbağanın temporal kemiğin ventral tarafta kıkırdak (B) Temizleme otik kapsül (kesikli çizgi) açılır. Görüntülenen (C) otik kapsül daha yüksek bir büyütme görüntü, hangi sakkuluslar, lagena, CN VIII, ve SACC içinde<html> nitlerin sinir kolaylıkla tespit edilebilir. (D) iç kulak organların çıkarıldıktan sonra otik kapsül bir görünüm semisirküler kanalların yerleri ortaya koymaktadır. Kraniyal sinir (CN VIII) &#39;inci izole iç kulak, sacculus, lagena ve VIII çıkarılmasından sonra (E) kolayca tespit edilebilir. (F) izole sakkuluslar sakküler sinir ve duyu epiteli üstünde yatan bir otolithic zarının kısa güdük sahiptir. Etiketler (ii) lagena, (iii) CN VIII (IV) &#39;sakküler sinir ve (v) otolithic membran (I)&#39; in sacculus karşılık gelmektedir. Eksen P etiketler ve A posterior ve anterior yönde sırasıyla gelmektedir. Ölçek çubukları 1 cm (A, B), 1 mM (C, D, E) ve 400 um (F) ifade etmektedir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55380/55380fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> s &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın bir vektör sürümünü indirmek için buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55380/55380fig2.jpg" /> Şekil 2: Tek Saç Hücre Deplasman-cevap Eğrisi. (A) bir cam uyaran lif ucu kinociliary saç demetinin ampul ve fiberin tabana birleştirilmiş olan, daha sonra, dokuz farklı aşamalarda arasında yer değiştirmiştir. Paketin konumu çift fotodiyot sisteminde takip edildi, ve onun reseptörü aynı zamanda, potansiyel, çıkış köprüsü modunda bir amplifikatör içinden geçirilmiş bir mikroelektrot kullanılarak ölçülmüştür. elektrot ucu direnci 95 M? ve Paketin istirahat membran potansiyeli oldu -47 mV. (B) yer değiştirmesinin bir fonksiyonu olarak Paketin reseptör potansiyel bir arsa Paketin yanıtı ve onun arasında doğrusal olmayan bir ilişkiye ortayapozisyon. Her nokta mekanik stimülasyon başlamasından sonra 2.5 ms başlayan bir 2.5 ms zaman pencere üzerinde ortalama potansiyeli ve ortalama yerinden karşılık gelir. Her renk, aynı deplasman darbesine karşılık gelen zaman serilerinin bir dizi temsil eder. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55380/55380fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55380/Figure2_Xd_Xc_Vm_version4.eps" target="_blank">Bu rakamın bir vektör sürümünü indirmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55380/55380fig3.jpg" /> Şekil 3: Spontan Saç Bundle Salınım üzerinde Gentamisin Etkisi. İki odacıklı preparat bir saç demeti kendiliğinden hareket çift fotodiyot sistemi kullanılarak kaydedilmiştir. gentamisin iyontoforetik sürümü yokluğunda (0 nA) ise, saçdemet simetrik titreşimleri görüntüler. Mevcut büyüklüğü gentamisin sülfat büyür 500 mm (10 Na, 20 nA), saç demeti başka bir frekans doza bağlı bir şekilde düşer ve paket uzun için uzun kenarına doğru ofset dolu bir iyontoforetik pipet geçerken zaman dilimleri. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55380/55380fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55380/Figure3_GentaSpontOsc_version2.eps" target="_blank">Bu rakamın bir vektör sürümünü indirmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55380/55380fig4.jpg" /> Şekil 4. Bir saç demeti en Ani Rijitliğinin hesaplanması. Sertlik K F (A) uyaran lif (kırmızı) t bağlanıro ayrı bir saç demeti (sarı) ve (kahverengi) kinociliary ampul. Lif tabanını yerinden bilinen bir mesafe X F X mesafesi B taşımak için paket neden olur. Kuvvet uyaran lif, F F paket üzerine uygulanan lif ve paketin deplasmanları arasındaki fark orantılıdır. güçlerin bir dizi genelinde bu Tekrarı anlık kuvvet-deplasman ilişkisi (sağda), eğim olan saç Paketin anlık sertlik karşılık verir. (B) Bireysel paket darbe başlangıcı (mavi noktalar) ölçüldü sonra ilk 50 ms içinde artan büyüklük ve yer değiştirme darbeleri zorlamak tabi tutuldu. Burada saç demeti dinlenme konumu etrafında yaklaşık 20 nm aralığında doğrusal olmayan bir anlık sertliğini gösterir. * Z - 60 * z * (1 / (1 + exp (- kırmızı eğri ilişkisi F = k * X bir uyum tekabül<html> (X - X 0) F paket uygulanan kuvvet olduğu / (k B * T))) + F 0, X Paketin deplasman, k = 790 ± 51 μN m -1 paket en sabittir ∙ sertlik tüm kanallar kapalı ya da açık olan, z = 0.43 ± 0.04 pN tek yolluk yayının kuvveti, X 0 = 2 ± 1.9 nm kendi kanalları% 50 açık hangi Paketin konumu, k B Boltzmann olduğunu sabit, T sıcaklığı ve F 0 = 11.7 ± 1.3 pN ofset güçtür. uygun 0.98 belirlenmesi bir katsayısına sahiptir. Uyarıcı lif 107 μN bir sertlik m -1 ∙ vardı. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55380/55380fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> es / ftp_upload / 55380 / Figure4_v5.eps &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın bir vektör sürümünü indirmek için buraya tıklayınız. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> çözünen </td><td rowspan="2"> Formül Ağırlığı (g / mol) </td><td colspan="2"> 1 L Ekle </td></tr><tr><td> yapay perilenf </td><td> yapay endolymph </td></tr><tr><td> NaCI </td><td> 58.4 </td><td> 6.54 g </td><td> 0.117 g </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 0.149 </td><td> 0.149 g </td><td> 8.62 gr </td></tr><tr><td> CaCl2 ⦁ 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 1 M CaCI2 stokunun 2 mL </td><td> 1 M CaCl2 stokunun 250 uL </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 238,3 </td><td> 1.19 g </td><td> 1.19 g </td></tr><tr><td> D - (+) - glukoz </td><td> 180.2 </td><td> 0.541 g </td><td> 0. 541 gr </td></tr></tbody></table> Diseksiyon ve Deneysel Hazırlama Tablo 1. çözümler. Yapay perilenf ve diseksiyon ve tek veya iki odalı hazırlıkları kullanılan yapay endolymph çözümleri için tarifler bu tabloda alınmaz. çözeltiler pH 7.2 getirilmelidir - 7.4 NaOH (perilenf) ya da 2 mL KOH (endolymph) yaklaşık 2 mL. Ozmotik gücü yaklaşık 230 mmol okumalısınız · kg-1 eksik iyonik ayrışma nedeniyle.

Amerikan bullfrog en (Rana catesbeiana) sakkuluslar saç hücre fizyolojisinin doğrudan muayene izin verir. İşte diseksiyon ve biyofiziksel çalışmaları için Bullfrog en sacculus hazırlanması tarif edilmektedir. Biz onun unforced bir hareket Paketin kuvvet-deplasman ilişkisi hesaplanması ve ölçümü de dahil olmak üzere, bu saç hücrelerinden temsili deneyler göstermektedir.

Amerikan Bullfrog of sacculus (Saç Hücrelerinin fizyolojik hazırlanması<em&gt; Rana catesbeiana</em&gt;)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American ...

Bu prosedürün genel amacı, boğa kurbağasının sacculusunu hem mikro-mekanik hem de biyofiziksel çalışmalara hazırlamaktır. Bu yöntem, duyusal nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. İşitsel ve vestibüler tüy hücreleri nasıl adapte olur?Tüy demetlerinin spontan osilasyonuna ne sebep olur ve tüy hücreleri mekanik uyarılara aktif olarak nasıl yanıt verir. Bu teknik, birkaç saat boyunca sağlıklı kalan tüy hücrelerine kolay erişim sağlar. Tüy hücreleri kırılgan ve mekanik olarak hassas oldukları için, bu prosedürler sırasında bütünlüklerinin korunması zor olabilir.Diğer araştırmacıların uygun doku işleme tekniklerini uygulayabilmeleri ve iç kulak biyofizik çalışmalarında başarı sağlayabilmeleri için burada bu yöntemin görsel bir gösterimini sunuyoruz. İşleme, yenitaze kesilmiş boğa kurbağası başını steril bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirerek başlayın. Bu görüntüdeki kesikli kutu, iç kulağın konumunu göstermektedir.Vomerine dişlerden dokunun en arka kısmına kadar palatal doku boyunca orta hat boyunca bir kesi yapmak için bistüri kullanın. Ardından, posterior kıkırdağı ortaya çıkarmak için palatal dokunun altında bulunan tüm kasları kesmek ve temizlemek amacıyla bistüri ile yatay kesiler yapın. Kasları temizledikten sonra, otik kapsülün sınırını oluşturan temporal kıkırdağın lolipop şeklini gözlemleyin.Columellayı, otik kapsül kıkırdağı ile temas ettiği noktadan kesin. Ardından, birkaç ince tabaka tıraşlamak için kıkırdak boyunca tekrar tekrar sığ yatay kesikler yapın. İç kulak organlarının zarar görmesini önlemek için derin kesiklerden kaçının.Bu görüntüde gösterildiği gibi, temporal kıkırdağın lolipop yapısı içinde bulunan otik kapsül açılıp iç kulak organları görünür hale geldiğinde tıraşlamayı durdurun. Ardından, iç kulak organlarına zarar vermemeye dikkat ederek otik kapsülün posterior ve lateral kenarlarını kesin. Diseksiyon boyunca iç kulak organlarının batmış ve nemli kalmasını sağlamak için üzerlerine sık sık salin akıtın.Şimdi, temporal kemikte, kıkırdağın orta hatta bağlandığı en iç kısımdaki iki dairesel açıklığı belirleyin. Temporal kemiği kırmak için en içteki açıklıktan aşağıya doğru kesin. Ardından, otik kapsülün posterior, lateral kenarından ikinci bir aşağıya doğru kesi yapın.İç kulak organlarına erişim sağlamak için bu kesim ile önceki kesim arasındaki kıkırdak parçasını kanırtarak ayırın. Bu işlem, daha sonraki manipülasyonlarda tutamak olarak kullanılabilecek olan en yakın yarım daire kanalı keser. Ardından, sacculus'a dokunmamaya dikkat ederek, lagena'yı ve sekizinci kranial siniri Scarpa ganglionu seviyesinden kesin.En yakındaki yarım daire kanalı ampullasını tutarken, iç kulağı nazikçe döndürün ve kalan iki yarım daire kanalını kesin. Siniri veya yarım daire kanalı ampullasını tutarak, iç kulağı kafadan çıkarın ve soğutulmuş, oksijenlendirilmiş yapay perilenfle dolu bir kaba yerleştirin. İç kulağın çıkarılması, yarım daire kanallarının daha önce geçtiği temporal kemik içindeki pasajların görselleştirilmesine olanak tanır.Sakkulus, yüzeydeki geniş otokonia kitlesi ve sakküler sinir aracılığıyla tanımlanır. Sakkulusu belirleyin ve ardından iç kulağın daha rahat hareket ettirilebilmesi için yarım daire kanalları kesin. Sonrasında, sakkulusun nöral tarafının üzerinde bulunan perilenfatik sisternin çevresine nazik kesikler atın.Sisternin membranını sacculus'un nöral tarafına bağlayan küçük doku sütunlarını kesin ve sisterni çıkarın. Ardından, utriculus lagena'ya giden siniri ve lagena sinirini çıkarın. Daha sonra, saccular sinirini tutarken sacculus'u nazikçe kaldırın ve otoconia kesesinin ince membranını kesin; otoconia keseden dışarı dökülürken, çevresini keserek sacculus'u serbest bırakın.Sakkül üzerinde kalan otokonyaları dikkatlice temizlemek için makas veya pens kullanın. Bu işlem sırasında sakküle dokunmamaya özen gösterin. Şimdi, membranın plastik ve cam yüzeylere yapışmasını önlemek için sakkül kenarındaki kalan otokonyal sak membranını kesin.Son olarak, kalan otokonyaları temizlemek için Pasteur pipetiyle sacculus üzerine nazikçe salin akıtın. İzole edilmiş sacculus burada detaylı olarak gösterilmiştir. Kesikli çizgi, otolitik membran ile altındaki kıl hücrelerini içeren duyusal makulanın konumunu belirlemektedir.Ucu kırılmış bir Pasteur pipetinin arka ucunu kullanarak, izole edilen sacculusu Proteus 24 Çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın. Ardından dokuyu 22 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Sindirilmiş her bir sacculusu açık yüzeyli bir deney odasına aktarın ve dokuyu manyetik pinlerle sabitleyin.Ardından, üstteki otolitik membranı kaldırmak ve kıllı hücreleri içeren sakküler makulayı açığa çıkarmak için ince bir kirpik tüyü kullanın. Sakkülüsü izole ettikten sonra, montaj bloğunu yapay perilenfle doldurun. Daha sonra, bir açıklığa iki nokta vakum gresi uygulayın ve üzerine delikli alüminyum yerleştirerek zayıf bir sızdırmazlık sağlayın.Ardından sacculus'u folyoya aktarın ve macula aşağıya, sinir kütüğü ise yukarıya bakacak şekilde deliğin üzerine ortalayın. Sacculus ile montaj folyosu arasında sıkı bir sızdırmazlık oluşturmak için, montaj haznesinin karşı tarafındaki salini bükülmüş bir doku parçasıyla çekin. Alüminyum karenin yüzeyindeki sacculus çevresindeki salini emdirerek temizleyin.Sakculus kenarı ile alüminyum kare arasındaki sınıra siyanoakrilat tutkalı hızlıca uygulamak için bir politetrafloroetilen aplikatör kullanın. Sakculusun tüm çevresinin tutkalla kaplandığından emin olun. Siyanoakrilat tutkalını uygularken, doğrudan temastan kaçınarak tutkalı doku kenarı boyunca yönlendirmek için aplikatörü kullanın.Amacınız, endolenfatik ve perilenfatik kompartmanları izole etmek için tam bir sızdırmazlık sağlamaktır. Yapıştırıcının dokunun arkasına doğru yayılmasını önlemek için hızlıca ilerleyin. Yapıştırıcının kuruması için monte edilmiş dokunun üzerine bir damla salin damlatın.Tuzlu su damlasının üzerinde ince bir tutkal tabakası oluşabilir; eğer oluşursa, bunu pensle temizleyin. Folyoyu montaj bloğundan dikkatlice çıkarın. Montajlanmış dokuyu, sacculus'un macula tarafı yukarı bakacak şekilde ters çevirin ve yapay perilençle dolu bir Petri kabının üzerine yüzdürün.Makula üzerine bir damla Proteus 24 Solüsyonu ekleyin ve 22 derece celsius sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, iki bölmeli düzeneğin alt kanalını perilenle doldurun ve merkezi bölmenin etrafına vakum gresi sürün. Folyo üzerine monte edilmiş sacculusu, siniri bölme yüzeyine bakacak şekilde alt bölmeye yerleştirin.Folyonun çevresine gres sürün. Hazırlığın üst odasını, vakum gresi ile tam bir sızdırmazlık oluşturmaya dikkat ederek folyonun üzerine yerleştirin. Üst odayı kabarcıklı yapay endolenf ile doldurun, ardından tüy hücrelerini içeren sakküler medyayı açığa çıkarmak için otolitik membranı bir kirpik fırçasıyla nazikçe kaldırın.Bu görüntü, ayrık adımlarla gerçekleştirilen tüy demeti yer değiştirme sonucunu göstermektedir. Demet yer değiştirmesi, eş zamanlı keskin mikroelektrot reseptör potansiyeli ölçümü ile birlikte çift fotodiyot sistemi kullanılarak takip edilmiştir. Demetin reseptör potansiyelinin yer değiştirmesinin bir fonksiyonu olarak çizilen grafiği, demetin tepkisi ile konumu arasında doğrusal olmayan bir ilişki olduğunu ortaya koymaktadır.Her renk, aynı yer değiştirme pulsuna karşılık gelen bir zaman serisi setini temsil eder. Yukarıdan bakıldığında, iki odacıklı bir preparasyondaki tüy demetleri kendiliğinden salınım yapar. Gentamisin iyontoforetik salınımı olmadığında, bir tüy demeti simetrik salınımlar sergiler.Ardından, 500 mM gentamisin sülfat ile doldurulmuş bir iontforetik pipetten geçirilen akım şiddeti arttıkça, tüy demetinin salınım frekansı doza bağımlı bir şekilde düşer ve demet daha uzun süreler boyunca uzun kenarına doğru kayar. Bu teknikten yeterinceye gelindiğinde, işlem 75 dakikada gerçekleştirilebilir. Bu prosedürün ardından, tüy hücrelerinin aktif süreçlerini araştırmak için elektrofizyoloji ve mekanik yük alkışlaması gibi deneysel yöntemler uygulanabilir.Bu teknik, duyusal nörobilim alanındaki araştırmacıların yolunu açmıştır. Omurgalılarda işitme ve dengenin mekaniğini keşfetmek amacıyla uygulanmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, tüy hücresi fizyolojisinin biyofiziksel incelemesi için boğa kurbağası sacculus'unun nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

physiological-preparation-hair-cells-from-sacculus-american-bullfrog

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Memeli koklea iç saç hücresi şerit sinaps işitsel sinir lifi dendritler Tüm hücre yama klemp kayıtları.

Koklear İç Saç Hücreleri Ulaşın Afferent Dendritler postsinaptik Kayıtlar: Şerit Synapse Multivesicular Yayın İzleme

Electromotility, yavaş motilite ve eğilme gibi dış tüy hücresi (OHC) hareketli yanıtları, araştırmak için güvenilir bir yöntem açıklanmıştır. OHC motilite harici bir alternatif elektrik alan stimülasyonu ile ve yöntemi, yüksek hızlı görüntü kaydı, LED tabanlı aydınlatma, ve son nesil görüntü analiz yazılımı yararlanır.

Harici Alternatif Elektrik Alan Uyarılma ve Görüntü Analizi Yüksek hızlı bir kombinasyonu ile Dış Saç Hücre Motilite incelenmesi

Bu videonun amacı yetişkin zebrafish iç kulak organları sağlıklı, bozulmamış saç hücreleri elde etmek ve daha sonra kendi voltaj kapılı kanallar biyofiziksel özelliklerini karakterize yönelik yama klemp çalışmaları için bunları kullanarak prosedürleri göstermektir.

İç Kulak Saç Hücreleri Patch Clamp Kayıtlar İzole Zebrafish gelen

Vestibüler saç hücre fonksiyonu analizi kafatası, petröz temporal kemiğin en zor kısmı içinde derin konumlarına göre karmaşıktır. En işlevsel saç hücre çalışmaları akut izole saç hücrelerinin kullandık. Burada elektrofizyolojik ve iki-fotonlu mikroskop çalışmaları için fare vestibüler epitelyum bir yarı sağlam hazırlanması açıklanmaktadır.

Elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton Mikroskopi için Fare Vestibüler Duyu epiteli bir İzole Yarı sağlam Hazırlık

Fare kulağı derisi kıl foliküllerini innerve eden palisade uçlarının mızrak şeklinde terminallerinin mekanik stimülasyonuna bağlı afferent deşarjı kaydetmek için basit ve yeni bir teknik sunulmuştur.

Fare Saç Folikül hançer Endings de Mekanik Uyarılmış Afferent Çıkışı ve Sinir Terminali Etiketleme Kombine Kaydı

Bu iletişim kuralı İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi postnatal fare pups üzerinden kaydetmek için yöntemler açıklanır. Dış saç hücreleri fonksiyonel gelişimi incelemek için tüm hücreli yama kelepçe dış saç hücreleri izole kayıt deneysel işlemin adım adım açıklanmıştır.

İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi ve dış saç hücre bütün hücreli yama kelepçe kayıt Doğum sonrası sıçanlarda

Bu yazıda, Xenopus laevis Kurbağa yavrularını retinotectal devre eğitim için tüm cep telefonu yama kelepçe kaydetmek için kullanılan üç beyin hazırlıkları görüşmek. Kendi belirli avantajları ile her hazırlık Xenopus iribaş deneysel tractability nöral devre işlevi incelemek için bir model olarak katkıda bulunmaktadır.

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

Bu makalede, yetişkin fare kokleae immünohistokimya için 10 mm yuvarlak kapak fişleri koklear epitel parçaları yapıştırmak için bir hücre ve doku yapıştırıcı kullanımı ve kireçlenme gerektiren değiştirilmiş bir koklear yüzey hazırlama yöntemi sunar.

Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama

Burada, fonksiyonel mekanotransdüksiyon kanalları ile işitsel saç hücrelerinde 3 kDa Texas Kırmızı etiketli dextran alımını görselleştirmek için bir yöntem salıyoruz. Buna ek olarak, 3-10 kDa dekstrans saç endositoz ve Corti organının destekleyici hücreleri çalışmak için kullanılabilir.

Canlı ve Fonksiyonel Murine Koklear Saç Hücrelerinde Dekstran Etiketleme ve Alımı

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Burada, farelerden birincil koklear saç hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Başlangıçta, Corti'nin organı yenidoğan (3-5 günlük) murin koklealarından mikroskop altında diseke edildi. Daha sonra, hücreler enzimatik olarak tek hücreli bir süspansiyona sindirildi ve kültürde birkaç gün sonra immünofloresan kullanılarak tanımlandı.

Yenidoğan Farelerden Primer Koklear Saç Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Keşfedin Amerikan boğa kurbağası sakkulusunun diseksiyon ve hazırlama yöntemini, saç hücreleri fizyolojisi ve biyofiziksel çalışmalar için. Bu teknik duyusal sinirbilim araştırmalarında sağlıklı hücre erişimi sağlar.

Amerikan Bullfrog of sacculus (Saç Hücrelerinin fizyolojik hazırlanması

Daha fazla video keşfet