Angiogenez Multiphoton mikroskobu In Vivo genetiği değiştirilmiş 3D-PLGA/nHAp İskele tarafından grefti kritik Kemik defekti tamir için görselleştirme

Bu deneyin genel amacı, çoklu foton mikroskobu ile gerçek zamanlı olarak üç boyutlu iskelelerde In Vivo kan damarı oluşumunu görselleştirmektir. Ölçülen bu bilgiler, gerçek zamanlı olarak üç boyutlu iskelelerde in vivo kan damarı oluşumunun nasıl nötralize edileceği ve kandırılacağı gibi kemik oluşturma alanındaki kilit sorulardır. Bu tekniğin bir avantajı, CERES'i, hücre dışı metrikleri ve çevredeki moleküler ağları in vivo olarak aynı anda nötralize etmeyi sağlamasıdır.

Başlamak için 20 gram PLGA ve 20 mililitre 1, 4 dioksan içeren homojen bir çözelti hazırlayın. Ardından, çözeltiye iki gram toz nHAP ekleyin. Manyetik bir karıştırıcı kullanarak, gözenekli PLGA NHAP iskelelerini basmak için kullanılacak tek tip bir macun oluşturmak için süspansiyonu oda sıcaklığında 1500 rpm'de 16 saat kuvvetlice karıştırın.

Yazdırıldıktan sonra, herhangi bir çözücüyü tamamen çıkarmak için iskeleleri 48 saat dondurarak kurutun. Ve sonra onları bir saat boyunca yüzde 75 etanol içinde sterilize edin. Daha sonra, nötr, antiseptik malzeme elde etmek için onları bir kez daha lifalyize edin.

Daha sonra, her bir iskeleye dört nokta beş çarpı 10 ila beşte birlik lentiviral parçacıklar ekleyin ve parçacıkların iki saat boyunca 37 santigrat dereceyi koruyarak nemlendirilmiş bir inkübatörde emilmesine izin verin. Artık lentiviral parçacık iskelelerde emildiğine göre, bağlanmamış kalıntıları gidermek için iskeleleri iki mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Yıkanmış iskeleleri sıvı nitrojen içinde dondurun.

Ve bir kez daha lifalyize ettikten sonra, daha ileri çalışmalar için eksi 80 santigrat derecede saklayın. Daha önce dört nokta beş çarpı on ile kaplanmış 3d iskeleleri, bir mililitre tam DMEM ile doldurulmuş iki nokta sıfır mililitre kriyojenik şişelerde yeşil floresan proteini taşıyan beşinci lentiviral parçacıklara aktarın ve beş gün boyunca çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin. Her on iki saatlik inkübasyonda, iskelelerden salınan lentiviral partikülleri içeren besiyerlerinin bir mililitre numunesini toplayın ve bunları bir mililitre taze besiyeri ile değiştirin.

HEK293T hücreleri dönüştürmek için, önce ortamı 12 oyuklu bir plakada kültürlenmiş HEK293T hücrelerden çıkarın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, önceden toplanan ortamdan bir mililitreyi yıkanmış HEK293T hücrelerine ekleyin ve plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede 48 saat inkübe edin. 48 saatlik inkübasyondan sonra, biyoaktif lentiviral partiküllerin sayısını belirlemek için akış sitometrisi ile GFB pozitif HEK293T hücrelerinin sayısını ölçün.

Başlamak için, C57 siyah altı fareyi rastgele üç tedavi grubuna bölün: her biri 14 hayvanın kontrol, PH ve PHp'si. Anestezi uygulanmış bir farenin kafasındaki cildi tıraş edin ve yüzeyi bir iyot tentürü ve ardından yüzde 75 alkol çözeltisi ile dezenfekte edin. Farenin kafasını stereotaktik bir alete yerleştirin ve cildi bir neşterle boyutlandırın ve ardından makas kullanarak bir santimetre doğrusal bir kesim yapın.

Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, yüzeyini ortaya çıkarmak için periosteuumu kraniyal kemikten kazıyın. Daha sonra, kafatasının sol tarafında, bir trephine frez ile dört milimetre çapında kritik boyutta bir kusur oluşturun. İskeleyi kemik defektinin yan tarafına nakledin.

Cerrahi bölgeyi periost ile nazikçe kaplamak için oftalmik forseps kullanın. Daha sonra kesi yapılan her santimetreye üç dikiş atılarak yarayı kapatın. Son olarak, ameliyat sonrası ağrıyı kontrol etmek için analjezik buprenorfin uygulayın ve uyanana kadar vücut ısısını korumak için hayvanı bir ısıtma yastığı üzerinde tutun.

Fare bilincini geri kazandığında, ona yiyecek ve su sağlayın ve deneyin sonuna kadar günlük aktivitesini izleyin. TPEF ve SHG görüntüleme için çoklu foton mikroskobu sistemini monte ettikten sonra, femtosaniye titanyum safir lazeri 860 nanometreye ayarlayın. Yeni oluşan kan damarlarını görselleştirmek için, fareye tuzlu su içinde mililitre dekstran çözeltisi başına 200 mikrolitre 10 miligram intravenöz olarak enjekte edin, daha sonra stereotaktik aleti kullanarak, vücut ısısını 37 santigrat derecede tutmak için anestezi altındaki hayvanı bir ısıtma plakası üzerinde hareketsiz hale getirin.

Dehidrasyonu önlemek için fareye intraperitoneal olarak 200 mikrolitre salin enjekte edin. Son olarak, görüntüleme sırasında yeterli anestezi ve analjezi sağlamak için hayvana yüzde 100 oksijen içinde yüzde üç izofluran karışımı sağlayın. Görüntülemeye başlamak için, 512 x 512 mikrometre örnekleme alanı oluşturmak için bir çift galvo aynayı tarayın.

Ardından, bir NA tek nokta O suya daldırma objektif lensi kullanarak, uyarma ışınını numuneye odaklayın ve geri saçılan TPEF HSG sinyalini toplayın. Görüş alanını, kontrol grubundaki normal kemik alanını ve defektin kenarını kaplayacak şekilde ayarlayın, ancak hayvanı PH veya PHp grubundan görüntülerken yalnızca implante edilmiş iskeleyi kaplayacak şekilde ayarlayın. Ardından, kusurun beş farklı bölgesini tarayın.

İki saatlik bir görüntüleme süresi boyunca her 12 saniyede bir görüntü yığınları elde edin. Burada, hazırlanan malzemenin genel gözenekliliğini gösteren bir mikro-CT görüntüsü ile birlikte 3d baskı tekniği ile hazırlanmış iskelenin bir fotoğrafı sunulmaktadır. İskelenin mikro gözenekli yapısı, 5000 kat büyütmede elde edilen bir SEM görüntüsünde gösterilmektedir.

Gösterildiği gibi, iskelelerden salınan lentiviral partiküller içeren ortamlarla muamele edilen HEK293T hücreleri, yeşil floresan proteinini verimli bir şekilde ifade etti. Akış sitometrisi ile tahmin edildiği gibi, salınan parçacıkların toplam sayısı yaklaşık yüzde 40'a ulaştı. En sağlam salım etkisi, çalışmanın ilk 24 saati içinde gözlemlendi ve zamanla kademeli olarak azaldı, bu da iskeleler üzerine kaplanmış lentiviral partiküllerin biyolojik aktivitelerini 96 saate kadar koruduğunu doğruladı.

Kalvarial kemik defekti içinde oluşan kan damarlarının in vivo analizi, yeni kan damarlarının, farelerin kontrol grubunda tespit edilememesine rağmen, iskele transplantasyonundan sekiz hafta sonra hem PH hem de PHp gruplarında açıkça görülebildiğini gösterdi. Ek olarak, hem PH hem de PHp gruplarında birçok kollajen birikim bölgesi tespit edilirken, sadece PHp grubunda iskelelere dönüşen artan sayıda daha küçük damarlar gözlenebildi ve genel kan damarı alanı önemli ölçüde farklıydı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, herhangi bir artefaktı önlemek için tarama sırasında sabit tutmak için farenin başını hareketsiz hale getirmeyi unutmamak önemlidir. Bu işlemi takiben, derin doku görüntüleri gibi ek veriler sağlamak için fotoakustik görüntüleme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, kemik rejenerasyonu alanındaki araştırmacıların nakillerde anjiyogenezi araştırmalarının önünü açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, gerçek zamanlı olarak 3 boyutlu iskelelerde in vivo plazma oluşumunu ve mikrofoton mikroskobunu nasıl görselleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.