Fenotip ve Fonksiyon Analizi için algılama ve Nadir zenginleştirilmesi antijene özgü B hücreleri

Bu basit ama etkili prosedürün genel amacı, fenotipik ve fonksiyonel analizleri için manyetik nanopartiküller kullanarak insan periferik kanından nadir antijen bağlayıcı B hücrelerini izole etmek ve zenginleştirmektir. Bu yöntem, in-vivo antijen karşılaşmasından önce ve sonra nadir antijen bağlayıcı B hücrelerinin fenotipi ve biyolojisi ile ilgili immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, özellikle bir stiren plaka veya büyük bir boncuk kullanıldığında, geometri ile ilgili sorunları ortadan kaldırmasıdır.

Ve oldukça büyük başlangıç hücre popülasyonlarında nadir hücreleri izole etmek için hücreleri akış sitometrisi ile izole ederken akış hızı ile ilgili sorunları ortadan kaldırır. 30 ila 50 mililitre tam kanı heparinize kan alma tüplerine topladıktan hemen sonra, kanı steril oda sıcaklığında magnezyum ve kalsiyum içermeyen PBS ile 1: 1 oranında karıştırın. Daha sonra, kan karışımını, yavaş tutarlı pipet tetikleme basıncı kullanarak steril 50 mililitrelik konik bir tüpte 10 mililitre oda sıcaklığında yoğunluk gradyan çözeltisi üzerine katmanlayın.

Hücreleri santrifüjleme ile ayırın. Plazma ve trombosit içeren üst tabakayı atın ve mononükleer hücre kabı buffy kaplamasını 50 mililitrelik yeni bir steril tüpe aktarmak için steril bir pipet kullanın. Mononükleer hücrelerin santrifüjleme ile yıkanması için tüpü 50 mililitreye kadar PBS ile doldurun.

Daha sonra, peleti saymak için 10 mililitre taze PBS'de yeniden süspanse edin ve hücreleri buz üzerinde taze PBS'de mililitre başına 1x10^7 hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. Hücreleri manyetik boncuk bağlama için boyamak için, önce 1-2x10^6 hücre alikotunu her floresan telafisi ve uygun şekilde Floresan Eksi Bir kontrolü için beş mililitrelik polistiren tüpe aktarın. Daha sonra, hücre örneğinin geri kalanını santrifüjleme ile toplayın ve peleti steril filtrelenmiş soğuk FACS tamponunda mililitre başına 3-6x10^7 hücreye yeniden süspanse edin.

Hücre çözeltisini buz üzerinde dört FACS tüpüne eşit olarak bölün ve bu dört deneysel numune fraksiyonuna insan Fcgamma reseptörü bloke edici reagant ekleyin. Spesifik olmayan bağlayıcı bloke edici inkübasyonun sonunda, dört numune fraksiyonunun tümündeki hücrelere uygun floresan konjuge hücre yüzeyi boyama antikorlarını ekleyin. Daha sonra, A ve D fraksiyonlarına uygun biyotinile antijeni ekleyin, ardından fraksiyona B'ye yeterli miktarda etiketlenmemiş antijen ekleyin, böylece en az 1x10^6 molar afiniteye sahip reseptörlerin çoğu bloke edilir.

Tüm numuneleri buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, ardından uygun biyotinile antijen ile fraksiyon B'nin 30 dakikalık bir inkübasyonu izleyin. İnkübasyonların sonunda, hücreleri 5x10 ^ 7 hücre başına bir mililitre buz gibi soğuk FACS tamponunda iki kez yıkayın. Ve peletleri karanlıkta buz üzerinde beş dakika boyunca 5x10^7 hücre başına bir mililitre %2 formaldehit içinde yeniden süspanse edin.

Fiksasyondan sonra, hücreleri gösterildiği gibi iki kez daha yıkayın. Ve peletleri 5x10 ^ 7 hücre başına bir mililitre taze buz gibi soğuk FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri bir ila iki mikrogram uygun ikincil Streptavidin Konjuge Antikoru ile karanlıkta 20 dakika boyunca buz üzerinde etiketleyin ve hücreleri iki kez daha yıkayın.

Manyetik nanopartikül bazlı zenginleştirme için, A, B ve C hücre fraksiyonlarını 5x10 ^ 7 hücre başına bir mililitre soğuk Ayırma Tamponunda yeniden süspanse edin ve herhangi bir topaklanmayı ortadan kaldırmak için hücreleri ayrı ayrı 40 mikrolitrelik süzgeçlerden süzün. Daha sonra, floresan boya nanopartiküllerini uygun konsantrasyonda karanlıkta dört santigrat derecede 10 dakika boyunca rotasyonla ekleyin ve numuneleri bir mililitre soğuk ayırma tamponunda iki kez yıkayın. Peletleri 5x10^7 hücre başına bir mililitre soğuk Ayırma Tamponunda yeniden süspanse edin.

Daha sonra, uygun boyuttaki mıknatısları üzerindeki üç manyetik sütunu, her biri üç mililitre Ayırma Tamponu ile dengeleyin ve tüm Ayırma Tamponu hacminin her bir sütundan bir atık kabına geçmesine izin verin. Şimdi her sütunun altına etiketli bir adet 15 mililitrelik konik tüp yerleştirin ve manyetik parçacık etiketli hücreleri ilgili sütunlarına ekleyin. Her bir hücre fraksiyonunun tüm hacmi her bir sütundan geçtiğinde, her sütunun üstüne üç mililitre taze buz gibi soğuk ayırma tamponu ekleyin ve atık suları etiketli tüplerde toplayın.

İkinci yıkama kolonlardan tamamen boşaldıktan sonra, her fraksiyondan negatif olarak seçilmiş hücrelerin tüplerini buz üzerine yerleştirin ve kolonları her fraksiyon için yeni 15 mililitrelik tüplere aktarın. Her sütunu yaklaşık altı mililitre taze Ayırma Tamponu ile doldurun ve manyetik olarak bağlı hücreleri toplamak için tamponu hemen kolonların arasından geçirin. Daha sonra hem pozitif hem de negatif hücre fraksiyonlarını santrifüjleme ile toplayın ve peletleri planlanan aşağı akış analizi için uygun çözelti içinde yeniden süspanse edin.

Bu grafiklerde, on yıldan daha uzun bir süre önce tetanoza karşı en son aşılanmış bir kişiden alınan tetanoz-toksoid reaktif B hücrelerinin sıklığı, bu yöntemin tetanoz-toksoid bağlayıcı hücreleri yaklaşık yedi kat zenginleştirme yeteneğini göstermektedir yaklaşık% 4'lük saflık Kan alımından yaklaşık üç yıl önce aşılanmış bir deneğin hücrelerine 50 kat fazla etiketlenmemiş tetanoz toksoidinin eklenmesi. Biyotinile antijen eklenmeden önce, tetanoz-toksoid bağlanması% 83 oranında azalır ve bu da antijen bağlanmasının özgüllüğünü gösterir. Biyotinile antijen prosedürden çıkarıldığında, B hücrelerinin sadece% 0.2'si hala bağlanır, muhtemelen emicideki bazı tetanoz olmayan antijenlerin bağlanmasını yansıtır.

Bu grafikler, sağlıklı bir deneğin takviye aşılamasından yedi gün sonra alınan bir kan örneğinden alınan tetanoz-toksoide özgü naif B hücrelerinin sıklığının, takviyeden sonra %84'ten %64'e nasıl düştüğünü göstermektedir. Hafıza ve plazmablast popülasyonlarının yüzdesi sırasıyla %16'dan %36'ya ve sıfırdan %40'a yükselir. Ayrıca, sağlıklı bir denekten yedi gün sonra elde edilen bir periferik kan örneğinden elde edilen temsili ELISPOT verileri, izole tetanoz-toksoid bağlayıcı B hücrelerinde gözlenen tetanoz-toksoid antikor salgılayan hücre frekansında dört kat zenginleşmeyi göstermektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik tüm uygun kontrollerle yaklaşık üç ila dört saat içinde tamamlanabilir. Yöntem, ikincil tahlillerle birleştirilebilir, örneğin, hücre kaderi ve işlevinin sonraki çalışmaları için hücrelerin kabul edilen alıcılara aktarılması. Bu videoyu izledikten sonra, uygun kontrolleri kullanarak insan periferik kanından nadir antijen bağlayıcı B hücrelerinin nasıl izole edileceğini ve zenginleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.