Name: Fenotip ve Fonksiyon Analizi için algılama ve Nadir zenginleştirilmesi antijene özgü B hücreleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Öğrenin, manyetik nanopartiküller kullanarak insan periferik kanından nadir antijen bağlayan B hücrelerini izole etme ve zenginleştirme yöntemini. Bu teknik, immünolojide hücre fenotipi ve fonksiyon analizi için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201 ve F30OD021477) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

İnsan PBMC 1. izolasyonu <ol><li> heparinize kan toplama tüpleri kullanarak kan 30-50 ml toplayın. Not: kullanılan kan miktarı ilgi antijene özgü B hücreleri, kandaki özel deneysel söz ve frekansına bağlıdır. Heparin enjekte edilmiş kan hemen işleme ya da ertesi gün işlem oda sıcaklığında gece boyunca yavaşça sallandı edilebilir. işleme gecikmesi zenginleştirme verimliliği üzerinde çok az bir etkiye sahiptir ve canlılığı kaybıyla ilişkilendirilir. </li><li> tam kan 1 karışım: 1 steril oda sıcaklığında magnezyum ve kalsiyum içermeyen fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile. </li><li> 50 ml&#39;lik steril bir konik tüp, oda sıcaklığı yoğunluk gradyan çözeltisi 10 ml. 4 ° C&#39;de karanlıkta açılan yoğunluk gradyanlı şişeleri saklamak fakat kullanmadan önce oda sıcaklığına kadar ısınmaya. </li><li> Mümkünse yavaş ayara pipet silahı ayarlamak ve / veya yavaş çok az, ancak tutarlı, tetik baskı uygulamakiki karıştırmak için dikkatli olmak, yoğunluk gradyanı üstünde seyreltilmiş kan 30-35 ml katman. NOT: sulandırılmış kan ekleyerek tutarlı bir sabit bir akış sağlamak ise 50 ml kenarına pipet ucu yerleştirilmesi konik. </li><li> Fren 20 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüje kapalı. </li><li> Aşağıdaki mononükleer hücre tabakası rahatsız etmemek için dikkatli olmak, plazma ve trombosit içeren üst katman, çıkarın. </li><li> Steril bir pipet kullanarak, tek çekirdekli hücre tabakası (buffy coat) toplanması ve ayrı bir steril 50 ml konik tüp içine yerleştirin. </li><li> 50 ml&#39;lik bir hacme kadar hücre süspansiyonu PBS ekleyin. Fren 20 ° C &#39;de 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı ve 10 ml PBS içinde tekrar süspansiyon pelet hücreleri. Hücreleri saymak ve bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacını kullanarak canlılığı belirler. </li><li> Daha fazla işlem için hazır olana kadar 10 7 hücre / ml ve buz üzerinde yer yeniden süspanse hücre.</li></ol> Hücreler 2 boyanması <ol><li> Her floresan tazminat / varsa, gerekli FMO kontrolü için 1-2 x 10 6 hücreleri çıkarın. fren 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj hücrelerin geri kalanı. </li><li> 3-6 x 10 7 hücre / ml steril filtre, soğuk FACS tampon maddesi (PBS +% 1 sığır serum albümini (BSA) +% 0.01 sodyum azid) içinde süspanse hücreleri (1.5 ml santrifüj tüpüne kaldırmak). FACS tampon soğuk olduğundan emin olun ve boyama işlemi boyunca buz üzerinde tutmak. <ol><li> tahlil optimize dörtte içine hücre popülasyonu (AD) bölün. zenginleştirme / boyanması özgünlüğünü belirlemek için faiz, kullanım fraksiyonları B ve C antijene özgü B hücreleri zenginleştirmek için fraksiyon A kullanın antijen-spesifik hücrelerin sıklığını ve sayısını belirlemek için, ve kullanım fraksiyon D (2.5 aşağıda 2.6 bakınız) unenriched nüfus verim hesaplama sağlamak ve kat-zenginleştirme için. </li></ol></li><li> insan FcyR engelleme yeniden ekleBuz üzerinde fraksiyonlar MS madde Fc reseptörlerine antikorların bağlanma önler. NOT: Uygun koşullar için üreticinin talimatlarına uyun. </li><li> çapraz manyetik nano partiküller ile birleşmiş anti-uzak-kırmızı-flüoresan boya antikorları ile reaksiyona girer fluorochromes dahil için dikkatli olmak karanlıkta buz üzerinde 30 dakika boyunca kısımlar MS ilgi yüzey antijenlerini hücre florokrom-eşlenik antikor ekleyin. Not: Bu IR-yakını, floresan boya, Cy5 Cy5.5 ve Cy7, antikor eşlenikleri. ilave edilir herhangi bir canlılık lekeleri bir sabitleyici kullanımı ile uyumlu olması gerekmektedir. bir ELISPOT, örneğin, FACS kullanarak hücrelerin analiz, ancak antikor salgılayan sıklığını belirlemek niyetinde değilse, antikorlar ile yüzey boyama gereksizdir. </li><li> Testin özelliğini test etmek buz üzerinde 30 dakika için, etiketlenmemiş antijen yeterli miktarda B fraksiyonu inkübe edilmesi, böylece bir afiniteye sahip reseptörlerin çoğunun, en azından10 -6 M engellenir. Not: Genellikle, iyi bir başlangıç konsantrasyonu antijen miktarının 50-100 kat fazla (örneğin, 50-100 uM) altına 2.6 yeterli kabul edilir. etiketlenmemiş antijen Bu şekilde zenginleştirilmiş hücrelerin özgüllük teyit sağlayan aşağıda adım 2.6 ilave edilir biyotinile antijen bağlanma Bu yüksek afinite ile tüm B hücreleri bloke edilmelidir. Bu adım, önceki aşamada 2.4 ile bağlantılı olarak tamamlanabilir. </li><li> 30 dakika boyunca buz üzerinde fraksiyonlar A, B ve D kuluçkalanması biyotinile edilmiş antijen ekleyin. Not: biyotinlenmiş antijenin konsantrasyonu, yeterli algılama ve spesifik olmayan nötr hücreler hücreleri bağlanma ayrılmasını sağlamak için gerekli uygun miktarını belirlemek için titre edilmelidir. Tipik test etmek için iyi bir başlangıç ​​konsantrasyonu 1-5 uM&#39;dir. Not: fraksiyonları A ve D, bu aşama, yukarıda adım 2.4 ile eş zamanlı olarak yapılabilir. B fraksiyonu için, bu adım betw aşama 2.5 (yıkamadan sonra yapılmalıdıreen aşama) gereksizdir. </li><li> Böyle bir streptavidin uzak-kırmızı-floresan boya ve manyetik boncuklar protokolde diğer reaktifler, B hücrelerinin bağlanmasını belirlemek amacıyla Fraksiyon C biyotinile edilmiş antijen sayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de soğuk FACS 5 x 10 7 hücre başına tampon ve santrifüj 1 ml hücre süspansiyonu ile hücreler iki kez yıkanır. </li><li> Son yıkamadan sonra, 5 x 10 7 hücre başına 1 ml% 2 formaldehid konsantre hücre süspansiyonu seyreltilmiş ve 5 dakika boyunca buz üzerinde karanlıkta bekletilir. NOT: Bu noktada hücrelerin tespiti biotinlenmiş antijen prosedürünün geri kalan BCR için bağlı kalmasını sağlar. canlı hücreler için - örneğin ELISPOTs veya evlat transferlerde olduğu gibi aşağı analiz için, sabitleme adımı atlayabilirsiniz. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de iki kez soğuk FACS 5 x 10 7 hücre başına tampon ve santrifüj 1 ml hücreleri yıkayın. 1 ml süspanse soğuk FACS 5 x 10 başına tampon7 hücreleri. </li><li> 1-2 ug streptavidin uzak-kırmızı flüoresan boya / ml ilave edilir ve karanlıkta 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Her bir uygulama için streptavidin miktarını titre edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de 1 ml soğuk FACS 5 x 10 7 hücre başına tampon ve santrifüj ile hücreler iki kez yıkanır. manyetik boncuklar kullanılarak zenginleştirme uğramaz gibi D fraksiyonunun hazırlanması, bu noktada tamamlandı. NOT: Bu örnek, örnek frekansı ve antijene özgü B hücre sayısını belirlemek için kullanılır. Bu zenginleşme elde-zenginleştirme kat verim belirlemek ve kullanılacaktır. </li></ol> 3. Manyetik Nanoparçacık tabanlı Zenginleştirme <ol><li> 40 um&#39;lik bir filtreden soğuk ayırma tamponu (PBS +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA) 5 x 10 7 hücre başına geçmesi 1 ml numune ac hücreleri tekrar sütun tıkayabilecek herhangi bir yığınının ortadan kaldırmak için. </li><li> Anti-Cy5 / Anti-uzak-kırmızı-floresan boya nanopartiküller ekleyin. foEn iyi sonuçları r, nano-taneciklerinin konsantrasyonu her bir kullanım için titre edilmelidir, ama iyi bir başlangıç noktası, 5 x 10 7 hücre / ml başına 50 ul süspansiyondur. 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de karanlıkta döndürün. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de 1 ml soğuk ayırma tamponu ile iki kez yıkanır. 5 x 10 7 hücre başına soğuk ayrılması 1 ml tampon içinde süspanse hücreleri. </li></ol> LS veya LD sütunlar kullanma 4. Manyetik Zenginleştirme <ol><li> Bir manyetik ayırıcı manyetik alanında üç LS veya LD sütunları yerleştirin ve sütunları ıslak ayırma tampon 3 ml ekleyin (sütun tipi en uygun olduğunu belirlemek için ürün açıklamasına bakınız). 3 ml sütununda geçer ve toplandıktan sonra çıkarmanıza izin verir. Not: Manyetik nanopartikül işaretli hücrelerin ayrılması ticari olarak temin edilebilir manyetik ayırma cihazların herhangi biri kullanılarak gerçekleştirilebilir, ancak laboratuar TE içinde LS sütun kullanımı ile en başarılı olmuşturverim, saflık ve zenginleştirme verimliliği rms. </li><li> sütununun altında, negatif seçilen hücreler için etiketlenmiş üç 15 ml konik tüpler &quot;Fraksiyon A / (B) / (C) negatif&quot;, yerleştirin. ilgili kolonuna manyetik parçacık etiketli hücreler ekleyin ve bütün hacim geçmesine izin verir. </li><li> en soğuk ayırma tamponu 3 ml ilave edilir ve bu sütun içinden geçmek ve 2 ml tekrar sağlar. olumsuz seçilen hücreleri toplamak ve buz üzerinde bir kenara koyun. </li><li> manyetik alandan sütunu kaldırmak ve pozitif seçilen hücreler için &quot;Fraksiyon A / (B) / (C) pozitif&quot; etiketli 15 ml konik tüp üstüne yerleştirin. </li><li> sağlanan piston kullanılarak manyetik alana bağlı olan hücreleri toplamak için sütun üzerinden bu hacim dalma hemen ayırma tampon yaklaşık 6 ml üstüne sütun doldurun ve. </li><li> saflığını artırmak için, pozitif seçilen hücreler daha Proce tekrarlayarak, ikinci bir temiz kolonu kullanarak zenginleştirilmiş olabilirdure. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de negatif ve pozitif seçilen kısımlar hem Spin ve arzu edilen nihai hacim içinde askıya. Böyle FACS, ELISPOT veya evlat edinen transferi gibi aşağı analizi ile devam edin. </li></ol>

<ol><li>de Wildt, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+analysis+and+production+of+monoclonal+antibody+fragments+originating+from+single+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells.</a> J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).</li>
<li>Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fractionation+and+arrangement+on+fibers%2C+beads%2C+and+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).</li>
<li>Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new%2C+simple+method+for+the+preparation+of+lymphocytes+bearing+specific+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors.</a> Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).</li>
<li>Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+centrifugation+procedure+for+the+purification+of+sheep+erythrocyte+antigen-binding+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells.</a> J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).</li>
<li>Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+antigen-enriched+b+cells.+I.+Purification+and+response+to+thymus-independent+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens.</a> J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).</li>
<li>Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+of+antigen-specific+B+lymphocytes+by+means+of+immunomagnetic+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles.</a> Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).</li>
<li>Smith, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+anergic+B+cells+in+prediabetic+and+new-onset+type+1+diabetic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients.</a> Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).</li>
<li>Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+specificity+contributes+to+the+outcome+of+diabetes+in+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice.</a> J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).</li>
<li>Woda, M., Mathew, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+labeled+dengue+viruses+as+probes+to+identify+antigen-specific+memory+B+cells+by+multiparametric+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).</li>
<li>Nair, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+fluorescent+labeling+to+identify+memory+B+cells+specific+for+Neisseria+meningitidis+serogroup+B+vaccine+antigens+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immun+Inflamm+Dis%22%5BJournal%5D)">Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo.</a> Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).</li>
<li>Amanna, I. J., Slifka, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+rare+memory+B+cell+populations+by+two+independent+and+complementary+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches.</a> Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).</li>
<li>Scheid, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+identification+of+HIV+gp140+binding+memory+B+cells+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood.</a> Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).</li>
<li>Doucett, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+characterization+of+virus-specific+B+cells+by+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry.</a> Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).</li>
<li>Malkiel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoints+for+Autoreactive+B+Cells+in+Peripheral+Blood+of+Lupus+Patients+Assessed+By+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry.</a> Arthritis Rheumatol. , (2016).</li>
<li>Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+B+cell+populations+mediate+early+and+late+memory+during+an+endogenous+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response.</a> Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).</li>
<li>Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD20+positive+human+B+lymphocytes+separated+with+the+magnetic+cell+sorter+%28MACS%29+can+be+induced+to+proliferation+and+antibody+secretion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro.</a> Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Burada yalıtım ve insan periferal kanından antijen bağlayıcı B hücrelerinin çoğalmasını, gerçekleştirmek için yeni bir metot açıklamaktadır. yöntem, farelere ve dalak ve lenf düğümleri gibi diğer dokuların, kolaylıkla uygulanabilir ve hücre fenotipi ve fonksiyonu (hazırlama yazısı) sonrası zenginleştirme analizi ile uyumludur. Kullanıcı, bu işlemin başarılı olmasını etkileyebilecek değişkenlerin bir dizi vakıf olmalıdır. deneyim ölü hücreler non-spesifik artan arka plana lider, manyetik bonc...

Sınırlandırıcı sulandırma antikor salgılayan hücre ön-madde frekans analizleri, belirli bir antijene reaktif B hücreleri tipik olarak aşı statüsü ve antijen üzerinde mevcut olan epitopları boyutu / sayısına bağlı olarak, normal bir repertuar% 0.05 0.005 arasında bir sıklıkta gerçekleştirilir olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu hücrelerin düşük frekanslı zor bir yabancı antijene karşı, veya otoimmün orijinli bir hastalık sırasında aşağıdaki aşılama veya maruz kalma gibi bağışıklık tepkilerinin, gelişimi sırasında durumundaki değişiklikleri çalışma yapmıştır. Daha önce, araştırmacılar, antijen kaplı kırmızı kan hücresi sıfırlama antijen kaplı plakalar veya sütun adsorbanlar arasında değişen teknikler kullanılarak antijene reaktif B hücrelerinin izole üstlenmiştir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, ayırma hücresi floresans ile aktive. thougBu teknikler antijene reaktif B hücreleri belirlenmesi ve izole başarılı olmuştur h sonuçlar verim, saflık ve ölçeklenebilirlik açısından değişmiştir. Son zamanlarda biz de algılamak ve manyetik nanopartiküller kullanarak nadir B lenfosit alt popülasyonlar zenginleştirmek için yeni bir yöntem geliştirdi. yöntem, geniş bir başlangıç ​​popülasyonlarından nispeten yüksek verim ve saflıkta zenginleştirme sağlar ve antijene yanıtların analizi ile uyumludur. Süspansiyon içinde bulunan hücrelerin popülasyonlardan zenginleştirerek metot, antijene kaplı levha veya gruplarından ve limit hacmi geometrisi ile ilişkili kısıtlamalar ortadan kaldırır. zenginleştirilmiş hücrelerin antijen ve bir flüoresan raportör ile birlikte devam Son olarak, çünkü, bunlar daha FACS sıralama ile saflaştırılabilir. Burada tarif edildiği gibi çeşitli autoi olan deneklerden daha önce periferal kan tetanos toksoid-reaktif B hücrelerinin çalışma ve insan deneklerin aşağıdaki aşılama yaklaşımı, hem de otoantijen-reaktif B hücreleri kullandıkTip 1 diyabetin, Graves hastalığı, ve Hashimoto hastalığı 7 de dahil olmak üzere mmune bozuklukları. yöntem, fare ve insan eşit derecede iyi çalışır ve çeşitli dokularda (hazırlama yazısı) antigen reaktif B hücrelerinin analizi ile uyumludur. Temel biçiminde, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri ilk fenotipik analizi için gerekli olan hücre yüzey antijenlerine karşı antikorlar ile biyotinile edilmiş antijen ile inkübe edilir. Bu etiketleme adım yıkama ve tespit ve hücreleri biyotinlenmiş-antijeni (Şekil 1) tespiti için uzak-kırmızı-floresan boya bağlanmış streptavidin ilave edildi edilir. Daha önceki çalışmalar, benzer bir şekilde antijene spesifik B hücreleri tespit ettik ancak burada antijenler doğrudan florokrom 8, 9, 10, 11 konjüge. bu layık olmasına rağmenyaklaşım streptavidin ile bağlantılı olarak biyotinlenmiş antijenler kullanımı antijenleri, 12, 13, 14 küçük, özellikle daha büyük bir sinyal amplifikasyon (bağlanma ve bağlayıcı hücrelerin dolayısıyla daha iyi farklılaşma) sağlar. Ek göz streptavidin yerine avidin, streptavidin deglikosile olduğundan, spesifik olmayan bağlanma azaltılması kullanılmasıdır. Ayrıca, biz nedeniyle, kuantum verimi (parlaklık) kendi foto stabilitesi ve küçük boyutu (~ 1.3 kD) için florokrom kadar kırmızı-floresan boya kullanın. Potansiyel olarak bir çok antijenik epitopları içerdikleri için protein, fikoeritrin olarak fluorochromes (~ 250 kD) ve alofikosiyanin (~ 105 kD) 15 optimal değildir. Bu uzak-kırmızı-flüoresan boya olarak, tek bir epitop oluşan küçük organik bir floresan boya kullanılması, izole edilmiş hücre popülasyonunun karmaşıklığını azaltır. Hücreler sonra biyotinile-antigen ve uzak-kırmızı-floresan boya-streptavidin adsorbe, anti-uzak-kırmızı-floresan boya-konjuge manyetik nanopartiküller kullanılarak zenginleştirilmiştir. Tek nanopartiküller malzeme akışı sitometre ile tespit edilmez ve bu nedenle ayırma FACS ve alt deneyleri 16 ile saflaştırma öncesinde iyice uzaklaştırılması gerekmez. antijen-spesifik B hücreleri için manyetik seçim zamanı ve debi sitometresinde nadir olaylar sıralama maliyetini ortadan kaldırarak, ilgi nüfusu zenginleştirir. Daha önce, yedi gün tetanos toksoid destekleyici aşılamadan sonra gönüllüden tetanoz toksoid özgü B hücrelerinin çoğalmasını, temsili sonuçlar göstermektedir görebilirsiniz. In vivo uyarım akut Aşağıdaki antijene özgü B hücreleri zenginleştirmek için bu yöntemin yeteneğini göstermek için, örnek olarak, bu özel uygulama seçtik. akış sitometrisi ile birlikte, bu yöntem, zenginleştirici ve ayırt antijene özgü saf, bellek kapasitesine sahip olan veplazmablast B hücreleri ve araştırmacı zamanla sıklığı değişiklikleri izlemenizi sağlar. Buna ek olarak, örneğin, hücreler, zenginleştirme Aşağıdaki antikor salgılayan kabiliyetini muhafaza göstermektedir bir ELISPOT deneyi, başka bir olası alt-deneyi içerir. Bu yöntemin başka bir uygulaması, bir konakçıya zenginleştirilmiş hücrelerinin adoptif transferini içerebilir. Daha önce hücreler izolasyon ve devri sonrasında antijen-spesifik T hücrelerine antijen sunan hücrelerin olarak hareket yeteneğini korumak göstermiştir (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, araya antijene özel bağışıklık tepkisinin anlaşılmasını bilgi yöntemi, bağlanmış olabilir aşağı taraftaki muhtemel bir çok deney mevcuttur. Biz genel verim, saflık, hücre özgünlüğünü belirleyen ve kat-zenginleştirme kontrolleri de dahil olmak üzere, yöntem aşağıda tarif var.

<table><tbody><tr><td>İlgilenilen değişken değişkenin antijeni</td><td></td><td></td><td>En az 100 &mu; g kolayca biyotinilat yapmak için; protein kullanıyorsanız, ELISA tarafından onaylanmış proteini kullanmaya çalışın. Taşıyıcı olmalı&nbsp; protein içermez.</td></tr><tr><td>Etiketleme için biyotin; örn. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td>Biotin, çeşitli uzunluklarda ara parçalar içerenler gibi farklı formülasyonlarda mevcuttur, bu nedenle kullanılan tip araştırmacı</td></tr><tr><td>Streptavidin-Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>S21374</td><td>tarafından belirlenmelidir</td></tr>.<tr><td>Anti-Cy5 / Anti-Alexa Fluor 647 Mikro Boncuklar</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-395</td><td></td></tr><tr><td>LS Sütunları</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS manuel ayırıcılar</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>değişken</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td></td><td></td><td>PBS ile% 2'ye seyreltin; Aşağı akış tahlili canlı hücreler gerektiriyorsa isteğe bağlı</td></tr><tr><td>Kalsiyum ve magnezyum</td><td></td> <td>içermeyen PBS</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Heparinize toplama tüplerinde</td><td></td><td></td><td></td>tam kan</tr><tr><td>FACS tamponu (PBS + %1 BSA + %0.01 sodyum azid)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ayırma tamponu (PBS + %0.5 BSA + 2 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik tüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml konik tüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf tüpleri</td> Yüzey işaretleyici reaktif antikorlar<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Fc Blok, canlı/ölü ayırıcı leke, gerekirse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ELISPOT malzemeleri,</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> gerekirse

fenotip ve fonksiyon analizi için algılama ve nadir zenginleştirilmesi antijene özgü b hücreleri

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Spesifik bir antijenle reaktif olan B hücreleri genellikle lenfositlerin %<0.05'i kadar bir sıklıkta ortaya çıkar. Onlarca yıldır araştırmacılar, fenotipleri ve biyolojileri üzerine yapılan çalışmalar için bu nadir hücreleri izole etmek ve zenginleştirmek için yöntemler aradılar. Yaklaşımlar, kaçınılmaz olarak, B hücrelerinin, sonunda farklılaşmış kızları tarafından salgılanacak olan antikorların özgüllüğünde temsil olan hücre yüzeyi reseptörleri sayesinde doğal antijeni tanıdığı ilkesine dayanmaktadır. Belki de soruna en belirgin yaklaşım, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile birlikte florokrom konjuge antijenlerin kullanılmasını içerir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin faydası, hücre frekansı ve elektronik sıralama ile elde edilebilir analiz ve izolasyon oranı ile sınırlıdır. Büyük başlangıç hücre popülasyonlarından antijen-reaktif B hücrelerinin yüksek verimli zenginleşmesi ile sonuçlanan manyetik nanopartiküller kullanarak nadir antijene özgü B hücrelerini zenginleştirmek için yeni bir yöntem tanımlanmıştır. Bu yöntem, bağışıklamadan sonra veya otoimmünite gelişimi sırasında olduğu gibi, in vivo antijen karşılaşmasından önce ve sonra antijen reaktif hücrelerin fenotipinin ve biyolojisinin daha iyi izlenmesini sağlar.

saflık, verim analizi ve kat zenginleştirme akış sitometri kullanılarak kaçınılmaz olarak streptavidin uzak-kırmızı-floresan boya bağlı değil ama matris içinde sıkışıp kalırlar kirletici hücreleri içeren yukarıda tarif edildiği gibi zenginleştirilmiş popülasyonları. Bu yabancı maddeler FACS sıralama tarafından zenginleştirilmiş nüfus kaldırılabilir. zenginleştirilmiş nüfus saflığını tahmin etmek için, canlı hücreler üzerinde kapı...

Fonksiyonel ve fenotipik analizi için antijene reaktif B hücreleri tespit etmek ve ettirecek bir manyetik nano-tanecikleri kullanır basit ama etkili bir yöntem tarif edilmiştir.

Fenotip ve Fonksiyon Analizi için algılama ve Nadir zenginleştirilmesi antijene özgü B hücreleri

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Bu basit ancak etkili prosedürün genel amacı, fenotipik ve fonksiyonel analizleri için insan periferik kanındaki nadir antijen bağlayıcı B hücrelerini manyetik nanoparçacıklar kullanarak izole etmek ve zenginleştirmektir. Bu yöntem, immünoloji alanında, nadir antijen bağlayıcı B hücrelerinin hem in-vivo antijenle karşılaşma öncesindeki hem de sonrasındaki fenotipi ve biyolojisine ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, özellikle stiren plaka veya büyük boncuk kullanımıyla ilişkili geometri problemlerini ortadan kaldırmasıdır.Bu yöntem, oldukça büyük başlangıç hücre popülasyonlarındaki nadir hücreleri izole etmek için akış sitometrisi kullanıldığında akış hızıyla ilgili ortaya çıkan sorunları ortadan kaldırır. Heparinli kan toplama tüplerine 30 ila 50 mililitre tam kan topladıktan hemen sonra, kanı oda sıcaklığındaki steril, magnezyum ve kalsiyum içermeyen PBS ile 1:1 oranında karıştırın. Ardından, kan karışımını, yavaş ve tutarlı pipet tetikleme basıncı kullanarak, steril 50 mililitrelik konik bir tüp içerisindeki 10 mililitre oda sıcaklığındaki yoğunluk gradyanı çözeltisinin üzerine katman şeklinde ekleyin.Hücreleri santrifüjleme yoluyla ayırın. Plazma ve trombosit içeren üst tabakayı atın ve mononükleer hücre konteyneri buffy coat tabakasını steril bir pipet kullanarak yeni bir steril 50 mililitre tüpe aktarın. Mononükleer hücrelerin santrifüjle yıkanması için tüpü 50 mililitreye kadar PBS ile doldurun.Ardından, sayım için çökeleği 10 mililitre taze PBS içinde yeniden süspande edin ve hücreleri buz üzerinde, taze PBS içinde 1x10^7 hücre/mililitre konsantrasyonda yeniden süspande edin. Manyetik boncuk bağlanması için hücreleri boyamak amacıyla, önce uygun şekilde her bir floresan kompanzasyonu ve Fluorescence Minus One kontrolü için 1-2x10^6 hücrelik alikotları beş mililitrelik polistiren tüplere aktarın. Daha sonra, hücre örneğinin geri kalanını santrifüjle toplayın ve çökeleği steril filtrelenmiş soğuk FACS tamponu içinde 3-6x10^7 hücre/mililitre konsantrasyona getirecek şekilde yeniden süspande edin.Hücre çözeltisini buz üzerinde dört FACS tüpüne eşit miktarda paylaştırın ve bu dört deneysel örnek fraksiyonuna insan Fcgamma reseptör bloklama reaktifi ekleyin. Spesifik olmayan bağlanmayı önleyici bloklama inkübasyonunun sonunda, dört örnek fraksiyonundaki hücrelerin tamamına uygun floresan konjuge hücre yüzeyi boyama antikorlarını ekleyin. Ardından, A ve D fraksiyonlarına uygun biyotinillenmiş antijeni ekleyin; ardından B fraksiyonuna, en az 1x10^6 molar afiniteye sahip reseptörlerin çoğunluğu bloklanacak şekilde yeterli hacimde işaretlenmemiş antijen ekleyin.Tüm örnekleri 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve ardından fraksiyon B'yi uygun biyotinize antijen ile 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonların sonunda, hücreleri 5x10^7 hücre başına bir mililitre buz soğuğunda FACS tamponu ile iki kez yıkayın. Ve peletleri, 5x10^7 hücre başına bir mililitre %2 formaldehit içinde, karanlıkta ve buz üzerinde beş dakika boyunca yeniden süspande edin.Fiksasyon sonrası, hücreleri az önce gösterildiği gibi iki kez daha yıkayın. Ardından, pelletleri her 5x10^7 hücre için bir mililitre taze, buz gibi soğuk FACS tamponu içerisinde yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri uygun sekonder Streptavidin Konjugeli Antikor'un bir ila iki mikrogramı ile buz üzerinde karanlıkta 20 dakika boyunca etiketleyin ve hücreleri iki kez daha yıkayın.Manyetik nanoparçacık tabanlı zenginleştirme için, A, B ve C hücre fraksiyonlarını her 5x10^7 hücre için bir mililitre soğuk Ayırma Tamponu içerisinde yeniden süspande edin ve kümeleri gidermek için hücreleri ayrı 40 µL süzgeçlerden geçirin. Ardından, floresan boyalı nanoparçacıkları uygun konsantrasyonda ekleyerek dört derece santigrat sıcaklıkta, karanlıkta ve rotasyon eşliğinde 10 dakika bekletin ve örnekleri bir mililitre soğuk Ayırma Tamponu ile iki kez yıkayın. Peletleri her 5x10^7 hücre için bir mililitre soğuk Ayırma Tamponu içerisinde yeniden süspande edin.Ardından, üç manyetik kolonu uygun boyutlardaki mıknatısları üzerinde, her birine üç mililitre Separasyon Tamponu ekleyerek dengeleyin ve Separasyon Tamponu'nun tüm hacminin her bir kolondan geçerek atık kabına akmasını sağlayın. Şimdi her bir kolonun altına etiketlenmiş 15 mililitrelik bir konik tüp yerleştirin ve manyetik partikül etiketli hücreleri ilgili kolonlara ekleyin. Her bir hücre fraksiyonunun tüm hacmi ilgili kolondan geçtiğinde, her bir kolonun üst kısmına üç mililitre taze buz gibi soğuk Separasyon Tamponu ekleyin ve süzüntüleri etiketli tüplerde toplayın.İkinci yıkama işlemi kolonlardan tamamen süzüldükten sonra, her fraksiyondan gelen negatif seçimli hücre tüplerini buza yerleştirin ve kolonları her fraksiyon için yeni 15 mililitrelik tüplere aktarın. Her kolonu yaklaşık altı mililitre taze Ayırma Tamponu (Separation Buffer) ile doldurun ve manyetik olarak bağlanan hücreleri toplamak için tamponu hemen kolonlardan geçirin. Ardından, hem pozitif hem de negatif hücre fraksiyonlarını santrifüjleme yoluyla toplayın ve peletleri planlanan sonraki analizler için uygun çözeltide yeniden süspanse edin.Bu grafiklerde, tetanoza karşı son aşısı on yılı aşkın bir süre önce yapılmış bir bireyden alınan tetanoz toksoidine reaktif B hücrelerinin frekansı, bu yöntemin tetanoz toksoidine bağlanan hücreleri yaklaşık %4 saflıkla yaklaşık yedi kat zenginleştirmek için kullanılabilme yeteneğini göstermektedir. Kan alımından yaklaşık üç yıl önce aşılanmış bir denekten alınan hücrelere, işaretlenmemiş tetanoz toksoidinin 50 kat fazlasının eklenmesiyle, biyotinli antijen eklenmeden önce tetanoz toksoidi bağlanması %83 oranında azalmış ve bu da antijen bağlanmasının özgüllüğünü kanıtlamıştır. Biyotinli antijen işlemden çıkarıldığında, B hücrelerinin yalnızca %0,2'si hala bağlanma göstermektedir; bu durum muhtemelen absorbentteki bazı tetanoz dışı antijenlerin bağlanmasını yansıtmaktadır.Bu grafikler, sağlıklı bir denekten hatırlatıcı aşılamadan yedi gün sonra alınan kan örneğindeki tetanos toksoidi-spesifik naive B hücrelerinin frekansının, hatırlatıcı doz sonrası %84'ten %64'e nasıl düştüğünü göstermektedir. Buna karşılık, bellek ve plazmablast popülasyonlarının yüzdesi sırasıyla %16'dan %36'ya ve sıfırdan %40'a yükselmektedir. Ayrıca, sağlıklı bir denekten hatırlatıcı dozdan yedi gün sonra alınan periferik kan örneğine ait temsili ELISPOT verileri, izole edilen tetanos toksoidi-bağlayan B hücrelerinde gözlenen tetanos toksoidi antikor salgılayan hücre frekansındaki dört katlık zenginleşmeyi örneklendirmektedir.Bu teknik uzmanlaşıldığında, tüm uygun kontrollerle birlikte yaklaşık üç ila dört saat içinde tamamlanabilir. Yöntem; örneğin, hücre kaderi ve fonksiyonunun sonraki çalışmaları için hücrelerin benimsenmiş alıcılara aktarılması gibi ikincil analizlerle birleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, uygun kontrolleri kullanarak insan periferik kanından nadir antijen bağlayıcı B hücrelerinin nasıl izole edileceği ve zenginleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

detection-enrichment-rare-antigen-specific-b-cells-for-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu prosedür, tespiti ve izolasyonu stimülasyon üzerine IL-17 aktif salgılar fare Th17 lökositlerin açıklamaktadır.

Canlı Fare IL-17 salgılayan T Hücreler Algılama ve İzolasyonu

Epitopa spesifik T-hücrelerinin alçak frekans popülasyonları izole etmek ve akış sitometrisi ile analiz etmek için bunları MHC tetramerleri ve manyetik mikro-küreler: Bu protokol peptit kullanımı açıklanmıştır. Bu yöntem ilgi endojen T hücre popülasyonlarının doğrudan çalışma...

Peptid: Epitop-spesifik T-hücrelerinin MHC tetramer bazlı Zenginleştirme

Bu video, antikor salgılayan B hücrelerinin, ASC'lerin işlevini değerlendirmek için ELISpot testinin kullanımını göstermektedir. ASC'ler tarafından salgılanan antikorlar, enzim konjuge IgG veya IgM antikorları tarafından tespit edilen zara bağlı poliklonal antikor fragmanları ile etkileşime girer. Her bir oyukta üretilen renkli nokta, B hücrelerinin salgı aktivitesi ile ilişkili olan spesifik antikorun izotipinin varlığını gösterir.

Antikor Salgılayan B Hücrelerinin ELISpot Testi Kullanılarak Fonksiyonel Değerlendirmesi

Tam kan İmmünofenotiplemesi, insan bağışıklık sistemini izlemek için vazgeçilmezdir. Bununla birlikte, gerekli reaktiflerin sayısı ve önceden karıştırılmış kokteyllerdeki spesifik florokromların kararsızlığı, günlük reaktif hazırlığını gerektirir. Burada, boyama antikor kokteylinin yarı otomatik olarak hazırlanmasının, reaktif dağıtımındaki değişkenliği en aza indirerek güvenilir immünofenotipleme oluşturmaya yardımcı olduğunu gösteriyoruz.

İnsan Periferik Kan immünfenotipik Analizi Antikor Kokteyller Hazırlama A Yarı-otomatik Yaklaşım

İnsan periferik kanı, humoral immün yanıtın değerlendirilmesi için yaygın olarak kullanılır. Burada, insan B hücrelerini periferik kandan izole etme, insan B hücrelerini kültürde antikor (Ab) salgılayan B hücrelerine (ASC'ler) ayırma ve bir ELISpot testi ile toplam IgM ve IgG-ASC'leri numaralandırma yöntemleri açıklanmaktadır.

İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesi&#39;nin olarak

Biz insan kanında dolaşan nadir B hücreleri başlayarak insan antikorlar faiz, bir antijen için belirli üretim için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu doğal antikorlar nesil verimli ve hızlı ve elde edilen antikor arasında son derece ilgili antijenleri ayırt edebilirsiniz.

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

Burada bağışıklık fenotipik ve fonksiyonel (hücre içi sitokin indüksiyon) değerlendirmek için bir tek hücreli proteomik yaklaşım tarif değişiklikler periferik tam kan örneklerinde, kitle sitometresi ile analiz.

Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

Antijen spesifik T hücreleri ayırdetmek veya tedaviler nedeniyle onların son derece düşük frekanslı kullanmak zordur. Burada, bu hücreler zenginleştirmek için antijen spesifik T hücrelere bağlayabilirsiniz bir manyetik parçacık geliştirmek için bir protokol sağlar ve daha sonra bunları birkaç genişletmek için hundred-fold karakterizasyonu ve tedavisi için.

Zenginleştirmek ve nadir antijen spesifik T hücreleri Manyetik Nano tanecikleri ile genişletin

BSelex yöntemi tanımlamak ve insan periferik kan mononükleer hücrelerden bireysel antijen özgü antikorlar kurtarmak için tek hücreli PCR ve klonlama ile akış sitometri birleştirir.

Zenginleştirilmiş İnsan Hafızası B Hücre Popülasyonlarından İstenilen Özgülliklerle Antikorların Seçimi ve Geri Kazanımı İçin Tek Hücreli Tarama Yöntemi

Manyetik boncuk bazlı T hücresi zenginleştirmesi ve peptit: majör histouyumluluk kompleksi (MHC) tetramerleri aracılığıyla fare akciğerlerindeki nadir antijene özgü T hücresi popülasyonlarını izole etmek ve tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Fare Akciğerlerinden Nadir Antijene Özgü T Hücrelerinin Peptit ile Tanımlanması: Majör Histouyumluluk Kompleksi Tetramerleri

Öğrenin, manyetik nanopartiküller kullanarak insan periferik kanından nadir antijen bağlayan B hücrelerini izole etme ve zenginleştirme yöntemini. Bu teknik, immünolojide hücre fenotipi ve fonksiyon analizi için güçlü bir araç sunar.

Fenotip ve Fonksiyon Analizi için algılama ve Nadir zenginleştirilmesi antijene özgü B hücreleri

Daha fazla video keşfet