Name: Hastadan türeyen Xenograftlarda Exogenous Cytokinein Sitokinle Transmurgated Stromal Hücre Hattı İle Enjeksiyon Vasıtasıyla İfade Edilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Keşfedin, sitokin-transdüse stromal hücre enjeksiyonu ile hastadan türeyen ksenograft modellerinde ekzojen sitokin üretimini. Bu yöntem, kanser ve hematopoiez araştırmalarında esnek sitokin sunumu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, Hyundai Hope on Wheels Scholar Hope Grant, Patoloji ve İnsan Anatomisi Bölümü, Temel Bilimler Bölümü ve Loma Linda Üniversitesi Tıp Fakültesi Sağlık Eşitsizlikleri ve Moleküler Tıp Merkezi tarafından ve Loma Linda Üniversitesi'nden (KJP) İşbirliğine Dayalı ve Translasyonel Araştırmaları Teşvik Etme Hibesi ile desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

<ol><li>Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+patient-derived+xenograft+models+for+precision+medicine+approaches+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Med%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia.</a> J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).</li>
<li>Parrish, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+Dependence+in+human+B+lymphopoiesis+increases+during+progression+of+ontogeny+from+cord+blood+to+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow.</a> J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).</li>
<li>Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+and+human+IL-7+activate+STAT5+and+induce+proliferation+of+normal+human+pro-B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells.</a> J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).</li>
<li>Milford, T. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/304249946_TSLP_or_IL-7_provide_an_IL-7R_signal_that_is_critical_for_human_B_lymphopoiesis?ev=prf_high">TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis.</a> Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).</li>
<li>Reche, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+thymic+stromal+lymphopoietin+preferentially+stimulates+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells.</a> J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).</li>
<li>Francis, O. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+xenograft+model+to+study+the+role+of+TSLP-induced+CRLF2+signals+in+normal+and+malignant+human+B+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis.</a> Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).</li>
<li>Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+human+hemato-lymphoid-system+mice+by+cytokine+knock-in+gene+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement.</a> Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).</li>
<li>Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+the+functionally+distinct+human+bone+marrow+stromal+cell+lines+HS-5+and+HS-27a%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a.</a> Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).</li>
<li>Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+by+lentiviral+vectors+is+limited+by+nuclear+translocation+and+rescued+by+HIV-1+pol+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences.</a> Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Cockrell, A. S., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+by+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery by lentivirus vectors.</a> Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freezing%2C+thawing%2C+and+packaging+cells+for+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Freezing, thawing, and packaging cells for transport.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. JoVE. , Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5061">http://www.jove.com/science-education/5061</a> (2016).</li>
<li>Tasian, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+STAT5+and+PI3K%2FmTOR+pathway+signaling+occurs+in+human+CRLF2-rearranged+B-precursor+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 120 (4), 833-842 (2012).</li>
<li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), (2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5048">http://www.jove.com/science-education/5048</a> (2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5161">http://www.jove.com/science-education/5161</a> (2016).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Kovacsics, D., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+proteins+by+hydrodynamic+gene+delivery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3023233/">Chapter 15, Creation of &#34;humanized&#34; mice to study human immunity.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li>
<li>Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bone+marrow+derived+murine+dendritic+cells+for+use+in+2-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>Scheeren, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+stromal+lymphopoietin+induces+early+human+B-cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation.</a> Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).</li>
<li>Lee, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+serum+thymic+stromal+lymphopoietin+in+children+with+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis.</a> Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu el yazması, eksojen insan sitokini sentezlemek için PDX&#39;in mühendisliği için basit, hızlı ve nispeten düşük maliyetli bir yöntemi anlatmaktadır. Burada tarif edilen strateji, insan sitokini, TSLP&#39;yi eksprese etmek için transduze edilen bir stromal hücre hattının haftalık intraperitoneal enjeksiyonuna dayanır. Burada açıklanan yöntemleri uygulamadan önce, yüksek sitokin düzeyini (TSLP) ifade etmek üzere tasarlanmış stroma ve benzer şekilde tasarlanmış kontrol stroması üretildi. Burada sunulan protokollerde, st...

Hastadan türeyen ksenograftlar (PDX) &#39;yerli&#39; bir memeli ortamında normal ve malign hematopoietik hücrelerin üretiminin incelenmesi için güçlü bir in vivo modeldir. Çoğu zaman, PDX bağışıklık yetersiz farelere insan hücrelerini enjekte ederek ya da naklederek üretilir. Normal insan hematopoietik kök hücrelerini kullanarak PDX üretilmesi, normal insan kanında ve immün hücre gelişiminde in vivo çalışmalara izin verir. Lösemi veya diğer kanser hücrelerinden üretilen PDX, insan popülasyonunda mevcut olan genetik peyzajlar ve mutasyonlar bağlamında, onkojenik mekanizmaların incelenmesini ve etkili terapileri tanımlamayı mümkün kılar. Sonuç olarak PDX, etkili terapileri tanımlamak için translasyonel biyomedikal araştırmalar için mevcut olan altın standart ve kanser ilerlemesinin mekanizmalarını anlamak için önemli bir araçtır. PDX modelleri, sağlık ayrımlarından arındırılmış hastalıkların araştırılmasına yardımcı olmak için özel bir araçtır.<html> Genetik lezyonlar veya bir hastanın genetik görünümündeki varyasyonların onkogenezise ve tedavi sonucuna önemli ölçüde katkıda bulunduğu herhangi bir hastalık. Fare-insan PDX modelleri mümkündür, çünkü birçok fare sitokinleri, fare içerisindeyken insan hücrelerinin sitokin reseptörlerini harekete geçirirken insan analoglarını yeterince taklit eder. Örneğin, interlökin-7 (IL-7) insan B hücresi gelişimi için kritik bir sinyal sağlar. 2 Bu durumda, fare IL-7, insan IL-7 ile yeterli homologluğa sahiptir ve fare sitokini, insan B hücresi öncüllerinde sinyal yollarını uyarır. Bununla birlikte, diğer sitokinlerin (IL-3, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF), kök hücre faktörü (SCF) arasında timik stromal lenfopoietin (TSLP) 5 , 6 için geçerli değildir, ,Ref &quot;&gt; 7 normal ve habis insan hematopoietik hücrelerinin üretilmesi için önemlidir Fare ve insan sitokinleri düşük homologluk gösterdiğinde fare sitokinleri insan hücreleri üzerinde kendi reseptörlerini aktive etmez Bu engeli aşmak için birtakım stratejiler kullanılmıştır PDX farelerinde insan sitokinlerinin ekspresyonunu mühendislere yapıştırmak için rekombinant insan sitokinlerinin enjeksiyonu, DNA&#39;nın hidrodinamik enjeksiyonu, lentiviral ekspresyon, transjenik ekspresyon ve knockin geni değiştirme 7 Bu rapor, PDX&#39;nin stromal aracılı yollarla insan sitokini üretmesi için bir metodu açıklamaktadır Sitokin verimi ( Şekil 1 ). Burada gösterilen yöntemde, PDX fareleri, insan sitokini, TSLP&#39;yi veya sitokin negatif kontroller olarak görev yapacak şekilde tasarlanmıştır. TSLP&#39;yi ifade eden PDX, yüksek düzeylerde insan TSLP&#39;sini ifade etmek üzere transduced edilen stromal hücrelerin haftalık intraperitoneal enjeksiyonları ile elde edilir.Sitokin-negatif PDX &quot;kontrol&quot; fareleri benzer şekilde tasarlanmıştır; Ancak kontrol stroması bir kontrol vektörüyle dönüştürülür. Bu yöntem, TSLP + stroma enjekte edilen PDX farelerinde insan TSLP&#39;sinin normal fizyolojik seviyelerine ulaşmaktadır. Sitokin negatif stroma alan PDX farelerinde saptanabilir TSLP gözlenmemiştir. Çalışmalarımız için insan stromal hücre hattı HS-27A&#39;yı seçtik çünkü kültürde sağlam bir şekilde büyür ve kokültürlerde izole progenitör hücrelerin çoğalmasını desteklemeyen çok düşük sitokin üretimi gösterir. 8 İnsan TSLP ekspresyonu için, stroma, daha önce tarif edilen omurgadan türetilmiş ileri nesil kendinden inaktif bir lentiviral vektör ile transduced edildi ve transgen ekspresyonunu arttırmak için cPPT / cts elemanı ve post-transkripsiyonel düzenleyici unsuru (WPRE) ağaç talebi hepatitini içerdi. İnsan TSLP geni, bu vektöre, uzatma faktörü -1(EF-1) alfa hızlandırıcıyı sağlam, kurucu ve uzun vadeli ifadeye erişir. Bu insan sitokini ile güçlendirilmiş PDX modelinin mühendisliği 4 ana aşamadan oluşur. Önce transduced stroma, in vitro genişletilir ve kararlı, yüksek seviyeli sitokin üretimi için enzim bağlantılı immunosorbent assay (ELISA) ile değerlendirilir. İkincisi, dönüştürülen stromal hücreler tarafından üretilen insan sitokininin (ve kontrol stromasından sitokin aktivitesinin eksikliği) etkinliği, fosfo-akış sitometrisi kullanılarak doğrulanır. İlgi konusu sitokine duyarlı olduğu bilinen hücre hatları (bu örnekte TSLP), stromal hücre süpernatanı ile inkübe edilir ve sitokine bağlı fosforilasyon için denenir. Üçüncü olarak, farelere dönüştürülen insan stroması enjekte edilir ve daha sonra fare plazması, haftalık bazda insan sitokin seviyeleri için ELISA ile değerlendirilir. Dördüncü olarak insan hematopoietik hücreleri nakledilir ve insan sitokininin in vivo fonksiyonel etkileri bilinen bir hedef üzerinde değerlendirilir ( <emÖr. Hücre popülasyonu). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55384/55384fig1.jpg" /> Şekil 1: Farelerde Eksojen İnsan Sitokini Üretmek üzere Üretilen PDX Modeli. ( 1A ) Tasarım deneyi ve transduced insan stromal hücreleri ( 1B ) elde PDX (hasta türevli ksenograft) fareler üretmek için insan hücreleri (hematopoietik kök hücreler, lösemi hücreleri, vb .) Edinin. ( 2A ) Deneysel çizelgeye göre immün yetersiz farelere insan hücrelerini mühendislik stromasını enjekte edin ve ( 2B ) nakledin. ( 3A-B ) ELISA ile stroma süpernatanı ve fare plazmasında sitokin konsantrasyonlarını izleyin. ( 4 ) İnsan hücrelerini toplayın ve PDX&#39;de bulunan insan sitokininin in vivo fonksiyonel etkilerini değerlendirin. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55384/55384fig1large.jpg" target="_blank">Lütfen buraya tıklayınız</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için. Stromal hücreler yoluyla insan sitokinin verilmesi, PDX farelerinde insan sitokinleri verme / üretme yöntemlerine kıyasla avantaj ve dezavantajlar sunar. 7 Rekombinant insan sitokinin enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında, stroma aracılı doğum genellikle daha ucuzdur (stromal hücre kültürü maliyeti rekombinant sitokin maliyetinden daha düşüktür) ve emek yoğunluğu daha düşüktür (haftada bir kez enjeksiyona karşı haftada birden fazla enjeksiyon). Kısa sitokin yarı ömrü sorunu da hafifletilir çünkü stroma sürekli olarak eksojen sitokin üretir. DNA&#39;nın hidrodinamik enjeksiyonu yoluyla sitokin verilmesi, stroma yoluyla verilmeden daha ucuz olabilir. Bununla birlikte, benzer şekilde geçicidir ve stroma bağlı teslimat için gerekli basit haftalık intraperitoneal enjeksiyona göre daha fazla teknik beceri gerektirebilir. Fare içerisinde Lentiviral gen ekspresyonu daha az travma sağlayabilirSitokin verme yöntemleri; Ancak, elimizde fizyolojik TSLP seviyelerine ulaşılamadı. Ayrıca, bu yöntem emek gerektirir ve sürekli lentiviral vektör üretilmesini gerektirir. Transgenik veya knock-in fareler, sitokinin stabil uzun süreli ekspresyonunu sunar ve bir avantaj sağlayabilecek doku spesifik ekspresyonu için tasarlanabilir. Öte yandan, PDX fareleri için gerekli olan immün yetersiz fare arka planı üzerindeki insan sitokin geninin transgenik ifadesi, modelin değeri belirlenmeden önce büyük bir kaynak yatırımı yapılmasını gerektirir. Dahası, transgenik modeller genellikle sitokin başlatma zamanlamasını veya in vivo sitokin üretim seviyesini değiştirme seçeneği sunmamaktadır. Bunlar, stromal hücre enjeksiyonunun başlatılması için zaman noktasını veya enjekte edilen stromal hücrelerin dozunu değiştirerek stroma bağlı teslimat ile başarılabilir. Stromal-hücre aracılı sitokin verilme metoduBurada detaylı açıklanan normal insan B hücre gelişimi 4 , 6 ve yüksek riskli B hücreli akut lenfoblastik lösemi TSLP rolünü değerlendirmek için PDX geliştirmek için kullanılmıştır. Bu yöntem, TSLP dışındaki insan sitokinleri ile benzer modellerin üretilmesinde kullanılmak üzere alternatif bir sitokin verme yöntemi sağlar. Bu model, bir sitokin transjenik veya sitokine giren PDX modelinin değerinin önemli miktarda zaman ve para yatırımı yapmaya değip değmeyeceğini belirlemenize yardımcı olabilecek ön verileri üretmek için de yararlı olabilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü> Islak laboratuvar reaktifleri&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-25 Nunc Hücre Kültürü İşlem Görmüş EasYFlasks, 7 mL kapasite,&nbsp; 25cm&sup2; kültür alanı</td><td>Thermo Scientific / Fisher</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Falcon Doku Kültürü İşlem Görmüş Şişe, 250 mL kapasiteli, 75 cm& sup2; kültür alanı ve bacalı kapak</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>T-150 Falcon Doku Kültürü İşlem Görmüş Şişe, 600 mL kapasiteli, 150 cm&sup2; Kültür Alanı & bacalı kapak</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serolojik pipetler</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 mL&nbsp; polipropilen konik borular</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüpler</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL polipropilen konik borular</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL kriyojenik şişeler, dıştan dişli</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>4230659</td><td></td></tr><tr><td>1 mL pipet uçları</td><td>Fisher</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>200 & mu; L pipet uçları&nbsp;</td><td>Denville Bilimsel</td><td>P3020-CPS</td><td></td></tr><tr><td>10 & mu; L pipet uçları</td><td>Denville Scientific</td><td>P-1096-CP</td><td></td></tr><tr><td>SFCA Membranlı Steril Tek Kullanımlık Filtre Üniteleri, Nalgene Hızlı Akışlı</td><td>Fisher</td><td>09-740-28D</td><td></td></tr><tr><td>2 NH2SO4&nbsp; </td><td>BioLegend</td><td>423001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Kalikyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS), 1 kez;</td><td>Corning cellgro/ Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>İnsan TSLP ELISA Max Deluxe Set</td><td>BioLegend</td><td>434204</td><td></td></tr><tr><td>Metilen Mavisi Kök Hücre Teknolojileri ile %3 Asetik Asit</td><td></td><td>7060</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi&nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-900-Cl</td><td></td></tr> <tr><td>"Tripsin" 1x% 0.25 Tripsin 2.21 mM EDTA HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>25-053</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7949</td><td></td></tr><tr><td><güçlü> R10 inç hücre kültürü ortamı, toplam hacmin% 'si (565 mL yapar)</güçlü></td><td>-</td><td><güçlü>-</güçlü></td><td><güçlü>Lab Tarifi</güçlü></td></tr><tr><td>RPMI, %88.5 (500 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>10-040-CV&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS, %9.9 (56 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin, %0.99 (5.6 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin, %0.50 (2.8 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol, %0.10 (560 & mikro; L)&nbsp;</td><td>Milletvekili</td><td>190242</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>" R20 inç hücre kültürü ortamı, toplam hacmin% 'si (195 mL yapar) < / güçlü ></td><td></td> <td>-</td> <td><güçlü > Lab Tarifi< / güçlü ></td></tr> <tr><td>& nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; RPMI, %76.84 (150&nbsp; mL)</td><td>yukarıya bakın</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; FBS, %20.49 (40 mL)</td><td>yukarıya bakın</td>, <td>yukarıya</td><td></td> bakın</tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2mM L-glutamin, %1.02 (2 mL)</td><td>yukarıya bakın</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1 mM Na piruvat,% 1.02 (2 mL)</td> <td>yukarıya bakın</td><td>yukarıya</td><td></td> bakın</tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Penisilin-Streptomisin,&nbsp; %0.51 (1 mL)</td><td>yukarıya bakın</td>, <td>yukarıya</td><td></td> bakın</tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2-Merkaptoetanol, %0,10 (0,1 M),&nbsp; % 0.10 (200 & mikro; L)</td> <td>yukarıya bakın</td>, <td>yukarıya</td><td></td> bakın</tr><tr><td><güçlü>" Donma ortamı", toplam hacmin% </güçlü></td><td>-</td><td><güçlü>-</güçlü></td><td><güçlü>Lab Tarifi</güçlü</td></tr><tr><td>>" R10 inç orta, %45</td><td>"R10" tarifine</td> <td>bakın-FBS</td><td></td></tr><tr><td>, %20</td> <td>yukarıya bakın</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, %10</td> <td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>D (-) (+) - Trehaloz dihidrat, %5</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP2687-100</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > </ güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü ></td><td>< güçlü > Katolog Numarası< / güçlü> </td><td>Comments</td></tr><tr><td>Biologics&nbsp; </güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>"HS-27" HS-27A insan stroma hattı</td><td>ATCC</td><td>CRL-2496</td><td></td></tr> <tr><td>"ÇAĞRI-4" MHH-ÇAĞRI-4 hücre hattı, insan B hücresi öncüsü lösemi</td><td>DSMZ</td><td>ACC 337</td><td></td></tr> <tr><td>" NSG fareleri" NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, erkek veya kadın, 6 yaş ve dışı; 8 hafta</td><td>JAX Fareler&nbsp;</td><td># 005557</td><td></td></tr><tr><td>MUTZ-5 hücre hattı, insan B hücresi öncüsü lösemi</td><td>DSMZ</td><td>ACC 490</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan TSLP proteini</td><td>R& D Systems</td><td>1398-TS-010</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catolog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Flow sitomery antikorları (klon)*</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD45 FITC (30F11)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-778</td><td></td></tr><tr><td>CD127 PE (MB15-18C9) (alternatif adı IL-7R&alpha;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-094</td><td></td></tr><tr><td>CD34 APC (8G12)</td><td>BD Biosciences</td><td>340667</td><td></td></tr><tr><td>CD45 PE-Cy7&nbsp; (HI30)</td><td>eBioscience</td><td>25-0459</td><td></td></tr> <tr><td>"FVD" Sabitlenebilir canlılık boyası&nbsp; eFluor 780&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865</td><td></td></tr><tr><td>Ig & kappa; hafif zincir FITC&nbsp; (G20-193)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555791</td><td></td></tr><tr><td>Ig &ampda; hafif zincir FITC (JDC-12)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561379</td><td></td></tr><tr><td>IgD PE (IA6-2)</td><td>BioLegend</td><td>348203</td><td></td></tr><tr><td>IgM PE-CY5 (G20-127)</td><td>BD Biosciences</td><td>551079</td><td></td></tr><tr><td>pSTAT5 PE,&nbsp; fare anti-STAT5 (pY694)</td><td>BD PhosphoFlow</td><td>612567</td><td></td></tr><tr><td>Name </td><td>Company</td><td>Catolog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Diğer malzemeler ve ekipmanlar&nbsp; </güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Canula Trovan ile Hayvan İmplante Edilebilir Nano Transponder</td><td>&nbsp;</td><td>ID-100B (1.25)</td><td></td></tr> <tr><td>EMLA lidokain anestezik krem (hayvan bakım tesisi aracılığıyla öngörü ile elde edilir)</td> <td>reçete</td><td>yazma BD</td><td></td></tr><tr><td>& frac12; cc LO-DOSE U-100 İnsülin Şırınga 28G & frac12; &nbsp;</td><td>BD</td> <td># 329461</td><td></td></tr><tr><td>K 2 EDTA BD ile Mikrotainer Tüpler</td><td>BD & nbsp;</td><td>#365974</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>Alegra X-15R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand Kılcal Tüpler (Heparinize Edilmiş)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analiz Cihazı 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>Fare Pastası</td><td>Kafesi Braintree Scientific, Inc.</td><td>MPC-1</td><td></td></tr><tr><td>Fare Kuyruğu Aydınlatıcı Süzgeç</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MTI STD</td><td></td></tr><tr><td>Tabanca Kabzalı İmplanter Trovan</td><td>&nbsp;</td><td>IM-300 (1.25)</td><td></td></tr> <tr><td>ve mikro; Nicelik&nbsp;</td><td>Bio-Tek Enstrüman A.Ş.</td><td>MQX200</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo akış sitometrisi analiz yazılımı</td><td>FlowJo, LLC</td><td>Sürüm 10</td><td></td></tr><tr><td>*Aksi belirtilmedikçe tüm antikorlar insan karşıtıdır.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hastadan türeyen xenograftlarda exogenous cytokine&#39;in sitokinle transmurgated stromal hücre hattı İle enjeksiyon vasıtasıyla İfade edilmesi

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

Hastadan türeyen ksenograft (PDX) fareler, insan hücrelerini immün yetersiz farelere naklederek üretilir. Bu modeller, normal ve malign hematopoez mekanizmalarını incelemek için önemli bir araçtır ve bir çok malignite için etkili kemoterapileri belirlemek için altın standarttır. PDX modelleri mümkündür, çünkü birçok fare sitokinleri aynı zamanda insan hücreleri üzerinde de etkindir. Bununla birlikte, insan hücrelerinde normal ve malign hematopoez incelemek için kritik olan birçoğu da dahil olmak üzere, tüm sitokinler için durum böyle değildir. İnsan sitokinleri (transjenik ve knock-in modelleri) üretmek üzere mühendislik farelerinin modelin kullanışlılığı gösterilmeden önce önemli harcamalar gerektiren teknikler. Diğer teknikler emek yoğun (rekombinant sitokin veya lentivirüs enjeksiyonu) ve bazı durumlarda yüksek düzeyde teknik uzmanlık gerektirir (DNA&#39;nın hidrodinamik enjeksiyonu). Bu raporda, eksojen insan cy içeren PDX farelerinin üretilmesi için basit bir yöntem açıklanmaktadırTokine (TSLP, timik stromal lenfopoietin) , bu sitokini aşırı ifade etmek için transdude edilen haftalık intraperitoneal stroma enjeksiyonu yoluyla . Bu yöntemin kullanılması, fare içinde dolaşan insan sitokininin fizyolojik seviyelerine erişen in vivo bir sürekli sitokin kaynağı sağlar. İnsan sitokininin plazma seviyeleri, enjekte edilen stromal hücrelerin sayısına göre değişebilir ve sitokin üretimi, deneydeki herhangi bir noktada başlatılabilir. Bu yöntem, aynı şekilde üretilen sitokin-negatif kontrol farelerini de içerir, fakat bir kontrol vektörü ile transdüze edilen intraperitoneal stroma enjeksiyonu yoluyla. Kontrol PDX&#39;si ile karşılaştırıldığında, TSLP&#39;yi eksprese eden PDX&#39;den hasat edilen lösemi hücrelerinin orijinal hasta örneğine benzeyen bir gen ekspresyonu sergilediğini daha önce göstermiştik. Bu yöntemle üretilen sitokin üreten ve sitokin negatif PDX fareleri, birlikte çalıştıklarımızı incelemek için başarılı bir şekilde kullandığımız bir model sistemi sağlar.TSLP&#39;nin normal ve malign hematopoezdeki rolü.

Modele genel bir bakış Şekil 1&#39;de gösterilmektedir . Sitokin üreten (TSLP + stroma) ve kontrol stroması elde edildiğinde kültürde genleşirler. Farelere stroma enjeksiyonundan önce, stromal hücre yüzer maddesi, sitokin üretimini doğrulamak için ELISA ile değerlendirilir ( Şekil 2 ) ve stroma tarafından üretilen sitokinin aktivitesini doğrulamak için fosfo-akış sitometresi (Protokol 3) kullanılır. Hücreler pasajlandığında, konfluent stromal hücre kültü...

Burada, sitokin ile transdüksiyona sokulmuş bir stromal hücre hattının haftalık intraperitoneal enjeksiyonu yoluyla, hastadan türetilen ksenograft (PDX) farelerde eksojen sitokinin üretilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, PDX&#39;in kullanımını genişletir ve bir çok PDX modelinde geçici veya sürekli dış kaynaklı sitokin verme seçeneği sunar.

Hastadan türeyen Xenograftlarda Exogenous Cytokine&#39;in Sitokinle Transmurgated Stromal Hücre Hattı İle Enjeksiyon Vasıtasıyla İfade Edilmesi

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying ...

Bu prosedürün genel amacı, dolaşımında insan sitokinleri bulunan xenograft fareler üretmektir. Bu yöntem, kanser ve hematopoez alanlarındaki "Belirli bir sitokinin normal ve malign lenfosit gelişimindeki rolü nedir?" gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların xenograft hayvanlarındaki eksojen sitokin dolaşım konsantrasyonlarını deneylerinin ihtiyaçlarına göre ayarlayabilmeleridir.Bu durum, yeni ve pahalı transgenik fare hatları üretme gereksinimini ortadan kaldırır. Bu teknik, kliniklerde kullanılanlara benzer şekilde antikanser ilaçlarını test etmek için bu preklinik modelin kullanılabilecek olması nedeniyle, yeni kanser tedavilerini araştırmak için faydalı olacaktır. Bu yöntem normal hematopoez hakkında bilgi sağlayabilse de, lösemi gibi spesifik hastalıkların incelenmesinde de kullanılabilir.Bu fikri ilk kez, normal ve malign insan B hücresi üretiminde TSLP sitokininin rolünü değerlendirmek için bir in vivo modele ihtiyaç duyduğumuzda geliştirdim. İşleme, taze çözülmüş kontrol boş vektör transduksiyonlu stromayı, sitokin üreten hücrelerle birlikte ayrı T25 flasklarda beş mililitre R-10 medyumuna ekerek başlayın. Kültürleri

expression-exogenous-cytokine-patient-derived-xenografts-via

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bryostatin 1/Ionomycin Yoluyla Tümör-reaktif T hücrelerinin ex vivo Genişleme ve Ortak Gama Zinciri Sitokinler Formülasyon

Mürin kemik iliği nakli insanlarda graft-versus-host hastalığı yöneten immünolojik mekanizmalarla çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. T hücre trafiğini modellerini izlemek için...

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Bu makale, T hücresinde interferon-gama veya IFN-gama ve tümör nekroz faktörü-alfa veya TNF-alfa gibi sitokinlerin hücre içi konsantrasyonunu artırmak için ex vivo T hücre stimülasyonu tekniğini açıklamaktadır. Bu sitokinler etkili bir anti-tümör yanıtına aracılık eder ve tümörde terapötik bir role sahip olabilir.

Pankreas Tümöründe Ex Vivo T Hücre Stimülasyonu: T Hücrelerinde Sitokin Üretimini Artırmak İçin Bir Yöntem

Bu video, lösemi hücrelerinde proteinlerin stromal sitokin kaynaklı hücre içi fosforilasyonunun değerlendirmesini göstermektedir. Bu hücre içi fosforile proteinler, fosfo-akış sitometrisi tekniği kullanılarak ölçülür.

Stromal Sitokin ile İndüklenen Hücre İçi Protein Fosforilasyonunun Fosfo-Flow Sitometri Kullanılarak Değerlendirilmesi

Burada küçük hücreli dışı akciğer kanseri çalışma için zaman ve maliyet azaltma mankenlik minimal invaziv syngeneic orthotopic nakli manken fare akciğer adenokarsinom hücre açıklayın.

Orthotopic nakli PD-L1 ifade çalışmaya Syngeneic akciğer adenokarsinom hücre

Burada, bir xenogeneic Graft-versus-Host hastalığı (xenoGVHD) modelinde hastalığı teşvik etmek ve puan vermek için bir protokol sunuyoruz. xenoGVHD, insan T hücrelerinin bağışıklık bastırılmasını incelemek için bir in vivo modeli sağlar. Ayrıca, immunobastırma ölçmek için bir araç olarak dijital PCR ile dokularda insan T hücrelerinin nasıl algılanmasını açıklar.

Bir Xenogeneic Murine modelinde Graft-versus-Host hastalığının indüksiyon ve skorlama ve dijital PCR kullanarak fare dokularında ınsan T hücrelerinin ölçümü

Greft-versus-host hastalığı allojenik kemik iliği transplantasyonu sonrası önemli bir komplikasyondur. Dendritik hücreler greft-versus-host hastalığının patogenezinde kritik bir rol oynarlar. Bu makalede, dendritik hücrelerin greft-versus-host hastalığı nın gelişimindeki rolünü ve greft-versus-lösemi etkisinin araştırılması için yeni bir kemik iliği transplantasyon platformu açıklanmaktadır.

Kemik İliği Transplantasyon Platformu Greft-versus-Host Hastalığında Dendritik Hücrelerin Rolünü Araştırmak Için

Bu çalışmada embriyonik kök hücrelerden immün uyarıcı granülosit makrofaj kolonisi uyarıcı faktörler taşıyan ekzozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziküllerin izole edilmesine yönelik bir yöntem açıklanmaktadır.

Embriyonik Kök Hücrelerden Granülosit-Makrofaj Kolonisi Uyarıcı Faktör Taşıyan EkzozomLa Zenginleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

Burada periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyon ve genleşmesini gerçekleştirmek için bir protokol sunmaktayız- periferik kan mononükleer hücrelerden türetilmiş sitokin kaynaklı CD3+CD56+ öldürücü hücreler ve in vitro tanı akış sitometri sistemi kullanarak hematolojik ve katı kanser hücrelerine karşı sitotoksisite etkilerini göstermek.

Kanser Tedavisi için Sitotoksik Sitokin Kaynaklı Katil T Hücrelerinin İzolasyon ve Genişlemesi

Bu protokol ortotopik pankreas tümörlerinin cerrahi nesil ve taze izole mürin pankreas tümörlerinin hızlı sindirim açıklar. Sindirimden sonra, canlı bağışıklık hücresi popülasyonları daha fazla downstream analizi için kullanılabilir, akış sitometri ile hücre içi sitokin tespiti için T hücrelerinin ex vivo stimülasyon dahil.

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

Mevcut protokol, insan derisinin obez olmayan diyabetik (NOD)-scid interlökin-2 gama zinciri reseptörü (NSG) farelere nasıl aşılanacağını açıklamaktadır. Nakil için insan derisinin hazırlanması, nakil için farelerin hazırlanması, bölünmüş kalınlıkta insan derisinin nakli ve nakil sonrası iyileşme prosedürünün ayrıntılı bir açıklaması raporda yer almaktadır.

İnsan Bağışıklık Tepkilerini In Vivo'da Manipüle Etmek için Ksenograft Cilt Modeli

Keşfedin, sitokin-transdüse stromal hücre enjeksiyonu ile hastadan türeyen ksenograft modellerinde ekzojen sitokin üretimini. Bu yöntem, kanser ve hematopoiez araştırmalarında esnek sitokin sunumu sağlar.

Hastadan türeyen Xenograftlarda Exogenous Cytokinein Sitokinle Transmurgated Stromal Hücre Hattı İle Enjeksiyon Vasıtasıyla İfade Edilmesi (Video) | JoVE Journal

Hastadan türeyen Xenograftlarda Exogenous Cytokine'in Sitokinle Transmurgated Stromal Hücre Hattı İle Enjeksiyon Vasıtasıyla İfade Edilmesi

Daha fazla video keşfet