Name: Aβ mutlak Niceleme 1-42 BOS bir kitle Spektrometrik Referans Ölçüm Prosedürü kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Keşfedin Aβ1-42 mutlak nicelendirmesi için katı faz ekstraksiyonu ve LC-MS/MS kullanarak insan beyin omurilik sıvısında standart ölçüm prosedürü. Bu yöntem, Alzheimer hastalığı biyobelirteci analizlerini uyumlaştırır ve ilaç geliştirme araştırmalarını destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, aşağıdaki bileşime sahip olan Uluslararası Klinik Kimya Federasyonu BOS Proteinleri Çalışma Grubu adına gerçekleştirilmiştir: Kaj Blennow (Başkan) ve Henrik Zetterberg, Göteborg Üniversitesi, İsveç; Les Shaw ve Magdalena Korecka, Philadelphia Üniversitesi, PA, ABD; Ingrid Zegers, Referans Malzemeleri ve Ölçümleri Enstitüsü, Geel, Belçika; Piotr Lewczuk, Universitätsklinikum Erlangen, Almanya; ve Rand Jenkins, PPD Biyoanalitik Laboratuvarı, Richmond, VA, ABD; Randall Bateman, Washington Üniversitesi, MO, ABD; ve H Vanderstichele, Innogenetics NV, Ghent, Belçika. Bu çalışma aynı zamanda, Alzheimer Derneği Tıbbi ve Bilimsel İlişkiler Kıdemli Direktörü Maria C. Carrillo tarafından yönetilen Biyobelirteç Standardizasyonu CSF Referans Yöntemleri Çalışma Grubu için Küresel Konsorsiyumun bir parçasıydı. Çalışma İsveç Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir (hibeler #14002, #521-2011-4709 ve #2013-2546); Knut ve Alice Wallenberg Vakfı; Demensförbundet; ve Emil ve Wera Cornell'in, Aina Wallström ve Mary-Ann Sjöblom'un, Gun ve Bertil Stohne'nin, Magnus Bergvall'ın ve Gamla Tjänarinnor'un Vakıfları.

NOT: Bu protokol, başlangıç ​​malzemesi olarak, her Aβ peptidi için 50 ug / ml bir konsantrasyonda en az 50 uL hacimde, gerektirir. Aβ peptidler, deiyonize su içinde% 20 asetonitril (ACN) ve% 4, konsantre amonyak çözeltisi (hac / hac) içinde çözülmüş ve 80 ° C &#39;de muhafaza edilmesi gerekir. Dikkat: güvenlik bilgisi için Tablo 1&#39;e bakınız. Çözümler 1. hazırlanması <ol><li> ACN 20 ml deiyonize su içinde konsantre edilmiş amonyak 4 mL (~% 25) seyreltilmesi ile% 20 ACN ve% 4, 100 ml deiyonize edilmiş su (hacim / hacim) konsantre amonyak çözeltisi hazırlayın. iyonu giderilmiş su ile 100 mL nihai hacim ayarlayın. her gün taze olun. </li><li> 50 mL&#39;lik bir son hacme kadar iyonu giderilmiş su içinde guanidin-hidroklorür 26.08 g çözülmesiyle 5 M guanidin-hidroklorid 50 mL hazırlayın. 20 ° C&#39;de saklayın ve taze Aylık&#39;ı yapmak. </li><li> (Deiyonize su içinde% 4 fosforik asit 200 mL Hazırlama V /h) deiyonize su içinde konsantre edilmiş fosforik asit (~% 85) 9.4 ml seyreltilmesiyle. iyonu giderilmiş su ile 200 mL nihai hacim ayarlayın. Buzdolabında saklayın ve taze haftalık yapmak. </li><li> ACN, 37.5 mL deiyonize su içinde konsantre edilmiş amonyak 5 mL (~% 25) seyreltilmesi ile deiyonize su içinde 50% 75 ACN mL ve% 10 konsantre edilmiş amonyak çözeltisi (hac / hac) hazırlayın. iyonu giderilmiş su ile 50 ml nihai hacim ayarlayın. her gün taze olun. </li><li> Rutin klinik analizden de tanımlanan artık örneklerden elde edilen kalibratör, insan CSF en az 2.5 mL çözülme. </li><li> 150 mM Na, 3.0 mM K, 1.4 mM Ca, 0.8 mM Mg, 1.0 mM p ve deiyonize su içinde 155 mM CI ihtiva eden suni CSF hazırlamak ve 4 mg / mL&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar sığır serum albümini ekleyin. Sadece 1 ml gelecekte kullanılmak üzere kısım bunu, ve mağaza, analiz başına gerekli, ama büyük hacimli hazırlamak olduğunu. </li></ol> Kalibratörlerimizden 2. Hazırlık <ol><li> 4 ug 0.5 mL hazırlayın / ml 10.5 mL&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 0.46 mL / 15 mL NAβ 142 50 ug 40 uL eklenmesiyle 5 NAβ 1-42 peptid. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır. </li><li> 2 mL mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 1.95 mL 4 ug / ml 15 NAβ 142 50 uL eklenmesiyle, 100 ng / ml 15 NAβ 1-42 peptid 2 mL hazırlayın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır. </li><li> Tablo 2&#39;de belirtilen her bir çözelti miktarı karıştırılarak altı kalibratör solüsyonları (AF) hazırlayın. 0.5, 1.5, ve 2 mL mikrosantrifüj tüpleri kullanın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır. </li><li> karşılık gelen kalibrasyon çözümleri ve 1 dakika boyunca bir vorteks karıştırıcıda Tablo 3. Karışımı uygun olarak insan CSF eklenerek 0.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde (çift olarak) son kalibratörleri hazırlayın. </li></ol> Dahili standardın 3. hazırlanması <ol><li> 2 mL mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 1.968 mL / 13 mL CAβ 142 50 ug 32 uL eklenmesiyle / ml 13 CAβ 1-42 peptid 0.8 ug 2 mL hazırlayın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır. </li><li> 5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 4.9 ml 0.8 ug / ml 0.1 ml ilave edilerek 16 ng / ml 13 CAβ 1-42 peptid 5 mL hazırlayın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır. </li></ol> Yanıt Faktörü Numunenin 4. hazırlanması Not: yanıt faktörü (RF) belirlenmesi kalibrasyon (15 NAβ 1-42) için kullanılan işaretli peptidin konsantrasyonunu belirlemek için gerçekleştirilir. Bu yerli Aβ 1-42 peptid konsantrasyonu amino asit analizi (AAA) ile tespit edilmiştir gerektirir. Bu durumda, ses ve yerli Aβ 1-42 peptid alikotları konsantrasyonuAAA gereklerini yerine getirmek gerekir. <ol><li> 0.5 mL&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 0.46 mL / mL nativ Aβ 1-42 50 ug 40 uL eklenmesiyle (etiketlenmemiş) 4 ug / mL nativ Aβ 1-42 0.5 mL hazırlayın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır. </li><li> % 20 1.96 mi, 4 ug / mL nativ Aβ 1-42 ve 4 ug 20 ul / ml 15 NAβ 1-42 20 uL eklenmesiyle yerli 15 NAβ 1-42 bir 2 mL 40 ng / ml karışımı hazırlayın ACN ve% 4 2 mL mikrosantrifüj tüpü içinde amonyak konsantre edildi. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır. </li><li> 0.5 mL mikrosantrifüj tüpü içinde suni CSF 0.38 mL 40 ng / ml karışımı 20 uL ekleyin. çiftleri hazırlayın ve 1 dakika boyunca bir vorteks karıştırıcıda karıştırılır. </li></ol> 5. Numune Hazırlama NOT: örnekleri çözülme rulo üzerinde oda sıcaklığında ölçülecek. <ol><li>Şekil 1&#39;e göre, bir 1 ml protein 96 derin oyuklu plakaya her kalibratör, yanıt faktörü ve (kullanıldığı takdirde kalite kontrol [QC] örnekleri dahil) bilinmeyen numunenin 0.18 mL ekleyin (tam bir plaka varsayılarak kullanılır). örnekleri eklemeyi unutmayın, ya da kuyu dibine, yakın olun. </li><li> Her iyi (yani, kalibratörler, tepki faktörleri, QCS ve bilinmeyenler) iç standardın 20 uL ekleyin; o pipet batış olmadan numunenin yüzeyine iyice yakın tarafında damla serbest bırakmak için önemlidir. </li><li> Her bir oyuğa 0.2 ml 5 M guanidin-hidroklorür ekleyin. </li><li> bir mikro çalkalayıcı örnek plakasını ve 1100 rpm&#39;de 45 dakika süre ile numuneler karıştırın. Optimal frekans enstrümantasyon bağlı olarak farklılık olabilir. Mikserin frekans ve genliği ayarlayın çözümler iyice karıştırılır ve iç standart veya CSF hiçbir damla kuyuların tarafında karışmamış bırakılır böylece. </li><li> % 4 fosforik asit 0.2 mL eklemeher oyuğa. Vortex kısaca karıştırın. </li></ol> 6. Katı Faz Ekstraksiyon Not: Tüm yıkama, yükleme ve elüsyon adımlarda, çözelti ilave edildikten sonra mümkün olan en düşük vakum uygulanır ve yük veya çözelti elüt edilmesi için gerektiği şekilde yavaş yavaş artar. Her yükleme ve elüsyon adım arasındaki vakum devre dışı bırakın. <ol><li> karma modunda atıklar için bir rezervuar tepsi koyun, ekstraksiyon plakası manifold bölmesi katyon-değişim, 96-çukurlu bir katı faz ekstraksiyonu (SPE) plaka. </li><li> Her bir oyuğa 0.2 ml metanol eklenerek SPE sorbent hale getirin. </li><li> her kuyuya% 4 fosforik asit 0.2 ml ilave edilerek sorbent dengelenmesi. </li><li> SPE plakasına derin kuyu plaka tüm örnekleri (her kuyuda yaklaşık 0.62 ml) aktarın. SPE plakasına derin kuyu plaka örnekleri aktarırken sekiz kanallı pipet kullanın; Numuneler, bir intern içeren, çünkü tüm örneklerin tamamı veya eşit hacimlerde aktarmak için önemli değildirdeğişimleri telafi edecek al standardı. </li><li> Numuneler her kuyuya% 4 fosforik asit 0.2 ml ilave edilerek üzerinden geçtikten sonra sorbent yıkayın. </li><li> yıkayıcı çözücü sorbentten elüt sonra, bir toplama plakası ve tüpler haznesi tepsisini değiştirin. </li><li> iki kez% 75 ACN /% 10 konsantre amonyak 50 uL eklenmesiyle sorbentten örnek Zehir, ve bu çözelti, sorbent geçmesi için çok düşük bir vakum gerektirdiğini not edin. her ilave arasında vakum devre dışı bırakmak için unutmayın. <ol><li> İSTEĞE BAĞLI: toplama plakası veya tüpleri Seal ve -80 ° C&#39;de onları dondurmak. 6.8.2 adıma geçmeden önce toplama plakası veya tüplerden contayı sökün. </li><li> (Isı uygulamadan) vakum santrifüj kullanılarak eluatları Kuru; Bu vakum santrifüj bağlı olarak birkaç saat birinden alabilir. </li><li> kapları mühür ve -80 ° C&#39;de onları dondurmak. </li></ol></li></ol> 7. Sıvı Chromatografisi <ol><li> Ve iğne yıkama (% 50 ACN (ACN [hacim / hacim]% 4, deiyonize su ve% 0.1 konsantre edilmiş amonyak), B (iyonu giderilmiş su [hacim / hacim]% 5 ACN ile% 0.3 konsantre edilmiş amonyak), mobil faz A Hazırlama ve% 4, deiyonize su içinde amonyak konsantre edildi: [hacim / hacim]). <ol><li> Mobil faz A, 500 ml ACN 25 mL deiyonize su konsantre amonyak 1.5 ml. iyonu giderilmiş su ile 500 mL nihai hacim ayarlayın. </li><li> mobil faz B, 500 ml konsantre amonyak 500 uL ACN iyondan arındırılmış 25 ml su ilave edin. ACN ile 500 mL son ses seviyesini ayarlayın. </li><li> ACN, 120 ml deiyonize su, konsantre amonyak 10 ml ilave iğne yıkama 250 mL hazırlayın. deiyonize su ile 250 mL son ses seviyesini ayarlayın. </li><li> LC sistemi kullanmadan önce 20 dakika süreyle sonikasyon banyosunda açık mobil fazlar A ve B iğne yıkama şişeleri koymak </li></ol></li><li> 25 uL konsantrasyon% ACN% 20 ve 4 ile her bir örnek çözülürted amonyak çözeltisi, 20 dakika süre ile bir çalkalama üzerine yerleştirin ve. örneklerin aşağı santrifüj ve alıcısı içinde koyun (7 ° C&#39;de tutmak). </li><li> 50 ° C &#39;de muhafaza edilen bir 1 x 250 ila 2 mm polistiren-divinilbenzen (ters faz) monolitik kolon üzerinde örneğin 20 ul enjekte edilir. <ol><li> 0.3 mL / dakika bir akış oranı ile Tablo 4&#39;te gösterilmiştir LC gradyanı kullanın. kütle spektrometresi kirlenmesini azaltmak için yönlendirme vanası kullanılarak (post-sütun) atık ilk iki ve son beş dakika yönlendir. </li></ol></li></ol> 8. Kitle spektrometrik analiz NOT: Bu parametreler aheated elektrosprey iyonizasyon kaynağı ile teçhiz edilmiş bir dört kutuplu-Orbitrap hibrid kütle spektrometresi kullanıldı. <ol><li> Tablo 5&#39;e uygun iyon kaynağı parametrelerini ayarlar. </li><li> (Yerli Aβ 1-42 4+ şarj durumlarını izole etmek için 1,129.48 kütle cinsinden MS cihazı ayarlayın2,5 m / z yalıtım genişliği kuadruple kitle analizatöründe için şarj oranı [m / z]), 1-42 15 NAβ (1,143.00 m / z), ve 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z). </li><li> 17.0 normalleştirilmiş çarpışma enerjisi (NCE) ile çarpışma hücresinde izole peptidler parçalara. (Örneğin, bir üçlü dört MS gibi araçlarla diğer türleri, kullanımı ve özellikle de) da aynı türde Bu, her enstrüman için ayarlanmış olması gerekebilir. </li><li> 2 x 10 5 ücretleri otomatik kazanç kontrol hedefine ve 250 ms maksimum enjeksiyon süresi ile 17.500 çözünürlüğe sahip fragmanı spektrumları kaydedin. </li></ol> 9. Veri İşleme <ol><li> Her peptit için kromatografik alanları hesaplamak için Tablo 6&#39;da (± 250 mili kütle birimlik [mmu] kütle toleransla) Ürün iyonlarının toplamı kullanın. iyon türleri ve sayıları yalnızca yerel Aβ için gösterilen unutmayın <sub&gt; 1-42 ürün iyonları, bu 15 NAβ 1-42 ve 13 CAβ 1-42 için aynı olduğundan. </li><li> Yerel Aβ 1-42 eğri altında kalan alan 15 NAβ 1-42 eğrisi (kromatografik tepe) altındaki alanı bölünmesiyle iki farklı yanıt faktörü numunelerin ortalama yanıt faktörünü belirleyin. </li><li> Adım 9.2 hesaplanan tepki faktörü ile çarpılarak kalibrasyon için kullanılan 15 NAβ 1-42 konsantrasyonu ayarlayın. </li><li> Konsantrasyonuna karşı kalibratör iki grup 13 CAβ 1-42 kadar NAβ 1-42, 15 alan oranları işaretlenmesiyle bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak. </li><li> lineer regresyon kullanılarak kalibrasyon eğrisinin eğimini ve kesişme hesaplayın. </li><li> Un iç standart (CAβ 1-42 13) yerli Aβ 1-42 alanı oranını hesaplamakBilinen örnekler. </li><li> Adım 9.5 &#39;de elde edilen eğim ve kesişme kullanarak kalibrasyon eğrisinden bilinmeyen örneklerinin konsantrasyonunu tahmin. </li></ol>

<ol><li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20107219">Alzheimer's disease.</a> N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+neuropathology+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurol+Scand+Suppl%22%5BJournal%5D)">Evolution of the neuropathology of Alzheimer's disease.</a> Acta Neurol Scand Suppl. 165, 3-12 (1996).</li>
<li>Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16876668">Alzheimer's disease.</a> Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).</li>
<li>Dubois, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+research+diagnostic+criteria+for+Alzheimer%27s+disease%3A+the+IWG-2+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria.</a> Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).</li>
<li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li>
<li>Buchhave, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22213792">Cerebrospinal fluid levels of beta-amyloid 1-42, but not of tau, are fully changed already 5 to 10 years before the onset of Alzheimer dementia.</a> Arch Gen Psychiatry. 69 (1), 98-106 (2012).</li>
<li>Olsson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+and+blood+biomarkers+for+the+diagnosis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Neurology. 15 (7), 673-684 (2016).</li>
<li>Bjerke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+influencing+amyloid+Beta+concentration+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Confounding factors influencing amyloid Beta concentration in cerebrospinal fluid.</a> Int J Alzheimers Dis. , (2010).</li>
<li>Dumurgier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersite+variability+of+CSF+Alzheimer%27s+disease+biomarkers+in+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Dement%22%5BJournal%5D)">Intersite variability of CSF Alzheimer's disease biomarkers in clinical setting.</a> Alzheimers Dement. 9 (4), 406-413 (2013).</li>
<li>Mattsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+biomarker+variability+in+the+Alzheimer%27s+Association+quality+control+program%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Dement%22%5BJournal%5D)">CSF biomarker variability in the Alzheimer's Association quality control program.</a> Alzheimers Dement. 9 (3), 251-261 (2013).</li>
<li>Kang, J. H., Korecka, M., Toledo, J. B., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23519967">Clinical Utility and Analytical Challenges in Measurement of Cerebrospinal Fluid Amyloid-beta1-42 and tau Proteins as Alzheimer Disease Biomarkers.</a> Clin Chem. 59 (6), 903-916 (2013).</li>
<li>Mattsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+measurement+procedures+for+Alzheimer%27s+disease+cerebrospinal+fluid+biomarkers%3A+definitions+and+approaches+with+focus+on+amyloid+beta42%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">Reference measurement procedures for Alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers: definitions and approaches with focus on amyloid beta42.</a> Biomark Med. 6 (4), 409-417 (2012).</li>
<li>Ahmadkhaniha, R., Shafiee, A., Rastkari, N., Kobarfard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+of+endogenous+androgenic+steroids+in+cattle%27s+meat+by+gas+chromatography+mass+spectrometry+using+a+surrogate+analyte+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification of endogenous androgenic steroids in cattle's meat by gas chromatography mass spectrometry using a surrogate analyte approach.</a> Anal Chim Acta. 631 (1), 80-86 (2009).</li>
<li>Jemal, M., Schuster, A., Whigan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry+methods+for+quantitation+of+mevalonic+acid+in+human+plasma+and+urine%3A+method+validation%2C+demonstration+of+using+a+surrogate+analyte%2C+and+demonstration+of+unacceptable+matrix+effect+in+spite+of+use+of+a+stable+isotope+analog+internal+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography/tandem mass spectrometry methods for quantitation of mevalonic acid in human plasma and urine: method validation, demonstration of using a surrogate analyte, and demonstration of unacceptable matrix effect in spite of use of a stable isotope analog internal standard.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (15), 1723-1734 (2003).</li>
<li>Leinenbach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+candidate+reference+measurement+procedure+for+quantification+of+amyloid-beta+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based candidate reference measurement procedure for quantification of amyloid-beta in cerebrospinal fluid.</a> Clin Chem. 60 (7), 987-994 (2014).</li>
<li>Li, W., Cohen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+endogenous+analytes+in+biofluid+without+a+true+blank+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitation of endogenous analytes in biofluid without a true blank matrix.</a> Anal Chem. 75 (21), 5854-5859 (2003).</li>
<li>Perret-Liaudet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+collection+tubes%3A+a+critical+issue+for+Alzheimer+disease+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid collection tubes: a critical issue for Alzheimer disease diagnosis.</a> Clin Chem. 58 (4), 787-789 (2012).</li>
<li>Lewczuk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sample+collection+tubes+on+cerebrospinal+fluid+concentrations+of+tau+proteins+and+amyloid+beta+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides.</a> Clin Chem. 52 (2), 332-334 (2006).</li>
<li>Pannee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+measurement+procedure+for+CSF+amyloid+beta+%28A%CE%B2%291-42+and+the+CSF+A%CE%B21-42+%2FA%CE%B21-40+ratio+-+a+cross-validation+study+against+amyloid+PET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Reference measurement procedure for CSF amyloid beta (Aβ)1-42 and the CSF Aβ1-42 /Aβ1-40 ratio - a cross-validation study against amyloid PET.</a> J Neurochem. 139 (4), 651-658 (2016).</li>
<li>Thienpont, L. M., Van Houcke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceability+to+a+common+standard+for+protein+measurements+by+immunoassay+for+in-vitro+diagnostic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Traceability to a common standard for protein measurements by immunoassay for in-vitro diagnostic purposes.</a> Clin Chim Acta. 411 (23-24), 2058-2061 (2010).</li>
<li>Vesper, H. W., Thienpont, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceability+in+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Traceability in laboratory medicine.</a> Clin Chem. 55 (6), 1067-1075 (2009).</li>
</ol>

JP ve EP herhangi bir açıklama bildirmiyor. HZ, Roche Diagnostics, Eli Lilly ve Pharmasum Therapeutics'in danışma kurullarında görev yaptı. KB, Fujirebio Europe, IBL International ve Roche Diagnostics için danışman veya danışma kurullarında görev yaptı. HZ ve KB, Göteborg Üniversitesi'nde GU Venture tabanlı bir platform şirketi olan Göteborg AB'deki Brain Biomarker Solutions'ın kurucu ortaklarıdır.

Tarif edilen yöntem için, bunun yerine bir yedek matris kullanılarak, insan CSF kalibrasyon sağlar taşıyıcı analit yaklaşım 13, 14, 15, 16, kullanılır. vekil analit yaklaşım iki farklı izotopik olarak etiketlenmiş standartları içerir. Başka bir (13 CAβ 142), dahili standart olarak kullanılır ise bir (15 NAβ 142), insan CSF kalibrasyon eğrisi oluşturm...

Alzheimer hastalığı (AD), demansın en yaygın biçimidir ve dünya çapında 1 ila yaklaşık 35 milyon insanı etkiler. Yaygın AD patogenezinde özünde yalan inanılan hastalığın nöropatolojik işaretlerinden toplu amiloid-beta (Aβ) peptitler 3 oluşan hiperfosforile tau proteininin 2 hücre içi nörofibrillerin ve hücre dışı plaklar vardır. Buna paralel olarak, biyomarkerların tarafından in vivo plak patoloji değerlendirmesi son zamanlarda AD 4 araştırma tanı kriterleri dahil edilmiştir. Aβ 1-42 BOS ölçümleri için, çok sayıda bağışıklık mevcuttur ve çok sayıda klinik laboratuarlarda 5 kullanılır. BOS Aβ 1-42 konsantrasyonu br plaklarda peptidin birikme yansıtan bilişsel normal yaşlılarda daha AD hastalarında yaklaşık olarak% 50 daha düşüktürain 6, 7. Bu biyolojik esas olarak immün (örneğin, antikor bazlı teknikleri) kullanılarak analiz edilir, ancak bu deneyler, matriks etkileri 8 etkilenebilir. Farklı teknoloji platformları üzerinde immunoassay ve tahlil standardizasyon 9 eksikliği kullanımı 10 11, 12 zorlu küresel kesme konsantrasyonlarının giriş yapar. Analitik doğrulanmış RMP ideal analitik platformlarda daha iyi karşılaştırılabilirlik ve genel ölçüm değişkenliği katkıda bulunan faktörlerden daha iyi kontrol sonuçlanan farklı tahlil platformları üniforma kalibrasyonunu imkan verecek. Geliştirilmiş LC-MS / MS yöntemi kullanılarak Aβ 1-42 mutlak ölçümü antikor bazlı techn ile bağlantılı sorunların üstesinden geliriques. Laboratuvar Tıp İzlenebilirlik için Ortak Komitesi (JCTLM veritabanı kimlik numarası C11RMP9) tarafından bir RPM olarak listelenen yöntem, BOS Aβ 1 uyumlaştırmak için bir Sertifikalı Referans Malzeme (CRM) içinde Aβ 1-42 mutlak konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır teknikleri ve analitik platformlarda -42 ölçümler. açıklanan iş akışı Tıbbın diğer alanlarında peptidler ve proteinler için aday başvuru yöntemlerinin geliştirilmesi için alaka olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>Eppendorf Protein LoBind mikrosantrifüj tüpleri, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind mikrosantrifüj tüpleri, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind mikrosantrifüj tüpleri, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431102</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind mikrosantrifüj tüpleri, 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.310</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plakaları 96</td><td>Eppendorf</td><td>951032905</td><td></td></tr><tr><td>Micronic 0.75 mL polipropilen tüpler, V tabanlı</td><td>Micronic</td><td>MPW32071BC3</td><td>Tüpler SPE elüatını toplamak için kullanılır, ancak 96 oyuklu plakalar gibi diğer toplama cihazları da kullanılabilir.</td></tr><tr><td>96 inç tüpler için Micronic Split TPE Capcluster</td><td>Micronic tüpler için Micronic</td><td>MP53026</td><td>Caps.</td></tr><tr><td>Micronic Loborack-96 beyaz w yüksek kapaklı barkodlu</td><td>Micronic tüpler için Micronic</td><td>MPW51015BC3</td><td>Tutucu.</td></tr><tr><td>Biohit Optifit uçları 1.2 mL</td><td>Sartorius</td><td>791210</td><td>LoBind derin kuyu plakalarının (96 kuyulu) dibine kadar ulaşmak için kullanılır. Diğer dar uçlar da işe yarayabilir.</td></tr><tr><td>Waters Oasis MCX 96 kuyulu ve mikro; Elüsyon Plaka Suları</td><td></td><td>186001830BA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Su Plakası manifoldu rezervuar tepsisi</td><td>Sular</td><td>WAT058942</td><td></td></tr><tr><td>Sular Oasis 96 Kuyulu Plakalar için Ekstraksiyon Plakası Manifoldu</td><td>Sular</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum hidroksit çözeltisi, puriss. pa, reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~%25 NH3 bazında</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril, Uzak UV HPLC Gradyan derecesi, 2,5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0627/17X</td><td></td></tr><tr><td>orto-Fosforik asit %85, ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td><td>Merck Millipore</td><td>1005731000</td><td></td></tr><tr><td>Guanidin Hidroklorür, 500 g</td><td>Thermo Scientific</td><td>24110</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Q-exactive Hibrit Dört Kutuplu Orbitrap Kütle Spektrometresi</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>ile birlikte verilen Dionex Ultimate 3000 LC ve otomatik örnekleyici ile.</td></tr><tr><td>Dionex ProSwift RP-4H Monolit Kolon (1.0 x 250mm)</td><td>Dionex</td><td>066640</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini, liyofilize toz, uygun (moleküler biyoloji için), Asetillenmemiş</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Amiloid (1-42), Ultra Saf, TFA</td><td>rPeptid</td><td>A-1002-2</td><td></td></tr><tr><td>15N Beta-Amiloid (1-42), Üniforma etiketli</td><td>rPeptid</td><td>A-1102-2</td><td></td></tr><tr><td>13C Beta-Amiloid (1-42), Üniform etiketli</td><td>rPeptid</td><td>A-1106-2</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka çalkalayıcılar, TiMix 2</td><td>Edmund B&uuml; hler</td><td>6110 000</td><td></td></tr></tbody></table>

aβ mutlak niceleme<sub&gt; 1-42</sub&gt; bos bir kitle spektrometrik referans Ölçüm prosedürü kullanma

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

Alzheimer hastalığı (AD) yaşlılar arasında en sık görülen nörodejeneratif hastalıktır ve tüm demans vakalarının %60-80'ini oluşturur. Şu anda, AH tanısı bilişsel testlere ve zihinsel durum muayenelerine dayanmaktadır, ancak beyin omurilik sıvısındaki (BOS) peptit amiloid-beta (Aβ) klinik çalışmalarda ve ortamlarda giderek daha fazla kullanılmaktadır. Çoğu protein ve peptit biyobelirteçinde olduğu gibi, miktar tayini, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) gibi antikor bazlı teknikler kullanılarak gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu tahlillerdeki laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası değişkenlik, klinik rutinde tanısal bir belirteç olarak kullanımını engellemektedir.
Katı faz ekstraksiyonu (SPE) ve sıvı kromatografisi (LC)-tandem kütle spektrometresine (MS/MS) dayalı olarak antikordan bağımsız bir Referans Ölçüm Prosedürü (RMP) geliştirilmiştir, burada kararlı, izotop etiketli Aβ peptitleri dahili standartlar olarak kullanıldı ve mutlak miktar tayinini mümkün kıldı. Ölçümler için yüksek çözünürlüklü dört kutuplu orbitrap hibrit bir cihaz kullanıldı. Yöntem, BOS Aβ1-42'nin 150-4.000 pg/mL arasında miktar tayinine izin verir.

Şekil 1 &#39;de plaka kurulumu numune tam levha kullanılır. Daha az bilinmeyen numuneler analiz edilecek ise, ikinci kalibratör, RF, ve QC setleri bilinmeyen numunelerin ilk yarısından sonra konulmalıdır. Şekil 2&#39;de görüldüğü gibi, kalibratörler, düşük ve standart sapmalar, regresyon çizgisine yakın bulunmaktadır. Bu yöntem, 150 pg / ml ve 4,000 pg / ml miktarının bir üst düzeyde miktarını...

Katı faz ekstraksiyonu ve sıvı kromatografi tandem kütle spektrometrisine dayalı olarak insan BOS'unda Aβ1-42'nin mutlak miktar tayini için bir referans ölçüm prosedürü açıklanmaktadır.

Aβ mutlak Niceleme<sub&gt; 1-42</sub&gt; BOS bir kitle Spektrometrik Referans Ölçüm Prosedürü kullanma

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

Bu referans ölçüm prosedürünün genel amacı, insan BOS'undaki beta ölçümlerini harmonize etmektir. Bu yöntem, merkezi amiloid patolojisi için bir biyobelirteç ve Alzheimer hastalığının nöropatolojik belirteci olan BOS a beta 42 ölçümüne yönelik analizlerin standartlaştırılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tamamen valide edilmiş olması ve AVR 142 miktarının belirlenmesinde antikorlar kullanmamasıdır.Bu tekniğin etkileri, analizlerin uyumlu hale getirilmesi ve klinik çalışmalarda genel eşik değerlerin belirlenmesinin kolaylaştırılmasını sağlayacağı için Alzheimer hastalığının tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem insanlardaki amiloid patolojisi hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, yeni ilaçlar geliştirmek amacıyla transgenik fareler ve insan dışı primatlar gibi diğer memeli organizmalara da uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, AVR 142'nin çok hidrofobik olması ve pipet uçları ile tüpler gibi yüzeylere kolayca yapışabilmesi nedeniyle zorluk yaşayabilirler.İlk olarak, 0,5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 40 µL N15 a beta peptidini, 0,46 ml %20 asetonitril ve %4 derişik amonyak karışımına ekleyin. Peptid çözeltisini bir vorteks karıştırıcıd

absolute-quantification-a1-42-csf-using-mass-spectrometric-reference

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kaynak: Samuels, D. J. ve diğerleri. Staphylococcus aureus'un metabolit analizi için Tandem Sıvı Kromatografi–Kütle Spektrometrisi Tabanlı Yaklaşım. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, S. aureus'tan hücre içi metabolitleri tanımlamak ve nicelendirmek için sıvı kromatografi-kütle spektrometrisinin kullanımını göstermektedir. Metabolit ekstraksiyonu, peptid normalizasyonu, sıvı kromatografi ve kütle spektrometrik analizinde yer alan adımları özetlemektedir.

S. aureus'tan Metabolitlerin Analizi İçin Sıvı Kromatografi–Kütle Spektrometrisi Temelli Yaklaşım

Bu kağıt fizyolojik tanımlanan biyolojik numunelerde subselüler çözünürlükte toplam kalsiyum içeriği ve dağılımı kantitatif ölçümüne cryoanalytical elektron mikroskobu uygulamasını açıklar.

Elektron Probe X-ışını Mikroanaliz tarafından Nöronlar Toplam Kalsiyum Ölçümü

Metabolit profil sağlık ve hastalık metabolizmanın çalışmasında değerli bir varlık olmuştur. Polarizasyon değiştirmesi ve hızlı görev döngüsü ile yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştiğinde normal aşamalı sıvı kromatografisi kullanarak, yüksek hassasiyet, doğruluk ve çözünürlük ile biyolojik madde polar metabolik bileşimini analiz etmek için bir protokol açıklar.

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Bu protokol, seçilen reaksiyon izleme kullanılarak karmaşık biyolojik numuneler içindeki hedef proteinlerin mutlak miktar tayini testlerinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Fare makrofaj kemotaksisi sinyal yolunun proteinlerini doğru bir şekilde ölçmek için kullanıldı. Hedef peptit seçimi, tahlil geliştirme ve kalitatif ve kantitatif tahliller ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Endüktif olarak eşleştirilmiş plazma - kütle spektrometresi (ICP-MS) ile tirelenmiş boyut dışlama kromatografisi, metaloproteinlerin bolluğundaki değişiklikleri doğrudan biyolojik örneklerden ölçmek için güçlü bir araçtır. Burada, moleküler kütleyi ve bilinmeyen proteinlerle ilişkili metal miktarını tahmin etmek için kullanılan bir dizi metaloprotein standardını açıklıyoruz.

Boyut Dışlama ICP-MS kullanarak Nicel Metalloproteomic Analiz Standartları

Biz klinik çeviri potansiyeli ile geliştirilen yüksek verim, multipleks ve hedeflenen proteomik beyin omurilik sıvısı (BOS) testi açıklar. Test böyle Apolipoprotein E varyantları (E2, E3 ve E4) olarak nörodejenerasyonun potansiyel belirteçleri ve risk faktörlerini, ölçmek ve onların allelik ifadesini ölçebilirsiniz.

Bir Yüksek Verimli, Çoklanmış ve Hedefli Proteomik BOS Deneyi nörodejeneratif Biyomarkerleri ve Apolipoprotein E İzoformları Durum belirlememize

Burada, siteye özgü protein asetilasyon ve/veya succinylation İskan izni (stoichiometry) sonra sunulan değişiklikler için endojen değişiklikler ratiometric analizi ile tüm bir Proteom, tarafsız miktar mevcut nicel kimyasal asilasyonu kararlı izotop etiketli anhidritler kullanarak. Hassas verileri bağımsız edinme kütle spektrometresi ile birlikte, doğru site doluluk ölçümler elde edilir.

Siteye özel Protein lizin asetilasyon ve Succinylation veri bağımsız edinme kütle spektrometresi kullanılarak Stoichiometry miktar

Protein sentezini hücreler için kritik bir biyolojik süreçtir. Beyinde, adaptif değişiklikler için gereklidir. Sağlam beyinde protein sentezinin oranlarının ölçülmesi dikkatli metodolojik hususlar gerektirir. Burada L-[1-14C]-leucine nicel autoradiographic yöntemi, serebral protein sentezinin bölgesel oranlarının in vivo olarak belirlenmesi için sunuyoruz.

Serebral protein sentezi In vivo bölgesel oranlarının belirlenmesi için nicel Autoradiographic yöntemi

Burada, hücre siz protein sentezi reaksiyonlarında merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 bileşiği ölçmek için sağlam bir protokol salıyoruz. Hücresiz sentez karışımı ters fazlı sıvı kromatografi kullanılarak etkili ayrıştırma için anilin ile türevize edilir ve daha sonra izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar kullanılarak kütle spektrometresi ile ölçülür.

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Yüksek spinal sıvı protein düzeyleri ya değiştirilmiş bir kan-beyin bariyeri veya intratekal sentez arasında plazma proteininin difüzyon sonucu olabilir. Bu makalede, her iki vakanın da ayrımına yardımcı olan ve intrathecally sentezlenmiş proteinlerin nicel ölçümlerini sağlayan optimize edilmiş bir test protokolü sunulmuştur.

Farelerde İntrathecally Sentezlenmiş Proteinlerin Kantitatif Ölçümü

Saccharomyces cerevisiaemayasında suda çözünen metabolitlerin ana sınıflarının tanımlanması ve nicelliği için bir protokol sunuyoruz. Açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve hassastır. Suda çözünür metabolitlerin yapısal izomerlerinin ve stereoisomerik formlarının birbirinden ayrılmasına izin verir.

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Keşfedin Aβ1-42 mutlak nicelendirmesi için katı faz ekstraksiyonu ve LC-MS/MS kullanarak insan beyin omurilik sıvısında standart ölçüm prosedürü. Bu yöntem, Alzheimer hastalığı biyobelirteci analizlerini uyumlaştırır ve ilaç geliştirme araştırmalarını destekler.

Aβ mutlak Niceleme

Daha fazla video keşfet