Aβ mutlak Niceleme _1-42 BOS bir kitle Spektrometrik Referans Ölçüm Prosedürü kullanma

Bu referans ölçüm prosedürünün genel amacı, insan BOS'undaki bir betanın ölçümlerini uyumlu hale getirmektir. Bu yöntem, merkezi amiloid patolojisi ve Alzheimer hastalığının nöropatolojik ayırt edici özelliği için bir biyobelirteç olan bir beta 42 olan CSF'nin ölçümü için testlerin standartlaştırılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, tamamen doğrulanmış olması ve AVR 142'nin miktar tayini için antikor kullanmamasıdır.

Bu tekniğin etkileri, Alzheimer hastalığının tedavisine kadar uzanır, çünkü tahlilleri uyumlu hale getirmek ve klinik çalışmalarda genel kesme seviyelerinin uygulanmasını kolaylaştırmak için kullanılacaktır. Bu yöntem insanlarda amiloid patolojisi hakkında bilgi sağlayabilirken, yeni ilaçları icat etmek için transgenik fareler ve insan olmayan primatlar gibi diğer ölümcül organizmalara da uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü AVR 142 çok hidrofobiktir ve pipet uçları ve tüpler gibi yüzeylere kolayca yapışabilir.

İlk olarak, 0.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 0.46 mililitre% 20 asetonitril ve% 4 konsantre amonyağa 40 mikrolitre N15 beta peptid ekleyin. Peptit çözeltisini bir girdap karıştırıcı üzerinde bir dakika karıştırın. İki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 1.95 mililitre% 20 asetonitril ve% 4 konsantre amonyağa 50 mikrolitre peptit çözeltisi ekleyin.

Peptit çözeltisini bir girdap karıştırıcı üzerinde bir dakika karıştırın. Daha sonra, her bir çözeltinin uygun hacimlerini mikrosantrifüj tüplerinde karıştırarak altı kalibratör çözeltisi hazırlayın. Kalibratör çözeltilerini karıştırdıktan sonra, karşılık gelen kalibratör çözeltilerinin ve insan BOS'unun uygun hacimlerini 0.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde karıştırarak son kalibratörleri iki parça halinde hazırlayın.

Her çözeltiyi bir girdap karıştırıcı üzerinde bir dakika karıştırın. İç standardı hazırlamak için, önce iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 1.968 mililitre% 20 asetonitril ve% 4 konsantre amonyağa 32 mikrolitre 13C bir beta peptit ekleyin. Peptit çözeltisini bir girdap karıştırıcı üzerinde bir dakika karıştırın.

Daha sonra, beş mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 4.9 mililitre% 20 asetonitril ve% 4 konsantre amonyağa 0.1 mililitre peptit çözeltisi ekleyin. Peptit çözeltisini bir girdap karıştırıcı üzerinde bir dakika karıştırın. Yanıt faktörü örneğini hazırlamak için, 0,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 0,46 mililitre %20 asetonitril ve %4 konsantre amonyağa 40 mikrolitre doğal bir beta peptit ekleyin.

Karıştırdıktan sonra, 20 mikrolitre peptit çözeltisi ve mililitre başına 20 mikrolitre dört mikrogram, 15N beta peptit ila 1.96 mililitre% 20 asetonitril ve% 4 konsantre amonyak ekleyin. Peptit çözeltisini bir girdap karıştırıcı üzerinde bir dakika karıştırın. Bunu takiben, 0.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 0.38 mililitre yapay BOS'a 20 mikrolitre peptit çözeltisi ekleyin.

Kopyaları hazırladıktan sonra, her bir çözeltiyi bir girdap karıştırıcı üzerinde bir dakika karıştırın. Numuneleri bir silindirde çözdürdükten sonra, her bir kalibratörden, yanıt faktöründen ve bilinmeyen numuneden 0.18 mililitre ekleyin, yanıt faktörü ve bilinmeyen numuneyi bir mililitre protein 96 derin kuyu plakasına ekleyin, numuneleri kuyucukların içine veya dibine yakın bir yere eklediğinizden emin olun. Şimdi, pipet ucunu suya batırmadan, kuyunun numunenin yüzeyine yakın tarafında bir damla standart bırakarak her bir kuyucuğa 20 mikrolitre iç standart ekleyin.

Ardından, her kuyucuğa 0.2 mililitre beş molar guanadin hidroklorür ekleyin. Numune plakasını bir mikroplaka çalkalayıcıya yerleştirin ve numuneleri 1100 rpm'de 45 dakika karıştırın. Karıştırdıktan sonra, her bir oyuğa 0.2 mililitre% 4 fosforik asit ekleyin.

Ardından, numune plakasını mikroplaka çalkalayıcıya yerleştirin ve 1000 rpm'de kısa bir süre karıştırın. Ekstraksiyon plakası manifold odasına karışık modlu katyon değişimi 96 kuyusu katı faz ekstraksiyonu veya SPE plakası altına atık için bir rezervuar tepsisi yerleştirin. Daha sonra, her bir oyuğa 0.2 mililitre metanol ekleyerek SPE sorbentini şartlandırın.

Ardından, her bir oyuğa 0.2 mililitre% 4 fosforik asit ekleyerek sorbenti dengeleyin. Sekiz kanallı bir pipet kullanarak, tüm numuneleri derin kuyu plakasından SPE plakasına aktarın. Bunu takiben, numuneler geçtikten sonra her bir oyuğa 0.2 mililitre% 4 fosforik asit ekleyerek sorbenti iki kez yıkayın.

Yıkama solventi sorbentten ayrıldıktan sonra, rezervuar tepsisini tüplerle değiştirin. Şimdi, bu çözeltinin sorbentten geçmek için çok düşük bir vakum gerektirdiğine dikkat ederek, iki adet 50 mikrolitrelik %75 asetonitril ve %10 konsantre amonyak ekleyerek numuneyi sorbentten çıkarın. Isı uygulamadan vakumlu santrifüj kullanarak eluatları kurutun.

Son olarak, tüpleri kapatın ve analize kadar 80 santigrat derecede dondurun. Kalibratörler, düşük standart sapmalarla regresyon çizgisine yakındır. Kalibrasyon doğrusal değilse, çalışma iptal edilmelidir ve sapma büyük olasılıkla yanlış pipetleme tekniklerinden ve/veya kalibratörlerin seyreltilmesindeki hatalardan kaynaklanmaktadır.

Replikaların varyasyon katsayısı tercihen %10'un altında olmalıdır: Doğal 15N ve 13C, LC kolonundan aynı anda simetrik tepelere yakın ve önemli bir kuyruk olmadan bir beta elüte. Her tepe noktası için en az 10 ölçüm yapılmalıdır ve yöntemde maksimum enjeksiyon süresi ile ayarlanabilir. Peptitler, yöntem duyarlılığı yetersiz olmadıkça, her enjeksiyon için sadece ilgilenilen peptitlerin ölçülmesi gerektiği sürece, MS analizi sırasında aynı anda ölçülebilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, peptit çözeltisini aktarmadan önce pipet uçlarını her zaman doyurmayı unutmamak önemlidir. Mümkün olduğunca az boşluk hacmine sahip tüpler kullanmak da önemlidir.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, Alzheimer hastalığı alanındaki araştırmacıların amiloid PET görüntüleme gibi diğer yöntemlerle uyumu keşfetmelerinin yolunu açtı. Ayrıca, BOS bazlı referans malzemelerine bir beta 142 konsantrasyonu atamak için de kullanılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, insan BOS'unda kalibratörlerin nasıl hazırlanacağını ve numunelerdeki beta 142'nin mutlak konsantrasyonunu ölçmek için LCMS analizinden önce katı faz ekstraksiyonunun nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

İnsan BOS ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven, koruyucu gözlük ve diğer güvenlik önlemleri gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.