Name: Elektrofizyoloji ve Kalsiyum-görüntüleme için akut nöronal Doku Uzamış İnkübasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Öğrenin, akut nöronal doku inkübasyonu için 24 saatten uzun süre canlılık sağlayan Braincubator yöntemini. Elektrofizyoloji ve kalsiyum görüntüleme deneylerinde hayvan kullanımını azaltırken veri kalitesini artırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik yardım için Colin Symons ve James Wright'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Y.B.'ye ve Western Sydney Üniversitesi'ndeki inovasyon ofisine tohum finansmanı hibesi (WSU) ile desteklenmiştir. M.C., ARC bursu (DECRA) tarafından desteklenmektedir.

protokol aşağıda C57BL / 6 ve C3H / He (retinally dejenere) Fare nöronal doku hazırlanmasını tarif, ancak benzer teknikler diğer türlere uygulanabilir. Bütün hayvanlar, sağlıklı ve standart sıcaklık koşulları, nem, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsünde, yiyecek ve suya serbest erişim ile ele ve herhangi bir amacıyla güç uyaran olmadan. Bütün deneyler onaylanmış ve Batı Sydney Üniversitesi Hayvan Bakım ve Etik komitesi göre yapılan ve hayvan kullanımı ve bakımı ana hatları (Hayvancılık Araştırma Kurumu # A9452, # A10396 ve # A8967) göre edildi. 1. Beyin Dilim Hazırlık <ol><li> izofluran (% 5) inhalasyon yoluyla hayvan anestezisi ve bir kemirgen giyotin kullanarak başını kesmek. Daha önce 9 tarif edildiği gibi hızlı bir şekilde beyin çıkarın ve buz gibi soğuk fizyolojik çözelti (ACSF) (mM olarak) içine yerleştirin: 125 NaCl, MgCl2, 1.25 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2, 25 2.5 KCI, 1NaHCO 3, 25 dekstroz ve karbojen ile doyurulmuş (% 95 O 2/5% CO2 karışımı 310 mOsm, pH 7.4). </li><li> titreşimli mikrotom ile 300 mikron kalınlığında, ilgilenilen bölgede, beyin dilimleri kesin. </li><li> Daha önce 10, 11 açıklandığı gibi, carbogen akışı ve sıcaklık - yakından izler ve pH düzeyini (7.4 pH 7.2) kontrol eden bir özel inşa kuluçka sistemi dilim aktarın. </li><li> 15 ila 35 ° C, ilk reaktör sıcaklığı ayarlama - 30 dakika, ve daha sonra yavaş yavaş 15 azaltmak - Şekil 1C&#39;de gösterildiği gibi, 16 ° C. kadar gerekli sonra ya elektrofizyoloji veya görüntüleme için, kuluçka sisteminin dilimleri kuluçkaya yatmaktadır. NOT: dilimleri kalsiyum görüntüleme için kullanılacak ise, RT altında doku soğutmadan önce aşağıdaki adımları izleyin. </li></ol> 2. Retina Wholemount Hazırlama ve İç Limitan Membran Soyulması <ol><li> Ya normal koşullarda retina wholemounts hazırlayınlaboratuvar aydınlatma koşulları veya loş kırmızı / kızıl ötesi ışık. </li><li> servikal dislokasyon ve hemen aydınlatmak gözler hayvan Euthanize. Ames ortam veya ACSF içeren ya küçük ora serrata&#39;dan boyunca kesilmiş ve yer (mM) sağlayın: 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCI, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 glukoz, 0.5 L-glutamin ve karbojen ile doyurun (2/5,% CO2 karışımı% 95 O, ~ 300 mOsm, pH 7.4) ilave edilir. </li><li> Hemen küçük bir makas ile ora serrata boyunca kesme ve forseps ile lens ve vitrözü ile kornea, lens ve vitrözü çıkarın. Oda sıcaklığında inkübasyon sistemi doku yerleştirin. Not: retinal doku 15 yavaş sıcaklık azaltma sonra, göz fincan korunabilir - ihtiyaç kadar inkübasyon sistemine&gt; 24 saat boyunca, 16 ° C. </li><li> Earl&#39;s- 30 U / ml papain, 1 mM L-sistin, 0.5 mM EDTA ve% 0.005 DNaz içeren küçük bir cam kavanoza retina içeren göz fincan transfer ILM kaldırmak için20 dakika için 37 ° C &#39;de dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS). Kapaktan çözüm% 95 O 2 /% 5 CO 2 uygulayın, ancak kabarcık yok. Genç hayvanların (&lt;6 hafta) doku kullanılırsa, yarı gücü seyreltilir. <ol><li> Earl BSS 10 dakika süreyle bir ovomukoid (10 mg / ml) ve BSA (10 mg / ml) çözelti içinde doku yerleştirerek, enzimatik sindirim durdurun. 16 ° C - Yıkama doku iyice aCSF ile inkübasyon sistemine aktarılmadan önce ve 15 sıcaklığını düşürmek. </li></ol></li><li> ihtiyaç kadar göz fincan retina dokusu korumak. mikroskop transfer için, göz bardaktan retina izole ve bir traş bıçağı ile 4 parçalar halinde kesilmiş. Tüm retina gerekiyorsa, düz yalan izin vermek için retinanın periferinde dört küçük kesikler yapın. NOT: görüntüleme deneyleri, kuluçka sistemine aktarılmadan önce kalsiyum boya ile yük için aşağıya bakın. </li></ol> 3. enkubatörde Doku bakımı <ol><li&gt; PH ve sıcaklık ölçümleri için sondaları (Şekil 1A, B) içeren ana odasında Yeri doku. </li><li> Çözelti içinde kayan bakteri saçmak için (5W / 2P sterilizatör UV lambası, 254 nm), ana bölmeden izole edilmiş ve UVC ışığı B 1.1 maruz (daha önce tarif edildiği gibi 12 inşa UVC odası), bir ikinci bölme ile aCSF sirküle (Şekil 1A). aCSF aşırı ısınmayı önlemek için 30 dakika - her 15 dk 15 ila 26 değişen zamanlarda ON döner rastgele özelliğini kullanarak programlanabilir zamanlayıcı ile kontrol UVC ışığı zamanlama. </li><li> 12 ml UVC odasında akış hızını ayarlamak / dk önce olduğu gibi 12 bildirdiler. nöronal dokulara zarar verebilir odasının dışında UVC aydınlatma önlemek için alüminyum folyo ile UVC odasına örtün. NOT: koyu adapte retina dokusunun için, ışık dışlamak için ana odaya ısmarlama kapak uygulayın. </li><li> Sirkü bir peristaltik pompa kullanmakte iki odaları aracılığıyla çözüm (CSF) ve 0 aralığında istenilen sıcaklıklara serin veya ana odayı ısıtmak birine soğutucu Peltier termoelektrik soğuk plaka - 50 ° C. Uzun vadeli canlılığı için 16 ° C - Optimum doku inkübasyon için, 15 kullanın. </li></ol> 4. Kalsiyum Boya Yükleme <ol><li> Bireysel araştırmacının tercihine göre kalsiyum boyalar seçin. Burada Fura-2AM, Flu-8 am veya Flu-4 am kullanın. Bununla birlikte, bu yöntem, aynı zamanda, diğer boyalar için uygulanabilir: 1 mM solüsyonu ve% 1 blok kopolimerleri DMSO içinde kalsiyum boyalar çözülür (örneğin, pluronik asit 127), 10 dakika boyunca son bir 50 uL hacmi ve sonikasyon. </li><li> Retina 10 uM, beyin kesitleri% 0.01 blok kopolimerleri ve 20 uM (retina),% 0.02 blok kopolimerleri nihai konsantrasyona aCSF çözüm ekleyin. F; 37 ° C (Fura-02:00) ya da oda sıcaklığında (Fluo-4 AM genç hayvanlarda, 45 dakika için banyo yükten retinae (papain muamele edilmiş) ve beyin dilimleriluo-08:00). <ol><li> yetişkin hayvanların, (&gt; 12 haftalık) için doğrudan beyin dilimleri üzerine boyalar (50 uL) pipet ve derin katmanlarına boyanın daha iyi nüfuz izin vermek için 75 dakika boyunca muhafaza edilir. </li><li> Boya inkübasyon sırasında su altı dilim yeterli oksijen sağlamak için, aCSF 2.5 mL içinde seyreltilmiş kalsiyum boyalar ile kapalı bir kapak (çap 2.5 cm, dairesel kavanoz, 3,5 cm yükseklik) olan bir cam yükleme bölmesine hazırlar. % 95 O 2 /% 5 CO 2 ile sürekli oksijen. kabarcık etmeyin. </li></ol></li><li> Deneysel kullanıma kadar 16 ° C - boya yükleme sonrasında yavaş yavaş 15 sıcaklığını düşürmek, kuluçka sisteminin aCSF ve transfer ile doku yıkayın. </li></ol> 5. Elektrofizyolojik Kayıtlar ve Görüntüleme <ol><li> mikroskop altında dalgıç bir kayıt odasına doku yerleştirin ve 4 bir akış oranında oksijenli ACSF serpmek - RT (~ 22 ° C) ya da fizyolojik sıcaklıkta 5 mL / dakika, ya (~ 35 ° C). Holgerilir ve altın veya platin tel U şeklinde bir parça üzerinde yapıştırılmış bir naylon veya altın parçacıkları imal &#39;harp&#39; özel yapılmış kullanılarak yerine D dokusudur. </li><li> elektrofizyoloji için: <ol><li> 5-6 MQ nihai direncini elde etmek için bir mikropipet çektirmenin kullanarak 1.5 mm (1.19 mm ID) borosilikat cam kayıt pipetler hazırlayın. </li><li> Daha önce 13 açıklandığı gibi iç çözümü 4 mcL ve bir CCD kamera kullanarak kızılötesi Diferansiyel Girişim Kontrast (IR-DIC) altında hücrelerin görselleştirmek - 3 pipet doldurun. Hücre içi çözüm dikkatlice deneysel sonuçlar elde etmek için her bir deney uygun olmalıdır. </li><li> Pozisyon pipet, pozitif basınç korurken bir micromanipulator kullanarak bir hücre zarında yer alan, pipet tutucu bir emme portu aracılığıyla başvurdu. ILM retina kaldırıldı beri, önceden zar kazıma gereklidir. Pipet hücre üzerinde sonra, nazik negatif uygulamakpipet basınç gigaohm mühür elde etmek. Daha sonra bir negatif basınç kısa bir miktarı ile, hücre zarı yırtılabilir. </li><li> uygun şekilde standart teknikler kullanılarak bütün hücre akım-veya voltaj-kelepçe kayıtları sağlayın. </li></ol></li><li> Kalsiyum-görüntüleme: <ol><li> Fura-2 oran ölçer görüntüleme için, 340 nm ve 380 nm düzeyindeki uyarıcı dalga uzunluklannda sağlamak için bir ultra-yüksek hızlı dalga değiştiriciyi kullanın. 510 ± 20 nm emisyon filtresi aracılığıyla tek tek hücrelerin yayılan ışığı geçirin ve bir yüksek hassasiyet, yüksek hızlı dijital kamera ile yakalamak. </li><li> 550 nm bant geçiren filtre - Bir 515 ile 490 nm bant geçiren filtre ve yayılan ışık - Flu-4, filtre uyarma 460 ışığın tek bir dalgaboyu için. En hızlı ve en hassas kayıt için böyle bir yüksek hızlı dijital fotoğraf makinesi kullanın. gerektiği gibi görüntü kazanır. </li><li> zamanın bir fonksiyonu ya tek bir dalga boyunda (Fluo-4) ya da dalgaboyu oranı kullanılarak floresan değişiklikleri ölçmekyöntemi (Fura-2), daha önce, 14 8 hazırlanır. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+mol+biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).</li>
<li>Gibb, A., Edwards, F. <a target="_blank" href="http://www.utdallas.edu/~tres/microelectrode/microelectrodes_ch10.pdf">Patch clamp recording from cells in sliced tissues.</a> Microelect Techniq. , 255-274 (1994).</li>
<li>Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+cell-permeant+6-nitrodibenzofuranyl-caged+IP3%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+photobiol+sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3.</a> Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).</li>
<li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+and+Extrasynaptic+Factors+Governing+Glutamatergic+Retinal+Waves%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves.</a> Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).</li>
<li>Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+Calcium+Imaging+Methods+in+Wholemount+Rat+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina.</a> J Vis Exp. (92), e51396(2014).</li>
<li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Ca2%2B+dynamics+in+cone+photoreceptor+axon+terminals+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina.</a> J Vis Exp. (99), e52588(2015).</li>
<li>Velte, T. J., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potentials+in+the+dendrites+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells.</a> J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).</li>
<li>Cameron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+AM+dyes+following+prolonged+incubation+in+acute+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue.</a> PLoS ONE. 11 (5), (2016).</li>
<li>Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptation+of+spike+backpropagation+delays+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons.</a> Front Cell Neurosci. 7, (2013).</li>
<li>Breen, P. P., Buskila, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Braincubator%3A+An+incubation+system+to+extend+brain+slice+lifespan+for+use+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology.</a> Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).</li>
<li>Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , WO2015021513A1 (2015).</li>
<li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+viability+of+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Extending the viability of acute brain slices.</a> Sci Rep. 4, 4-10 (2014).</li>
<li>Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reactive+nitric+oxide+production+by+astrocytes+in+mouse+neocortical+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices.</a> Glia. 52 (3), 169-176 (2005).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).</li>
<li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Astrocytic+Nitric+Oxide+Production+and+Neuronal+Modifications+in+the+Neocortex+of+a+NOS2+Mutant+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse.</a> PLoS ONE. 2 (9), 9(2007).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , Methuen. London, UK. (1959).</li>
</ol>

Yossi Buskila ve Paul Breen, akut sinir dokusu için kuluçka sistemleri oluşturma konusunda uzmanlaşmış bir şirket olan PAYO Scientific Pty Ltd'nin ortak sahipleri olduklarını beyan ederler. Diğer tüm yazarlar, mevcut çalışmayla ilgili herhangi bir mali çıkar veya potansiyel çıkar çatışması bildirmemektedir.

Bu makale, böylece deneysel hedefleri tamamlamak için gereken hayvan sayısının azaltılması, görüntüleme ve elektrofizyolojik deneyler için akut nöronal doku canlılığını uzatmak için bir kuluçka yöntem açıklanır. İki ana süreçleri zamanla nöronal doku bozulmasını yöneten: i) artan bakteri düzeyleri ve serbest bakteriyel endotoksin eşlik eden artış ve travmatik dilimleme işlemi 10 aşağıdaki ii) eksitotoksi. Akut nöronal doku çevre savunmasız olduğundan, pH, sıcaklık ve bakteri seviyelerinin yakında...

Elektrofizyoloji ve fonksiyonel görüntüleme (kalsiyum, gerilim duyarlı boyalar) nörobilim alanında en sık kullanılan deneysel teknikler ikisidir. Beyin dilim hazırlıkları ve burada ele alınacaktır retina wholemount, anestezik veya kas gevşeticiler gelen kirlenme olmadan elektrofizyolojik özellikleri ve sinaptik bağlantı inceleme olanağını sağlamaktadır. Beyin dilimleri ve retina belli devreler ve beyin ağları 1 çalışma sağlayan kültürlerin veya hücre homojenatları farklı olarak, yapısal bütünlüğünü muhafaza wholemount. İzole doku Kayıtlar kalp atışı ve solunum ile ilişkili hareketler olarak in vivo kayıtları üzerinde avantajları ortadan kalkar var. Ayrıca, doğrudan görselleştirme hedef hücre spesifik sınıfları ve farmakolojik araçlar 2, 3 lokal uygulamaya izin verir. Patch-kelepçe kayıtları ve kalkyum-yükleme boyası retina wholemount Retina Ganglion Hücre (RGC) katmanı kapsar ve hücrelere doğrudan erişimi engeller Membran (ILM), Sınırlama İç varlığı ile karmaşık. Tipik haliyle, bu membran, tek bir hücre üzerindeki bir gigaohm contanın bir yama pipet ve oluşum doğrudan uygulamaya izin vermek için bir cam pipet ile kazınarak. Buna ek olarak, küvet uygulanan kalsiyum boyalar ILM geçmez ve ya retrograd optik sinir 5 aşağıdaki enjeksiyon taşınan veya dokuya 6 boyunca elektroporasyon, bu zarın 4 altından enjekte edilmelidir. Retinitis pigmentosa kemirgen modeli kullanılırken Dahası, rd / rd fare, ILM daha kalın ve daha aşılmaz olduğunu. Burada, yama-kelepçe recordi için retina ganglion hücrelerinin her yerde kalsiyum boya yükleme ve doğrudan erişim hem de izin vermek, enzimatik sindirim 7 ile ILM kaldırmak için bir tekniği kullanırNGS 8. beyin dilimleri veya retina wholemount birinden başarılı kayıtları diseksiyon ve canlı nöronal doku inkübasyon bağlıdır. Tipik olarak, doku, deney sabahı ekstre edilir ve kayıt için kullanılana kadar yapay serebrospinal akışkan (CSF) &#39;de inkübe edilmiştir. Bu zaman penceresinde aşağıdaki önemli ölçüde bozulma ile, 8 saat - Genellikle, doku 6 canlı kalır. Ancak, beyin dilimleri ve wholemount retinae hazırlıkları hem genelde bu kısa süre içinde kaydedilebilir daha fazla doku üretir. Sonuç olarak, bağ, genellikle gün sonunda atılır ve diseksiyon sonraki günlerde daha tamamlanır. Bu, başka bir hayvan kullanılmıştır ve kurulum ve diseksiyon / tekrarlanan boyama ~ 2 saat demektir. Aşağıdaki protokol kullanılmaktadır daha az hayvan anlamına fazla 24 saat boyunca, nöronal dokuda ömrünü uzatmak için bir yöntem tarif eder, ve daha çok deneysel kez mevcuttur. Doku canlılığını Welektrofizyolojik özellikleri ve kalsiyum dinamikleri kayıt yoluyla değerlendirilir ve bu özellikleri &lt;4 saat ve&gt; 24 saat postdissection arasındaki ayırt olduğu gibi. Bu sonuçlar, uzun inkübasyondan sonra tek hücre özellikleri bozulmamış ve işlevsel değil sadece gösteriyor, ancak kalsiyum görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıtlar ile değerlendirilen ağ etkinliği, 24&gt; değişmeden saat postdissection olduğunu. Ayrıca, kalsiyum boyalar herhangi bir zararlı etkiye neden olmadan uzun süreli dönemler için hücrelerde kalır olduğunu göstermektedir. Bu protokolün uygulanması dış çevre yüksek düzenlenir sonra akut nöronal dokuda nöronların fonksiyonel aktivitesi, uzun süreler boyunca muhafaza edilebileceğini göstermektedir. Doku canlılığı nedeniyle farklı inkübasyon protokolleri laboratuarlar arasında büyük farklılıklar Dahası, bu yöntem akut neu sağlığı değişkenliği azaltmak için uygulanması gereken ideal bir parametre için bir altın standardı belirlerronal dokusu.

<table><tbody><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma Aldrich VETEC</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>N-Metil-D-glukamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004 &</td><td></td></tr><tr><td>D-glikoz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Papain Ayrışma Sistemi</td><td>Worthington&nbsp;</td><td></td><td></td>LK003150</tr><tr><td>Dimetil sülfoksit susuz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 Düşük UV emilimi*</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>P-6867</td><td>DMSO'da %20 çözelti&nbsp;</td></tr><tr><td>Fura-2&nbsp; &nbsp;</td><td>Anaspec</td><td>84017</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4&nbsp; &nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>F23917</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8</td><td>Abcam</td><td>Ab142773</td><td></td></tr><tr><td>Titreşimli bıçak mikrotomu ve nbsp;</td><td>Leica Biosystem</td><td>VT1200 S</td>, <td>Leica' ile Donatıldı s Vibrocheck ve ticaret; Ölçüm cihazı&nbsp;</td></tr><tr><td>Titreşim önleyici tabla</td><td>Kinetik Sistemler Vibraplane&nbsp;</td><td>Vibraplane 9100/9200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sabit Kademeli Dik Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Objektifi</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td><td>20X&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop Objektifi</td><td>Olympus</td><td>LUMPlanFLN 60x/1.00w</td><td>60X</td></tr><tr><td>CCD Kamera</td><td>Andor</td><td>Ixon +</td><td></td></tr> <tr><td>Yüksek hızlı dalga boyu değiştirici</td><td>Sutter cihazı</td><td>Lambda DG-4 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Yama kelepçesi amplifikatörü</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Veri toplama sistemi</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&reg; Sistem</td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal damarlar</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikroelektrot çektirme</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Alevli/Kahverengi tip mikropipet çektirme</td></tr><tr><td>Kayıt/perfüzyon odası</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40LP</td><td>Düşük Profilli Açık Banyo Odaları</td></tr><tr><td>Yazılım</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Andor iQ Canlı Hücre Görüntüleme Yazılımı</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>Beyin Küpü</td><td>Payo Scientific</td><td>BR26021976</td><td>www.braincubator.com.au</td></tr><tr><td>Peltier-Termoelektrik Soğuk Plakalı Soğutucu</td><td>TE Teknolojisi</td><td>CP-121</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık Kontrol Cihazı</td><td>TE Teknolojisi</td><td>TC-36-25 RS232</td><td></td></tr></tbody></table>

elektrofizyoloji ve kalsiyum-görüntüleme için akut nöronal doku uzamış İnkübasyon

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Diseksiyon Aşağıdaki 8 saat - nöronal doku preparatları, beyin kesitleri ve retina wholemount akut, genellikle 6 korunabilir. Bu deneysel zaman sınırlar ve çalışmanın başına kullanılan hayvanların sayısını artırır. Bu tür banyo uygulanan boyalar ile uzun süreli ön inkübasyon gerektiren kalsiyum görüntüleme gibi Bu sınırlama, özellikle etkiler protokolleri. 3 içinde Üstel bakteri üremesi - dilimleme sonra 4 saat sıkı doku sağlığı bir azalma ile ilişkilidir. Bu çalışma, büyüme faktörlerini içeren antibiyotiklere steril prosedürleri ya da doku kültürü ortamı gerek kalmadan zaman uzun süreli (&gt; 24 saat) için geçerli nöronal doku sağlamak için, akut preparasyonlarda bakterilerin üremesini sınırlamak için bir yöntem tarif eder. UV ışınlaması yoluyla dışı sıvıyı bisiklet ve 15 özel tutma odasında doku tutarak - 16 ° C, doku elektrofizyolojik özellikleri, veya kalsiyum si fark gösterir&gt; 24 saat postdissection hücre içi kalsiyum boyalar ile gnaling. Bu yöntemler akut nöronal doku kullananlar için deneysel süresini uzatmak kalmayacak, ama deneysel hedefleri tamamlamak için gereken hayvanların sayısını azaltacak ve akut nöronal doku inkübasyon için bir altın standart ayarlar.

İnkübasyon sırasında aCSF bakteri yükü ve sıcaklık sıkı regülasyonu nöronal doku canlılığını korumak için şarttır. 16 ° C (Şekil 1) - Bu UVC ışığı ile ışınlama ve 15 aCSF sıcaklık muhafaza ile optimize edilebilir. (Şekil 1C APS), takip edildiği takdirde arasındaki değişkenliği azaltacak nöronal doku, kuluçka sırasında böylece parametreler için bir altın standart sunan, çevre koşullarının bir rekor (pH ve sıcaklık.) Ile deneyci sağlar Ayrıca, aCSF damga p...

8 saat - vücuttan çıkarılır sonra, nöronal doku büyük ölçüde 6 sonra doku nihai bozulmasına sebep çevre koşullarından etkilenir. yakından takip eder ve dokunun hücredışı ortamı düzenleyen benzersiz inkübasyon yöntemi kullanılarak, doku canlılığını önemli ölçüde&gt; 24 saat boyunca uzatılabilir.

Elektrofizyoloji ve Kalsiyum-görüntüleme için akut nöronal Doku Uzamış İnkübasyon

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Bu tekniğin genel amacı, nöronal dokuyu belirgin bir doku dejenerasyonu olmaksızın uzun süreler boyunca muhafaza etmektir. Bu yöntem kullanılarak, doku ekstraksiyonundan 24 saat sonra bile elektrofizyolojik kayıtlar ve kalsiyum görüntüleme yapılabilmektedir. Bu yöntem, akut olarak ekstrakte edilen nöronal dokunun canlılığını büyük ölçüde artıracak ve canlılığını 24 saatten fazla koruyarak akut doku inkübasyonu için yeni bir altın standart belirleyecektir.Bu tekniğin temel avantajı, dokunun kullanılabileceği deneysel sürenin önemli ölçüde artırılmasıdır. Bu durum, ihtiyaç duyulan hayvan sayısını azaltır ve her deneyden elde edilebilecek veri miktarını maksimize eder. Braincubator, doku sıcaklığını koruyan ve hücre dışı sıvıda bakteriyel proliferasyonu önleyen otomatik bir sistemdir.Bu, doku için sıkı bir şekilde kontrol edilen bir ortam sağlar. Bu prosedürü, laboratuvarımdan doktora öğrencileri Orsolya Kekesi ve Alba Bellot-Saez uygulamalı olarak gösterecekler. Beyin kesiti hazırlamak için bir vibratom kullanarak, ilgi bölgesini içeren 300-micrometer kalınlığında beyin kesitleri hazırlayın.Ardından kesitleri; karbogen akışının, pH seviyelerinin ve sıcaklığın kontrol edildiği özel yapım bir inkübasyon sistemine aktarın. Başlangıç hazne sıcaklığını 15 ila 30 dakika boyunca 35 °C'ye ayarlayın ve ardından yavaşça 15 °C'ye düşürün. Sonrasında kesitleri, elektrofizyolojik kayıt veya görüntüleme işlemine kadar inkübasyon sisteminde bekletin.Retina bütün montaj (whole mount) hazırlığı için, ötanize edilmiş bir hayvanın gözlerini derhal enükle edin. Ora serrata boyunca küçük bir kesi yapın ve gözleri, karbojen beslemesi eşliğinde oda sıcaklığındaki Ames besiyerine veya aCSF'ye yerleştirin. Ardından, küçük bir makasla ora serrata boyunca keserek kornea, lens ve vitreusu derhal çıkarın ve bunları pensle uzaklaştırın.Dokuyu oda sıcaklığında inkübasyon sistemine yerleştirin. İç sınırlayıcı membranı uzaklaştırmak için, retinayı içeren göz kubbesini 37 °C'de papain, L-sistein, EDTA ve DNase içeren küçük bir cam kavanoza 20 dakika boyunca aktarın. Çözeltiye kapak üzerinden karbogen uygulayın ancak kabarcık oluşturmayın.Dokuyu, Earle's BSS içerisindeki ovomukoid ve BSA çözeltisine 10 dakika boyunca yerleştirerek enzimatik sindirimi durdurun. Ardından dokuyu aCSF ile iyice yıkayın. Sonrasında dokuyu inkübasyon sistemine aktarın ve sıcaklığı yaklaşık 15 ila 16 °C'ye düşürün.Ardından, retinal dokuyu mikroskoba aktarın. Retinayı göz çukurundan ayırın ve bir jilet yardımıyla dört parçaya bölün. Retinanın tamamı gerekiyorsa, düz bir şekilde yayılmasını sağlamak için retinanın çevresine dört küçük kesik atın.Bu doku artık elektrofizyoloji için mikroskoba aktarılabilir veya Braincubator içerisinde muhafaza edilebilir. Doku, pH ve sıcaklık ölçümleri için probların bulunduğu ana bölmede tutulur. İkinci bir bölme, ana bölmeden izole edilmiştir ve çözelti içinde yüzen bakterileri ışınlamak amacıyla 1.1 watt UVC ışığına maruz bırakılır.İki oda boyunca aCSF sirkülasyonu sağlamak için peristaltik bir pompa ve ana odayı soğutmak veya ısıtmak için bir Peltier termoelektrik soğutma plakası kullanın. Bu prosedürde, 1 mM'lık bir çözelti hazırlamak için kalsiyum boyasını DMSO içinde çözün. Karışıma, nihai hacmi 50 µL yapmak için %1 pluronik asit F-127 ekleyin.Ardından, 10 dakika boyunca sonike edin. Beyin kesitleri için 10 micromolar, retina için ise 20 micromolar nihai konsantrasyon elde edecek şekilde 2.5 milliliters aCSF ile seyreltilmiş kalsiyum boyası içeren bir cam yükleme haznesi hazırlayın. Retina ve genç hayvanlardan alınan beyin kesitleri için örneği banyoda 45 dakika inkübe edin.Yetişkin hayvanlar için, 25 µL boyayı doğrudan beyin kesitinin üzerine pipetleyin ve boyanın derin tabakalara daha iyi nüfuz etmesini sağlamak için 75 dakika bekletin. Boya inkübasyonu sırasında daldırılmış dokunun yeterli oksijenlenmesini sağlamak için, kapağı aracılığıyla sürekli olarak karbogen ile oksijenlendirin ancak kabarcık oluşturmayın. Boya yüklemesinin ardından, dokuyu aCSF ile yıkayın ve inkübasyon sistemine aktarın.Kullanıma kadar sıcaklığı yavaşça yaklaşık 15 ila 16 °C'ye düşürün. Kayıt işlemi için dokuyu bir mikroskop altında, daldırılmış bir kayıt haznesine yerleştirin ve dakika başına dört ila beş mL akış hızında oksijenlendirilmiş aCSF ile perfüze edin. Dokuyu özel yapım bir harp kullanarak sabitleyin.Ardından, beş ila altı megaohm nihai direnç elde etmek için bir mikro pipet çekici kullanarak bazı kayıt pipetleri hazırlayın. Bir pipeti üç ila dört µL internal solüsyon ile doldurun ve ardından solüsyonu buz üzerine yerleştirin. Daha sonra IR-DIC altında bir CCD kamera kullanarak hücreleri görüntüleyin.Bir mikromanipülatör kullanarak pipeti hücre membranının üzerine konumlandırın. Pipet tutucusundaki bir vakum portu aracılığıyla pozitif basıncı koruyun. Pipet hücrenin üzerine yerleştiğinde, gigaohm sızdırmazlık sağlamak için pipete hafif negatif basınç uygulayın.Ardından, kısa süreli negatif basınçla hücre membranını yırtın. Sonrasında, tüm hücre akım veya voltaj kenetleme kaydına başlayın. Fura-2'nin rasyometrik görüntülemesi için 340 nanometre ve 380 nanometre uyarma dalga boyları sağlamak amacıyla ultra yüksek hızlı bir dalga boyu değiştirici kullanın.Ardından, yayılan ışığı yüksek hassasiyetli, yüksek hızlı bir dijital kamera ve emisyon filtresi aracılığıyla yakalayın. Fluo-4'ün tek bir eksitasyon dalga boyu için, eksitasyon ışığını 460 ile 490 nanometrelik bir band geçiren filtreyle ve yayılan ışığı 515 ile 550 nanometrelik bir band geçiren filtreyle süzün. Sindirim işleminden sonra, retinal ganglion hücreleri ve yer değiştirmiş amakrin hücreleri DIC aydınlatması altında net bir şekilde görüntülenebilir ve iç sınırlayıcı membranın önceden kazınmasına gerek kalmadan patch clamp kayıtları için hedeflenebilir.Bir retinal ganglion hücresinden alınan temsili akım kenetleme kayıtları burada gösterilmiştir. Hücrenin yama pipeti aracılığıyla depolarize edilmesi, papain uygulamasının ardından hücrelerin canlılığını gösteren doz bağımlı aksiyon potansiyeli oluşumuna neden olmuştur. İç sınırlayıcı membranının kaldırılması, ganglion hücre tabakasının Fura-2 AM ile her yere yayılmış şekilde boyanmasına da olanak sağlamıştır. Ve hücreler, F0'a göre 342 ila 380 nanometre oranındaki artışla kanıtlandığı üzere, 30 millimolar potasyum klorür uygulamasına hücre içi kalsiyum konsantrasyonunda büyük bir artışla yanıt vermiştir. Potasyum klorür uygulamasının ardından kalsiyum seviyeleri, stimülasyonu takiben bazal seviyeye dönmüştür.Ve hücreler, daha sonra benzer bir genlik yanıtı üretmek üzere stimüle edilebilmiştir. Dahası, bu yanıtlar diseksiyon sonrası dört saatten daha kısa süre ve 24 saatten daha uzun süre kaydedilen retinalar arasında ayırt edilemezdi. Bu prosedürü uygularken, akut nöronal dokunun çevresel etkilere karşı savunmasız olduğunu unutmamak önemlidir.Bu nedenle, pH, sıcaklık ve bakteri seviyelerinin yakından izlenmesi yoluyla aCSF'nin sıkı bir şekilde düzenlenmesi, hücresel aktivitenin ve ağ bütünlüğünün korunması için esastır. Bu prosedür, aseptik tekniklere veya fizyolojiyi etkileyebilecek büyüme faktörleri veya antibiyotikler içeren kültür ortamlarının kullanımına gerek kalmadan nöronal dokuyu 24 saatten fazla süreyle korumak için kullanılabilir. Bu yöntemin, doku canlılığını maksimize etmek için ideal parametreler konusunda altın standart olacağını umuyoruz.Bu durum, dokunun kendi sağlığındaki değişkenliği azaltır ve buna bağlı olarak deneysel değişkenliği düşürür. Retinanın iç sınırlayıcı membranını sindirmek için papain protokolünün kullanılması, kalsiyum boyaları ile yaygın bir boyama elde edilmesini mümkün kılar. Bu protokol ayrıca, ganglion hücre tabakasındaki nöronlardan çok noktalı hücre içi kayıtlar almak için de kullanılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, görüntüleme ve elektrofizyolojik deneyler için canlı dokuyu 24 saatten fazla nasıl muhafaza edeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ultraviyole ışıkla çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirirken koruyucu gözlük gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

prolonged-incubation-acute-neuronal-tissue-for-electrophysiology

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz intrasellüler serbest kalsiyum konsantrasyonu ve sinaptik etkinliği değişiklikleri eşzamanlı bir ganglion hazırlanmasında nasıl takip edilebileceğini...

Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler<em&gt; Aplysia&#39;nın</em

Bu video, retinanın nöronal dokusunun uzun süreli inkübasyonu için bir yöntemi göstermektedir. Retina içeren vizör taneleri bir fare gözünden elde edilir; iç sınırlayıcı zar (ILM), retinanın nöronal hücrelerini açığa çıkarmak için enzimatik olarak sindirilir ve tedavi edilen göz kabı veya izole retina, düşük bir sıcaklıkta uzun süreli inkübasyon için özel bir inkübatöre aktarılır.

Retinanın nöronal dokusunun uzun süreli inkübasyonu için bir teknik

Bu video, beyin hipokampal dilimlerinde tam hücre yama klemp kaydı ve iki fotonlu kalsiyum görüntüleme için bir protokolü göstermektedir. Bu yöntem, akut beyin dilimlerindeki farklı nöronal tiplerdeki dendritlerdeki yerel Ca2+ geçici akımlarının (CaT'ler) dinamiklerini incelemeye izin verir.

Beyin Dilimlerinin İki Fotonlu Kalsiyum Görüntülemesi için Tam Hücre Konfigürasyonunun Oluşturulması

Bu video, kalsiyum görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıtlar kullanarak fare beyin dilimlerindeki nöronal aktiviteyi ölçmek için bir tekniği göstermektedir. Dokuyu potasyum iyonları ile perfüze ederek ve yüksek hızlı dijital görüntüleme yoluyla hücre içi kalsiyum değişikliklerini kaydeden bu yöntem, gerçek zamanlı nöronal yanıtları ortaya çıkarır.

Uzun Süreli İnkübasyondan Sonra Bir Fare Beyin Diliminde Nöral Aktivitenin Ölçülmesi

Prosedürler, membran potansiyelinin veya akımının eşzamanlı kayıtlarını ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri gerçekleştirmek için tanımlanır. Suprakiazmatik çekirdek nöronları, tüm hücre yama kelepçesi konfigürasyonunda bir yama kelepçe elektrodu kullanılarak kalsiyum indikatörü bis-fura-2 ile doldurulur.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Bu tam hücre patch-kelepçesi ve fare beyin, akut doku dilimleri dendrit ve hipokampal nöronlar dikenler Hücre içi sodyum transient çoklu foton görüntüleme ile, nöro-aktif bileşiklerin fokal UV uyarımlı foto-aktivasyon kombinasyonunu tarif eder.

Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte

Enterik sinir sistemi (ENS), bağırsak duvarında bulunan ve bağırsak reflekslerini kontrol eden bir nöron ve glia ağıdır. Bu protokol, Ca2+ görüntüleme kullanılarak ENS'nin canlı preparatlarında enterik nöronların ve glia'nın aktivitesini kaydetme yöntemlerini açıklar.

Enterik Sinir Sistemi Yerinde Ca 2+ Görüntüleme

Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca2 + geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Burada, vitro omurilik dilim nöronlarda gözlemliyorum gelatinosa (SG) yapılan bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları için gerekli adımları açıklar. Bu yöntem, içsel membran özelliklerini, sinaptik iletimi ve morfolojik belirlenmesi için SG nöronlar karakterizasyonu sağlar.

Akut omurilik dilimleri hazırlanması gözlemliyorum Gelatinosa nöronlar bütün hücreli yama-kelepçe kayıt için

Microglia, yerleşik bağışıklık hücreleri beynin, çabuk morfolojik değişiklikler ile çevrenin değişiklikler cevap. Bu protokol iki fotonlu mikroskobu serotonin veya ATP doğru mikroglial süreçlerinde fareler dilim akut beyin cazibe çalışmak için nasıl kullanılacağını açıklar.

Mikroglial süreçleri cazibe ATP veya Serotonin akut beyin dilimleri içinde doğru iki fotonlu görüntüleme

Farelerin dorsal-ara hipokampusundan akut dilimler hazırlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu transversal preparatı, kayıtların kalitesi ve kaydedilen nöronların morfolojik özelliklerinin korunması açısından koronal dilimleme ile karşılaştırıyoruz.

Yetişkin Farelerin Dentat Girusunda Tüm Hücre Kaydı ve Nöronal Rekonstrüksiyon için Dorsal Hipokampustan Akut Dilimlerin Hazırlanması

Öğrenin, akut nöronal doku inkübasyonu için 24 saatten uzun süre canlılık sağlayan Braincubator yöntemini. Elektrofizyoloji ve kalsiyum görüntüleme deneylerinde hayvan kullanımını azaltırken veri kalitesini artırın.

Elektrofizyoloji ve Kalsiyum-görüntüleme için akut nöronal Doku Uzamış İnkübasyon

Daha fazla video keşfet