Vitro Lipid tabanlı nano tanecikleri tarafından canlı hücre Chemotherapeutics keşfetmek için Imaging teslim kullanma

Bu Canlı hücre görüntüleme tekniğinin genel amacı, fiksasyona ihtiyaç duymadan Kemoterapötik Ajanların alımı ve dağıtımı gibi hücresel süreçleri takip etmektir. Bu yöntemler, kanser alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin: Kemoterapötik Ajanların serbest formda veya nanopartiküller içinde kapsüllenmiş olarak tümör hücreleri tarafından nasıl alındığı. Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücreleri görüntülememiz, böylece fiksasyon artefaktlarını önlememiz ve gerçek zamanlı dinamik değerlendirmeye izin vermemizdir.

Bu yöntem için ilk olarak, nanopartiküllerin fiksasyon sırasında bozulduğunu ve bunun da ilaç dağıtımının yanlış yorumlanmasına yol açtığını gözlemlediğimizde aklımıza geldi. Görüntüleme haznesini monte etmek için, haznenin alt kısmına 25 milimetrelik bir kapak camı yerleştirin ve üst kısmı alt kısma vidalayın. Cam kırılabileceğinden çok fazla sıkmayın.

Tüm odayı otoklavlayın. Hücreleri plakalamak için, görüntüleme odasını bir Laminer Akış Kabinindeki sterilizasyon torbasından çıkarın. Hazneyi dikkatlice sıkın ve bir Petri Kabına yerleştirin.

Görüntüleme odasının camını 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca bir mililitre yüzde 0,1 steril jelatin ve yüzde beş Karbondioksit ile kaplayın. Ortamı hücre kültürü şişelerinden çıkardıktan sonra, hücreleri 1x PBS ile bir kez yıkayın ve hücreleri yüzde 0.25 Tripsin kullanarak ayırın. Hücre Kültürü ortamı ekleyerek Tripsin'i etkisiz hale getirin.

Daha sonra hücreleri toplayın ve beş dakika boyunca 1.100 Gs'de döndürün. Peleti beş mililitre Hücre Kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri metin protokolünde açıklandığı gibi saydıktan sonra, jelatini aspire edin ve hücreleri 24 saat içinde maksimum yüzde 70 kapsama alanına izin veren bir seyreltme ile kaplayın.

Hücrelerin 24 saat boyunca yüzde beş Karbondioksit ve 37 santigrat derecede yapışmasına izin verin. Hücrelerin mikroskop altında birleşme, hücresel morfoloji ve kontaminasyon açısından bir değerlendirmesini yapın. Ardından Konfokal Mikroskobu, floresan ışığı ve bilgisayarı açın.

Lens ısıtıcısını objektife bağlayın ve 35 dereceye ayarlayın. Kuluçka ünitesini metin protokolünde gösterildiği gibi hazırlayın. İnkübasyon ünitesini mikroskop tablasına yerleştirin ve giriş ve çıkış Karbondioksit tüpünü bağlayın.

Ana Karbondioksit vanasını açın ve Karbondioksit kontrol cihazını açın. Denetleyicinin yüzde beş Karbondioksit olarak ayarlandığını kontrol edin. Sıcaklık, CO2, pH, nem ve sterilite gibi uygun hücre kültürü koşulları, uzun süreli hücre görüntüleme için çok önemlidir.

Bu nedenle, her inkübatör için uygun şekilde test edilmesi gerekir. Sahne sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın. Kuluçka ünitesinin seçilen sıcaklığa ve Karbondioksit yüzdesine ulaşmasına izin verin.

Görüntüleme odasını ana Karbondioksit inkübatöründen alın ve odayı bir Petri Kabı içinde mikroskopi odasına taşıyın. Görüntüleme odasını özel yapım 35 milimetre çapında bir sahne tutucuya yerleştirin ve odayı özel yapım bir sızdırmazlık kapağıyla kapatın. Kuluçka ünitesini açın ve hücrelerin soğumasını önlemek için mümkün olduğunca hızlı çalışın; Kırmızı yamayı görüntüleme odasıyla değiştirin ve ardından üniteyi kapatın.

Sahne alanı ile mikroskop arasına kablo sıkışmadığından emin olun. Üniteyi 30 dakika iklimlendirmeye bırakın. Ardından, yazılımı açın ve lazeri açın.

Dosya sekmesi altındaki Yeni'ye tıklayarak yeni bir veritabanı oluşturun. Veritabanını adlandırın ve kaydedin. Edin" sekmesi altındaki "Yapılandırma'ya tıklayarak yapılandırmayı ayarlayın.

Tek bir floroforu değerlendirmek için Kanal Modunu "ve Tek Parça"yı seçin. Birkaç florofor için "Multi Track"i seçin. Ardından, floroforla eşleşen uygun bant geçmiş filtreleri seçin.

Parçalardan birinde parlak alan kanalını seçin. Bileşiklerin floresan sinyali ile görüntünün kalitesi arasında taramadan ödün verilir. Aşırı maruz kalma, foto ağartma, sinyal gürültü oranı, hücrelerin kalitesi, eklenen bileşiklerin tümü sonuçları etkileyebilecek faktörlerdir ve uygun şekilde test edilmesi gerekir.

Scan (Tara) seçeneğine tıklayarak tarama kontrolünü ayarlayın. Ardından çerçeve boyutunu, tarama hızını, tarama yönünü ve tarama ortalamasını ayarlamak için Mod"a tıklayın. İğne Deliğini, Kazanç ve Ofseti ve lazer gücünü ayarlamak için Kanallar'a tıklayın.

Konfigürasyon sekmesinde "Config" seçeneğine tıklayarak bu ayarları kaydedin ve Configuration veritabanına kaydedin. Makro sekmesinde "Muti TimeX"e tıklayarak hızlandırılmış çekimi ayarlayın. Tek Konum'u tıklatın.

Tek Parça'ya tıklayarak kaydedilen yapılandırmayı uygulayın" ve Yapılandırma veritabanında gerekli yapılandırmaya gidin. Zaman aralığını ve tarama sayısını ayarlayın. Load Conf'a tıklayarak yapılandırmayı yükleyin.

Temel Dosya Adı'nda zaman atlamalı çekimi adlandırın ve zaman atlamalı çekimi kaydetmek için Görüntü Veri Tabanı'na tıklayarak veritabanını seçin. Geçici Görüntü Klasörü"ne tıklayarak geçici bir klasör ayarlayın"Ardından, kuluçka ünitesini açın, görüntüleme halkasını kaldırın, hedefe bir damla Daldırma Yağı ekleyin ve üniteyi mümkün olduğunca hızlı kapatın. Görüntüleme odasına odaklanın ve bir konum seçin.

Laminer Akış Kabininde, mililitre ilaç başına beş mikrogram konsantrasyonda serbest ilaç veya nanopartikülleri veya Hücre Kültürü ortamında 0.05 mikromol lipid seyreltin. İlaç veya nanopartiküller steril değilse 0.22 mikronluk bir Şırınga Filtresinden süzün. Kuluçka odasını açın ve tavan kapağını kaldırın.

Daha sonra, ortamı hücrelerden çıkarın, bir mililitre seyreltilmiş ilaç veya nanopartikül ekleyin ve üniteyi mümkün olduğunca hızlı bir şekilde kapatın. Hücrelere odaklanın ve Tarama Kontrolü sekmesindeki Tek"e tıklayarak hızlı bir tarama yapın. Parlak alan görüntüsü odaklanmış hücreleri gösterdiğinde, Multi TimeX Makrosunda "Başlangıç Zamanı"na tıklayarak hızlandırılmış çekimi başlatın.

Tekrar sayısı ve kalan süre Makroda ve görüntülerde gösterilir. Hücrelerin hala odakta olup olmadığını görmek için düzenli olarak kontrol edin veya Otomatik Odaklamayı kullanın. Program, hızlandırılmış çekimi otomatik olarak veritabanına kaydeder.

Program çalışırken veritabanını kapatmayın. Bu, serbest Doksorubisine maruz kalan hücrelerin üç saatlik hızlandırılmış bir süresidir. Kırmızı floresan Doksorubisin'in çekirdeğe alımını ve hemen translokasyonunu gözlemleyin.

Burada, hücreler kapsüllenmiş Doksorubisin ile üç saat inkübe edilir. Floresan sinyali çok daha düşüktür ve sitoplazmada bulunur. Sinyal çekirdekte neredeyse hiç görünmez.

Bu zaman atlamalı filmleri Görüntü J'ye taşıyarak, çekirdeğin etrafına ilgi çekici bir bölge çizilebilir ve piksel yoğunluğu ölçülebilir. Burada sunulan grafik, serbest veya kapsüllenmiş Doksorubisin ile inkübe edilen hücrelerde zaman içinde nükleer alımdaki farkı göstermektedir. Burada gösterilen, kırmızı ile gösterilen kapsüllenmiş Doksorubisin ile inkübe edilmiş hücrelerdir.

Mor sinyal taşıyıcıyı temsil eder ve Lizozomlar yeşil bir Canlı Hücre işaretleyicisi ile boyanır. Her iki hücre tipinin karşılaştırılması, Lizozomal dağılımda bir fark olduğunu gösterir. B16BL6 hücrelerindeki lizozomlar sitoplazma boyunca dağılmıştır.

Oysa BLM hücrelerindeki Lizozomlar çekirdeğe yakın bulunur. Bununla birlikte, her iki hücre hattı da Lizozomlarda kırmızı ve mor sinyalin yüksek bir kolokalizasyonunu gösterir, bu da Doksorubisin ve taşıyıcısının bu organellerde sıkışıp kaldığını gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, Canlı Hücrelerde Kemoterapötik Ajanların ve diğer floresan belirteçlerin alımını birkaç saat hatta günler boyunca nasıl görüntüleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.