Vitro Lipid tabanlı nano tanecikleri tarafından canlı hücre Chemotherapeutics keşfetmek için Imaging teslim kullanma

Bu canlı hücre görüntüleme tekniğinin genel amacı, fiksasyona gerek duymadan kemoterapötik ajanların alımı ve dağılımı gibi hücresel süreçleri takip etmektir. Bu yöntemler, kanser alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, serbest formdaki veya nanopartiküllere kapsüllenmiş kemoterapötik ajanların tümör hücreleri tarafından nasıl alındığı gibi. Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücrelerin görüntülenmesi sayesinde fiksasyon artefaktlarının önlenmesi ve gerçek zamanlı dinamik değerlendirmeye olanak sağlanmasıdır.

Bu yöntemle ilgili ilk fikri, fiksasyon sırasında nanopartiküllerin parçalandığını ve bunun ilaç iletiminin yanlış yorumlanmasına yol açtığını gözlemlediğimizde edindik. Görüntüleme haznesini kurmak için, haznenin alt kısmına 25 millimeter bir lam yerleştirin ve üst kısmı alt kısma vidalayın. Cam kırılabileceği için çok fazla sıkmayın.

Tüm hazneyi otoklavlayın. Hücreleri ekmek için, görüntüleme haznesini sterilizasyon torbasından Laminar Akışlı Kabin içinde çıkarın. Hazneyi dikkatlice sıkın ve bir Petri Kabı içine yerleştirin.

Görüntüleme odasının camını, 37 °C'de ve %5 Karbondioksit ortamında 20 dakika boyunca 1 mL %0,1 steril jelatin ile kaplayın. Hücre kültürü flasklarındaki besiyerini uzaklaştırdıktan sonra, hücreleri bir kez 1x PBS ile yıkayın ve %0,25 Trypsin kullanarak hücreleri ayırın. Hücre Kültürü besiyeri ekleyerek Trypsin'i inaktive edin.

Ardından, hücreleri toplayın ve beş dakika boyunca 1.100 G'de santrifüjleyin. Çökeleşmiş hücreleri beş mililitre Hücre Kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Metin protokolünde açıklandığı şekilde hücreleri saydıktan sonra, jelatini aspire edin ve hücreleri 24 saat içinde maksimum yüzde 70 kaplama sağlayacak bir dilüsyonla plaklara ekleyin.

Hücrelerin %5 Karbondioksit ve 37 °C'de 24 saat boyunca yapışmasına izin verin. Hücrelerin konfluensini, hücresel morfolojisini ve kontaminasyon durumunu bir mikroskop altında değerlendirin. Ardından; Konfokal Mikroskobu, floresan ışığını ve bilgisayarı açın.

Lens ısıtıcısını objektife bağlayın ve 35 dereceye ayarlayın. İnkübasyon ünitesini metin protokolünde gösterildiği gibi hazırlayın. İnkübasyon ünitesini mikroskop tablasına yerleştirin ve Karbondioksit giriş ve çıkış tüplerini bağlayın.

Ana Karbondioksit vanasını açın ve Karbondioksit kontrol cihazını çalıştırın. Kontrol cihazının yüzde beş Karbondioksit değerine ayarlandığını kontrol edin. Sıcaklık, CO2, pH, nem ve sterilite gibi uygun hücre kültürü koşulları, uzun süreli hücre görüntüleme için kritik öneme sahiptir.

Bu nedenle, her bir inkübatörün uygun şekilde test edilmesi gerekir. Sahne sıcaklığını 37 °C olarak ayarlayın. İnkübasyon ünitesinin seçilen sıcaklığa ve Karbondioksit yüzdesine ulaşmasını bekleyin.

Görüntüleme haznesini ana Karbondioksit inkübatöründen alın ve hazneyi bir Petri kabı içerisinde mikroskopi odasına taşıyın. Görüntüleme haznesini 35 milimetre çapındaki özel yapım bir sahne tutucuya yerleştirin ve hazneyi özel yapım bir sızdırmaz kapakla kapatın. Hücrelerin soğumasını önlemek için mümkün olduğunca hızlı çalışarak inkübasyon ünitesini açın; kırmızı yamayı görüntüleme haznesiyle değiştirin ve ardından üniteyi kapatın.

Sahne ile mikroskop arasında herhangi bir kablonun sıkışmadığından emin olun. Cihazın 30 dakika boyunca aklimatize olmasını bekleyin. Ardından, yazılımı açın ve lazeri çalıştırın.

Dosya sekmesi altındaki "Yeni"ye tıklayarak yeni bir veri tabanı oluşturun. Veri tabanını adlandırın ve kaydedin. Edinme sekmesi altındaki "Yapılandırma"ya tıklayarak konfigürasyonu ayarlayın.

Tek bir floroforu değerlendirmek için "Kanal Modu" ve "Tek İz" seçeneklerini belirleyin. Birden fazla florofor için "Çoklu İz" seçeneğini belirleyin. Ardından, florofora uygun bant-geçiren filtreleri seçin.

Kayıtlardan birinde aydınlık alan kanalını seçin. Tarama işlemi, bileşiklerin floresan sinyali ile görüntü kalitesi arasında bir denge gerektirir. Aşırı pozlama, fotobeyazlama, sinyal-gürültü oranı, hücrelerin kalitesi ve eklenen bileşiklerin tamamı sonuçları etkileyebilecek faktörlerdir ve uygun şekilde test edilmeleri gerekir.

Kazanım (Acquire) sekmesi altındaki "Scan" (Tarama) seçeneğine tıklayarak tarama kontrolünü ayarlayın. Ardından çerçeve boyutunu, tarama hızını, tarama yönünü ve tarama ortalamasını ayarlamak için "Mode" (Mod) seçeneğine tıklayın. Pinhole (İğne deliği), Gain (Kazanç) ve Offset (Kayma) ile lazer gücünü ayarlamak için "Channels" (Kanallar) seçeneğine tıklayın.

Yapılandırma sekmesindeki "Config"e tıklayarak bu ayarları kaydedin ve bunları Yapılandırma veritabanına kaydedin. Makro sekmesindeki "Muti TimeX"e tıklayarak zaman atlamalı çekimi ayarlayın. Tek Konum'a tıklayın.

"Single Track" seçeneğine tıklayarak kaydedilen konfigürasyonu uygulayın ve Konfigürasyon veri tabanında ilgili konfigürasyona gidin. Zaman aralığını ve tarama sayısını ayarlayın. "Load Conf." düğmesine tıklayarak konfigürasyonu yükleyin.

Temel Dosya Adı kısmında time-lapse'ı adlandırın ve time-lapse'ı kaydetmek için "Görüntü Veri Tabanı"na tıklayarak veri tabanını seçin. "Geçici Görüntü Klasörü"ne tıklayarak geçici bir klasör belirleyin. Ardından inkübasyon ünitesini açın, görüntüleme halkasını kaldırın, objektife bir damla İmmersiyon Yağı ekleyin ve üniteyi mümkün olan en kısa sürede kapatın. Odaklama yapın ve görüntüleme haznesinde bir konum seçin.

Laminar Akış Kabininde, serbest ilacı veya nanopartikülleri, hücre kültür ortamında mililitre başına beş mikrogram ilaç veya 0,05 mikromol lipid konsantrasyonunda seyreltin. İlaç veya nanopartiküller steril değilse, 0,22 mikronluk bir Şırınga Filtresi üzerinden filtreleyin. İnkübasyon odasını açın ve tavan kapağını kaldırın.

Ardından, besiyerini hücrelerden uzaklaştırın, 1 mL seyreltilmiş ilaç veya nanopartikül ekleyin ve ünitenin kapağını mümkün olduğunca hızlıca kapatın. Hücrelere odaklanın ve Scan Control sekmesindeki "Single" seçeneğine tıklayarak hızlı bir tarama yapın. Aydınlık alan görüntüsü odaklanmış hücreleri gösterdiğinde, Multi TimeX Macro'daki "Start Time" seçeneğine tıklayarak zaman atlamalı görüntüleme işlemini başlatın.

Tekrar sayısı ve kalan süre Makro'da ve görüntülerde gösterilmektedir. Hücrelerin hâlâ odak noktasında olup olmadığını düzenli olarak kontrol edin veya Otomatik Odaklama (Autofocus) özelliğini kullanın. Program, zaman atımlı çekimi otomatik olarak veri tabanına kaydeder.

Program çalışırken veri tabanını kapatmayın. Bu, serbest Doksorubisin'e maruz bırakılan hücrelerin üç saatlik bir time-lapse görüntüsüdür. Kırmızı floresanlı Doksorubisin'in hücre içine alınışını ve çekirdeğe anlık translokasyonunu gözlemleyin.

Burada, hücreler enkapsüle edilmiş Doksorubisin ile üç saat boyunca inkübe edilmiştir. Floresan sinyali çok daha düşüktür ve sitoplazmada yer almaktadır. Sinyal çekirdekte neredeyse hiç görülmemektedir.

Bu zamanraflatımlı videolar Image J'ye aktarıldığında, çekirdek çevresine bir ilgi alanı (region of interest) çizilebilir ve piksel yoğunluğu ölçülebilir. Burada sunulan grafik, serbest veya enkapsüle edilmiş Doksorubisin ile inkübe edilen hücrelerde zamanla meydana gelen nükleer alım farkını göstermektedir. Burada, enkapsüle edilmiş Doksorubisin ile inkübe edilen hücreler kırmızı ile gösterilmiştir.

Mor sinyal taşıyıcıyı temsil etmektedir ve lizozomlar yeşil bir canlı hücre markeri ile boyanmıştır. Her iki hücre tipinin karşılaştırılması, lizozomal dağılımda bir fark olduğunu göstermektedir. B16BL6 hücrelerindeki lizozomlar sitoplazmaya yayılmış durumdadır.

Buna karşılık, BLM hücrelerindeki lizozomlar çekirdeğe yakın konumdadır. Bununla birlikte, her iki hücre hattı da lizozomlarda kırmızı ve mor sinyalin yüksek düzeyde kolokalizasyon göstermesi, doksorubisin ve taşıyıcısının bu organellerde hapsolduğunu belirtmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, kemoterapötik ajanların ve diğer floresan markörlerin canlı hücrelerdeki alımının birkaç saat veya gün boyunca nasıl görüntüleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.