Genetik Haçlar

Genetik çaprazlama, iki bireyin kasıtlı olarak çiftleşmesidir ve bu da yavrulardaki genetik materyalin kombinasyonu ile sonuçlanır. Melezlemeler, bitkiler, mayalar, sinekler ve fareler dahil olmak üzere birçok model sistemde gerçekleştirilebilir ve genetik süreçleri incelemek veya yeni özelliklere sahip organizmalar oluşturmak için kullanılabilir.

Bu video, genetik çaprazlamaların bazı ilkelerini kapsayacak, tetrad analizi olarak bilinen çaprazlamaları gerçekleştirmek için bir yöntemi inceleyecek ve bu tekniğin çeşitli uygulamalarını tartışacaktır.

İlk olarak, genetik çaprazlamaları mümkün kılan kalıtımın temel ilkelerini tanıtalım.

Bir organizmanın fenotipi veya özelliklerin bileşimi, genetik yapısı veya genotipinden etkilenir. Eşeyli üreyen organizmaların çoğunda, ebeveyn nesil, her farklı kromozomun bir kopyasına sahip olan haploid gamet hücreleri üretir. Bunlar daha sonra çiftleşme sırasında birleşerek her kromozomun iki homolog kopyası olan bir diploid yavru üretir. Her iki kromozom da aynı aleli veya bir genin varyant formunu içeriyorsa, organizma o genetik lokusta "homozigot"tur; aksi takdirde, "heterozigot"tur.

Döngüyü yeniden başlatmak için, diploid organizma tekrar mayoz bölünme yoluyla haploid gametler üretir. Bu işlem sırasında, iki homolog kromozom, eşdeğer dizilerin bitlerinin çift arasında değiş tokuş edildiği "rekombinasyona" uğrar. Bu süreç, her bir yavru tarafından miras alınan ebeveyn alellerini karıştırır ve böylece genetik çeşitliliklerini arttırır.

Sistematik genetik çaprazlamaları gerçekleştiren ilk insanlardan biri "genetiğin babası" Gregor Mendel'di. Kolayca manipüle edilen bezelye bitkisini kullanarak ve tutarlı kalıtım modellerine sahip bir dizi özelliği inceleyerek Mendel, genetiğin temelini oluşturacak üç temel kalıtım yasasını türetebildi.

Mendel'in ilk yasası, iki homozigot bireyin ilk veya F1 neslinin heterozigot yavrularının yalnızca bir ebeveynin fenotipine sahip olacağını belirten Tekdüzelik Yasasıdır. Bu fenotipi oluşturan alel "baskın", "gizli" alel ise "çekinik" olarak adlandırılır. Artık baskınlık ilişkilerinin, heterozigotların harmanlanmış bir fenotipi ifade ettiği eksik baskınlık gibi durumlarla genellikle daha az belirgin olduğunu biliyoruz; ve her iki fenotipin de görüntülendiği ortak baskınlık.

Ayrılma Yasası, her gamete rastgele bir alel atandığını belirtir. Mendel, heterozigot F1 bireylerinin kendi kendine döllenmesinden elde edilen F2 yavrularının 3:1 fenotipik bir oran gösterdiğini, ancak fenotipik olarak baskın bireylerden ikisinin aslında heterozigot olduğunu gözlemleyerek, iki ebeveyn alelinin ayrı ayrı kalıtsal olması gerektiği sonucuna vardı. Bugün, mayoz bölünme sırasında, diploid ebeveynin iki homolog kromozomunun rastgele haploid yavru hücrelere bölündüğü ve her biri iki alelden birini miras aldığı zaman ayrışmanın meydana geldiğini biliyoruz.

Mendel'in üçüncü yasası, bireysel özelliklerin bağımsız olarak miras alındığını belirten Bağımsız Çeşitlilik Yasasıdır. Artık mutlak bağımsızlığın yalnızca mayoz bölünme sırasında yavru hücrelere bağımsız olarak dağıtılan haploid setindeki ayrı kromozomlar üzerindeki genler tarafından kontrol edilen özellikler için var olduğunu biliyoruz. Aynı kromozom üzerindeki iki gen için, aralarındaki mesafe, farklı homolog kromozomlara yeniden birleştirilme olasılıkları ve buna bağlı olarak, aynı yavruda birlikte kalıtılma olasılıkları ile ters orantılıdır. Bu nedenle, bir diploid organizmanın dört mayotik ürününü analiz etmek, bilim adamlarının genlerin yerini haritalamaları için bir yol sağlar.

Genetik çaprazlamaların arkasındaki ilkeleri gözden geçirdikten sonra, tetrad analizi için bir protokole göz atalım.

Bu teknik tipik olarak, bu türlerde tek bir hücre gövdesi içinde bir "tetrad" olarak bir arada kalan dört haploid mayotik ürünü veya sporu incelemek için maya gibi belirli tek hücreli alglere veya mantarlara uygulanır.

Mayada tetrad analizi yapmak için, istenen suşlar önce uygun besiyerlerinde büyütülür. Tek tek kolonilerden elde edilen maya hücrelerinin, örneğin her bir suşu yeni bir plaka üzerinde çapraz bir düzende çizerek çiftleşmesine izin verilir. Bu plaka daha sonra çaprazın sadece diploid ürününü izole etmek için seçici ortam üzerine çoğaltılır.

Seçilen diploid hücreler, sporülasyonu ve tetrad oluşumunu indüklemek için besin açısından fakir ortamlarda büyütülür. Sporların tetradlarını tutan yapılar olan asci, enzim zimolaz içeren çözeltilerde sindirilir. Sindirimi takiben, bireysel asci, bir tetrad diseksiyon mikroskobu kullanılarak manipüle edilir. Bir büyüme plakası üzerinde belirli yerlerde düzenlenirler ve tek tek sporları serbest bırakmak için bozulurlar. Bunlar, her sporun daha fazla analiz edilebilecek ayrı bir koloni oluşturacağı ızgara benzeri bir modele yerleştirilebilir.

Artık tetrad analizinin nasıl yapıldığını bildiğinize göre, bu tekniğin birçok uygulamasından veya modifikasyonundan bazılarını inceleyelim.

Tetradların manuel diseksiyonu zaman alıcıdır ve araştırmacılar, tetradların barkod özellikli dizilimi gibi yüksek verimli alternatifler geliştirdiler. Bu yöntemde, bir maya çaprazlamasının diploid dölleri, her biri her döl için bir tanımlayıcı görevi gören "barkod" olarak bilinen kısa, benzersiz bir dizi içeren bir plazmit kütüphanesi ile dönüştürüldü. Plazmitler ayrıca GFP'yi eksprese eder, bu da maya asci'nin akış sitometrisi yoluyla seçilmesine ve agar plakalarına sıralanmasına izin verir. Asci, plakalar üzerinde topluca parçalandı ve sporların küçük koloniler halinde büyümesine izin verildi. Koloniler daha sonra genotipleme için rastgele 96 oyuklu plakalara dağıtıldı. Benzersiz dizi barkodu, araştırmacıların her bir tetradın sporlarından ortaya çıkan dört koloniyi gruplandırmasına olanak tanır.

Genetik çaprazlamalar, çok sayıda gen delesyonu olan maya hücreleri üretmek için de kullanılabilir. Yeşil canavar sürecinde, GFP ile işaretlenmiş farklı gen delesyonlarını taşıyan haploid mutant maya çiftleştirilir ve sporlanır. Bazıları her iki ebeveynden de miras alınan delesyonları taşıyan bu haploid döller, GFP yoğunluğunun belirli bir maya suşunda bulunan delesyonların sayısı ile ilişkili olduğu gösterilen floresanla aktive edilen akış sitometrisi ile sınıflandırılır. Seçilen bu hücreler daha sonra kültürlendi ve yeniden çaprazlandı. Bu döngünün tekrarlanması, çok sayıda delesyon içeren maya suşları üretti.

Son olarak, genetik çaprazlamalar, sıtmaya neden olan hücre içi parazit Plasmodium gibi birçok model sistemde kullanılmak üzere uyarlanmıştır. Parazit sadece diğer hücreler içinde çoğalabildiğinden, tüm geçiş adımları sırasıyla parazitin doğal konakçısı ve vektörü olan farelerde veya sivrisineklerde gerçekleştirilmelidir. Burada, fareler kan paraziti aşamasında iki benzersiz Plasmodium suşu ile enfekte edildi. Parazitler daha sonra kanla besleme yoluyla sivrisineklere aktarıldı ve içeri girdikten sonra diploid zigotlar oluşturmak için döllenecek gametlere olgunlaştılar. Olgun sporozoitler daha sonra sivrisinekten toplandı ve saf fareleri enfekte etmek için kullanıldı, burada parazitler, ilgilenilen çapraz dölleri izole etmek için çoğaltıldı.

Az önce JoVE'nin genetik çaprazlamalarla ilgili videosunu izlediniz. Bu videoda kalıtımın ilkelerini, bazı organizmalardaki genetik çaprazlamaların tetrad diseksiyonu ile nasıl analiz edilebileceğini ve birkaç güncel uygulamayı tanıttık. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!