Sütunlar ve Katmanlar dendritik Morfoloji Analizi

Bu protokolün genel amacı, dendrik paternleri karakterize etmek, morfolojiye dayalı hücre tiplerini belirlemek ve mutantları tanımlamak için yetişkin drosophila medulla nöronlarının sütunlar ve katmanlar halinde dendrik yönlendirmesini analiz etmektir. Bu yöntem, beyin devrelerinin haritalandırılması ve dendritin kablolama mekanizmasının anlaşılması da dahil olmak üzere sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, dendritik özellikleri üç boyutlu uzayda geçirmesi ve böylece dendritik kablolama mantığı ve fonksiyonlarının anlaşılmasını geliştirmesidir.

Bu prosedürün amacı, iki ortogonal, yatay ve önden oryantasyonda ilgilenilen nöronların iki görüntü yığınını elde etmektir. Standart teknikleri kullanarak, diseke edilmiş sinek beyinlerini tavşan anti-GFP ve fotoreseptör aksonları primer antikorlarını etiketleyen bir antikor ile boyayın. Daha sonra birincil antikorları floresan ikincil antikorlarla etiketleyin ve beyni% 70 gliserol ve 1X PBS'de temizleyin.

Beyni yatay yönde monte etmek için, gliserol temizlenmiş bir beyni, mikroskop lamı üzerinde merkezi olarak biriktirilen 20 mikrolitrelik bir antifade montaj ortamına aktarın. Daha sonra bir lamel üzerine, lamellerin beyni ezmesini önlemek için dört köşeye küçük kil parçaları yapıştırın. Şimdi bir diseksiyon mikroskobu altında, beyinleri ventral yukarı pozisyonda konumlandırın.

Beyin örneğinin yönünü belirlemek için beynin dışbükey dorsal yüzeyini bir dönüm noktası olarak kullanın. Bu, nöronun yatay bir görünümünü sağlayacaktır. Ardından lamel takın.

İdeal olarak GaAsP dedektörleri ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak, yüksek sayısal diyafram açıklığı objektifi ve 2,5 dijital yakınlaştırma ile yatay görünüm görüntü yığınını elde edin. En az 180 optik bölüm edinin, 512 kare piksele ve 2 mikronluk bir adım boyutuna sahip olun. İlk görüntü yığınını aldıktan sonra, lamel slayttan çıkarın ve beyni önden bir görünüm sağlayacak şekilde ön yukarı konumda yeniden konumlandırın.

Daha sonra aynı tekniği kullanarak, yatay görünümde görüntülenen aynı nöronların önden görünümünün yeni bir görüntü yığınını oluşturun. Medulla neuropal'a göre ilgilenilen nöronun konumunu da kaydettiğinizden emin olun. Aynı nöronları tanımlamak, daha düşük büyütme altında mümkündür.

Bununla birlikte, doku derin olduğu için sinyal kaybolursa, beyninizin ventral yarısını görüntülemeniz yeterlidir. Ayrıca, görüntü yığınlarını inceleyerek görüntü alırken örneğin hareket edip etmediğini kontrol edin. Görüntü de evrişim ve görüntü birleştirme metin protokolünde detaylandırılmıştır.

Bu prosedürün amacı, nöritleri izlemek ve kayıt için referans noktaları atamaktır. Önce yeniden birleştirilen görüntü dosyasını açın. Ardından düzenlemeye gidin.

Ardından ekran ayarını gösterin ve kırmızı olan fotoreseptör kanalını kapatın. Ardından, görüntüyü aşma modunda görselleştirin. Bilgisayarda bir stereograf sistemi varsa, stereoyu açın ve 3D görüntüleri görselleştirmek için dörtlü arabellek modunu kullanın.

Yeni filamentler ekleyin, aşmaya gidin, ardından filamentlere gidin ve otomatik oluşturmayı atla, manuel olarak düzenleyin etiketli sekmeye tıklayın. Ardından çizim sekmesine tıklayın ve Otomatik Derinlik'i seçin. Ardından, ayarları seçin.

Çizgi seçeneğini değiştirin ve daha iyi görselleştirme için uygun piksel numarasını girin. Ardından dendritleri, başlangıç noktasını ve dallanma noktasını göster'i değiştirin ve oluşturma kalitesini %100 olarak ayarlayın Şimdi çizim sekmesini seçin ve nöritleri izlemeye başlayın. Akson ile başlayın, ardından dendritlere geçin.

Trans medulla nöronlarının akson ve dendritlerinin ayırt edilmesi kolay olmalıdır. Nöritleri izledikten sonra ayarlara geri dönün ve hem başlangıç noktasını hem de dallanma noktasını değiştirin. Ardından aşmaya gidin, ardından dışa aktarın.

Nesneyi seçin ve filamenti bir mucit dosyası olarak kaydedin. Bir sonraki adım, referans noktaları atamaktır. Başlamak için ekran ayarını göster'i seçin ve her iki görüntüleme kanalını da açın.

Sonra aşmaya, ardından ölçüme gidin. Ve düzenle sekmesi altında, belirli bir kanalı değiştirin ve bu durumda fotoreseptör kanalını seçin. Şimdi üst katman için referans noktaları atayın.

Aşmayı, ardından ölçüm noktalarını seçin ve m1 katmanının başlangıcını üst katman olarak işaretleyin. Nokta atamasını kolaylaştırmak için kırpma düzlemi işlevini kullanın. Noktaların sırası ekvator, ön ekvator, ön, ön ventral, ventral, posterior ventral, posterior, posterior ekvator ve merkezdir.

Merkez fotoreseptörü bulmak için, en dendritik süreçlerle ilişkili olandır. Ardından, aynı tekniği kullanarak R8 ve R7 katmanları için referans noktalarını atayın. Her bir referans noktası kümesini tanımladıktan sonra, koordinatları dışa aktarın.

İstatistikleri, ardından ayrıntılı, belirli değerleri ve konumu seçin. Ardından, sekme ekranında dışa aktarma istatistiklerini dosyaya seçin ve koordinatları bir CSV dosyası olarak kaydedin. Ardından, üç CSV dosyasını bir elektronik tablo düzenleyicisinde açın.

27 referans noktasının koordinatlarını kopyalayıp top, R8 ve ardından R7 sırasını izleyerek yeni bir dosyaya yapıştırın. Dendritik dallanma ve sonlandırma frekanslarının hesaplanmasında rijit cisim ve TPS doğrusal olmayan kayıt standardizasyonu için sağ ventral konfigürasyona yönelik metin protokolünü takip ederek ilerleyin. Sonuç olarak, veriler çeşitli bilgilendirici çizimler yapmak için kullanılır. Burada sunulan çift görünümlü görüntüleme prosedürü kullanılarak, seyrek olarak işaretlenmiş tm 20 nöronları içeren bir sinek beyni iki ortogonal yönde görüntülendi.

Görüntü rekombinasyonu eksenel çözünürlüğü artırır. Yeniden birleştirilen görüntü, yatay görünüm ve önden görünüm görüntülerinden daha iyi bir çözünürlüğe sahiptir. 3D modellere danışıldıktan sonra, 15 tm 20 nörondan dendritik izler toplandı ve 15 tm 2 nörondan dendrik izlerle karşılaştırıldı.

Bu nöronların dallanma ve sonlanma olasılıkları analiz edildi. Her iki tip de 4 mikrondan küçük segmentler için benzerdi. Dendritik sonlandırmanın katmana özgü analizi, iki nöron tipinin farklı katmana özgü şekillerde dağıldığını gösterdi.

Tm 2 dendritleri m2 ve m5 cinsinden girdileri alır. tm 20 dendrit ise m1 ila m3 katmanında sonlanır. Düzlemsel analiz, tm 2 dendritlerinin öne doğru çıkıntı yaptığını, tm 20 dendritlerin ise arkaya doğru çıkıntı yaptığını göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, iki konfokal görüntünüzü nasıl elde edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Görüntüleme dosyalarındaki çalışma işaretlerinizi okuyun ve bu görüntülerden dendritik özellikleri çıkarın. Bu prosedürü denerken, konfokal görüntülemeden önce numuneyi düzgün bir şekilde işaretlemek önemlidir.

Görüntüleme sırasında numune hareket ederse görüntüleme kombinasyonu başarısız olacağından.