Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

Bu deneyin genel amacı, özelleştirilmiş bir mikroakışkan cihaz üretmek ve bunu tek bir maya hücresinin yaşam süresini ve hücresel fenotiplerini ölçmek için kullanmaktır. Bu yöntem, maya yaşlanması alanındaki bazı temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, ana hücreler neden yaşlanır ve ölür ve hücresel homeostazın kaybına, nihayetinde ise hücre yaşlanmasına ve ölümüne yol açan erken moleküler olaylar nelerdir? Bu tekniğin temel avantajı, ana hücreleri, yaşam sürelerini ve çeşitli moleküler belirteçleri aynı anda takip edebilmemizdir; böylece yaşam süresiyle korele olan moleküler olayları araştırabiliriz.

Bu yöntem maya yaşlanması hakkında bilgi sağlayabilse de, birçok nesil boyunca hücre kontrolü gerektiren katılıma karşı ikincil yanıtların izlenmesi gibi diğer alanlara da uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler zorlanacaktır çünkü mikroakışkan cihaz üretimi, hücre yükleme ve mikroskop kurulumunun başarıyla gerçekleştirilmesi çok fazla pratik gerektirir. Mikroakışkan cihazın mayalarla doğru şekilde doldurulması zor olduğu için, bu yöntemin önceden gösterilmesi kritik öneme sahiptir.

Başlamak için, ekteki metin protokolünde açıklanan standart teknikleri kullanarak cihaz için bir silikon gofret kalıbı hazırlayın. Kalıbı, özellik tarafı yukarı bakacak şekilde 15 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Kalıbı bantlarla Petri kabına sabitleyin.

Ardından, temiz bir tartım kabını teraziye yerleştirin ve teraziyi daralayın. Tartım kabına 50 gram PDMS baz dökün ve ardından beş gram PDMS kürleme ajanı ekleyin. PDMS baz ve kürleme ajanını tek kullanımlık bir pipetle karıştırın.

Tartım kabının kenarından başlayarak yavaşça içeriye doğru ilerleyin. Karışımın her yerinde küçük kabarcıklar oluşana kadar birkaç dakika boyunca iyice karıştırın. Karışımı, silikon gofret kalıbını tamamen kaplayacak şekilde Petri kabına yavaşça dökün.

Ardından, PDMS karışımındaki tüm hava kabarcıklarını gidermek için Petri kabını 10 dakika boyunca vakuma yerleştirin. Vakumdan çıkarıldığında karışımın yüzeyinde kabarcıklar kalmışsa, bunları bir pipet yardımıyla üfleyerek temizleyin. Sonrasında, düzeneği 75 °C'de iki saat boyunca fırınlayın.

Oda sıcaklığına kadar soğutulduğunda, kalıbın etrafındaki PDMS'i dikkatlice kesin ve ardından silikon gofret kalıbının yapısına herhangi bir zarar vermemeye dikkat ederek polimerize olmuş PDMS tabakasını kalıptan nazikçe soyun. PDMS tabakasını, desenli yüzeyi yukarı bakacak şekilde tezgaha yerleştirin. Her bir çipin yapısını bozmamak için kenarlardan yeterli pay bırakarak, tek kenarlı endüstriyel bir jiletle her bir çipi dikkatlice kesin.

Desenli taraf yukarı bakacak şekilde, kanalların her iki yanındaki giriş ve çıkış dairelerinden aşağıya doğru düz bir şekilde delikler açmak için bir delme kalemi kullanın. Delme kalemi iğnesini tekrar deliğe sokarak her bir deliği kontrol edin. İğnenin diğer taraftan çıktığından emin olun; bu, herhangi bir tıkanıklık olmadığını gösterir.

Ardından, üst yüzeydeki toz partiküllerini ve kalıntıları temizlemek için bandı kullanın. Bu adımı en az üç kez tekrarlayın ve tozsuz bir yüzey sağlamak için PDMS üzerinde temiz bir parça Scotch bant bırakın. Daha sonra cihazı ters çevirin ve bu prosedürü PDMS'nin karşı tarafında tekrarlayın.

Son bant parçasını bu tarafta da bırakın. Şimdi cihazın tabanı için cam bir yüzey hazırlayın. 24 mm x 30 mm boyutlarında ve 13 ile 17 mm arası kalınlıkta olan lamine cam parçasını seçin.

Yüzeyi sterilize etmek için cama %70 etanol püskürtün ve toz temizleyici ile kurulayın. Ardından, lamel camı ve PDMS'yi plastik bir plakaya aktarın. PDMS üzerindeki Scotch bandını çıkarın ve üst yüzeye temas etmeyecek şekilde, desenli tarafı yukarı bakacak şekilde plakaya yerleştirin.

Ardından plakayı bir plazma haznesine aktarın. Yüzeyleri hidrofilik hale getirmek için PDMS ve lamel camına oksijen plazma işlemi uygulayın. Daha sonra plakayı plazma haznesinden çıkarın ve PDMS'in plazma ile işlem görmüş yüzeylerini lamel camına dikkatlice bağlayın.

PDMS ile lam arasında hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Son olarak, cihazı bir fırına aktarın ve en az iki saat boyunca 75 °C'de pişirin. PDMS çip hazırlığından bir gün önce giriş ve çıkış tüplerini %70 etanol çözeltisine daldırın.

Ertesi gün beş mililitrelik bir şırıngayı otoklavlanmış suyla doldurun ve tüpü şırınganın üzerine yerleştirip suyla durulayarak her bir tüpü yıkayın. Kalıntı etanolü gidermek için yıkama adımını en az üç kez tekrarlayın. Ardından PDMS kanallarını bir optik mikroskop altında inceleyin.

10 X objektif kullanarak yapıların tutarlı ve sağlam olduğundan emin olun. Sağlam PDMS çipi, Scotch bant kullanarak mikroskop platformu üzerinde sabitleyin. Steril su ile doldurulmuş beş mililitrelik bir şırıngayı bir şırınga pompasına sabitleyin ve ilgili giriş ve çıkış tüplerini cihaza yerleştirin.

Akış hızını saatte 750 microliters olarak ayarlayın ve çipi yaklaşık 10 dakika boyunca durulayın. Hava kabarcıklarının tamamen temizlendiğinden emin olmak için kanalları izleyin. 10 dakikalık durulama sonrası kabarcıklar kalmışsa, kabarcıkları gidermek için hızı manuel olarak ayarlayın.

Hazırlanmış bir maya örneğinin bir mililitresini iki adet 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve örnekleri 3.000 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Her tüpteki süpernatantın büyük kısmını uzaklaştırın ve geri kalanı 5 mililitrelik bir örnek oluşturacak şekilde birleştirin. Maya örneği hazır olduğunda, giriş tüplerini PDMS çipinden çıkarın. Her bir giriş tüpünden hücre kültürlerini çekmeden önce, bir ila iki santimetre uzunluğunda küçük bir hava kabarcığı çekmek için şırınga pompasını manuel olarak ters yönde çalıştırın.

Ardından giriş tüpünü PDMS çipine geri yerleştirin ve hücreleri saatte 750 µL hızla yüklemek için pompayı yeniden başlatın. Şırınga pompasını 10 dakika boyunca açık bırakın ve ardından hücre yükleme ilerlemesini mikroskop altında inceleyin. Başarılı bir yükleme, askı sütunlarının %60'ından fazlasının altında hücrelerin tutulmasıyla sonuçlanacaktır.

Maya hücrelerini sürdürmek için şırıngadaki solüsyonu bir besin solüsyonuyla değiştirin ve hızı saatte 400 microliters olarak ayarlayın. Mayanın yaşam süresi fenotipi, yakalanan her bir ana hücre tarafından üretilen tomurcuk sayısı sayılarak ve Kaplan-Meier tahmincisi hesaplanarak elde edilebilir. Bu protokolü kullanarak cihaz, halihazırda yakalanmış hücrelerden tomurcuklanarak ayrılan taze yavru hücreleri sıklıkla yakalar.

Bu hücreler daha sonra, analiz sonrası görüntüleme yazılımı kullanılarak tanımlanabilen yeni ana hücrelere dönüşür. Bu yeni ana hücreler, daha doğru bir yaşam süresi ölçümü sağlar. Bu deneyde, yeni ana hücrelerin ortalama yaşam süresi yaklaşık iki nesil kadar daha uzundu.

Görüntüleme verilerinden, tomurcuk sayısının yanı sıra iki ardışık tomurcuklanma olayı arasındaki zaman aralığı da elde edilebilir. Tomurcuklanma, yaşam sürelerinin sonuna doğru önemli ölçüde yavaşlar ve bu durum, yaşlanmış hücrelerin sağlıksız durumunu gösterir. Bu prosedürü uygularken, hava kabarcıklarını önlemeye yardımcı olmak için yeni hazırlanmış bir çip kullanmayı ve gerektiğinde hücre yükleme verimliliğini artırmak için hücre konsantrasyonunu artırmayı hatırlamak önemlidir.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, maya yaşlanması alanındaki araştırmacıların yaşlanma fenotipine neden olan erken moleküler değişiklikleri keşfetmesinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, bu mikroakışkan cihazın nasıl yapılacağı ve tek hücrelerde yaşam süresini ve hücresel fenotipleri ölçmek için nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.