30 Mart 2017
Bu makalede, mikro akışkan cips üretim ve kullanım ömrü ve tek bir maya hücrelerinin hücresel fenotipleri ölçmek için mikro-akışkan deney kurulumu için optimize edilmiş bir protokol sunulur.
Bu deneyin genel amacı, özel bir mikroakışkan cihaz yapmak ve bunu tek bir maya hücresinin ömrünü ve hücresel fenotiplerini ölçmek için kullanmaktır. Bu yöntem, maya yaşlanma alanındaki bazı önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin ana hücrelerin neden yaşlandığı ve öldüğü ve hücresel homeostaz kaybına ve nihayetinde hücre yaşlanmasına ve ölümüne neden olan daha erken moleküler olaylar nelerdir? Bu tekniğin en büyük avantajı, ana hücreleri izleyebilmemiz, ömürlerini ve çeşitli moleküler belirteçleri aynı anda izleyebilmemizdir, böylece yaşam süresiyle ilişkili moleküler olayları arayabiliriz.
Bu yöntem maya yaşlanması hakkında bilgi sağlayabilse de, birçok nesil için hücre kontrolü gerektiren katılıma ikincil tepkilerin izlenmesi gibi diğer alanlara da uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü mikroakışkan cihaz üretimi, hücre yüklemesi, mikroskop kurulumu başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için çok fazla pratik gerektirir. Mikroakışkan cihazı maya ile düzgün bir şekilde yüklemek zor olduğu için bu yöntemin önceden gösterilmesi çok önemlidir.
Başlamak için, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi standart teknikleri kullanarak cihaz için bir silikon gofret kalıbı üretin. Özellikli tarafı yukarı bakacak şekilde 15 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Kalıbı Petri kabına bantlarla sabitleyin.
Daha sonra temiz bir tartı teknesini bir teraziye yerleştirin ve teraziyi yırtın. Tartı teknesine 50 gram PDMS bazı dökün ve ardından beş gram PDMS kürleme maddesi ekleyin. PDMS tabanını ve sertleştirici maddeyi tek kullanımlık bir pipetle karıştırın.
Tartı teknesinin kenarından başlayın ve yavaşça içeriye doğru hareket edin. Karışım boyunca küçük kabarcıklar oluşana kadar karışımı birkaç dakika iyice karıştırın. Karışımı yavaşça Petri kabına dökün, böylece silikon gofret kalıbını tamamen kaplar.
Ardından, PDMS karışımındaki tüm hava kabarcıklarını gidermek için Petri kabını 10 dakika boyunca vakuma koyun. Vakumdan çıkarıldıktan sonra karışımın yüzeyinde kabarcıklar kalırsa, bunları üflemek için bir pipet kullanın. Ardından, cihazı iki saat boyunca 75 santigrat derecede pişirin.
Oda sıcaklığına geri soğutulduğunda, kalıbın etrafındaki PDMS'yi dikkatlice kesin ve ardından polimerize PDMS tabakasını silikon gofret kalıbından nazikçe soyun ve gofret kalıbının yapısına herhangi bir zarar gelmesini önleyin. PDMS katmanını, desen tarafı yukarı bakacak şekilde tezgahın üzerine yerleştirin. Yapı hasarını önlemek için her bir talaşın kenarından yeterli bir kenar boşluğunu koruyarak, tek kenarlı bir endüstriyel tıraş bıçağıyla tek tek talaşı dikkatlice kesin.
Desen tarafı yukarı bakacak şekilde, kanalların her iki tarafındaki giriş ve çıkış dairelerinden düz bir şekilde delikler açmak için bir delme kalemi kullanın. Zımba kalemi iğnesini tekrar deliğe sokarak her deliği kontrol edin. İğnenin diğer taraftan çıkabildiğinden emin olun, bu da herhangi bir tıkanıklık olmadığını gösterir.
Ardından, üst yüzeydeki toz parçacıklarını ve kalıntıları temizlemek için bandı kullanın. Bu adımı en az üç kez tekrarlayın ve tozsuz bir yüzey sağlamak için PDMS üzerinde temiz bir bant parçası bırakın. Ardından cihazı ters çevirin ve bu işlemi PDMS'nin karşı bölgesinde tekrarlayın.
Bandın son parçasını da bu tarafta bırakın. Şimdi cihazın tabanı için bir cam yüzey hazırlayın. Kalınlığı 13 ila 17 milimetre arasında olan 24 milimetre x 30 milimetre kapak camı parçasını seçin.
Camın üzerine% 70 etanol püskürtün ve yüzeyi sterilize etmek için toz sökücü ile kurulayın. Ardından kapak camını ve PDMS'yi plastik bir tabağa aktarın. Scotch bandı PDMS'den çıkarın ve desen tarafı yukarı bakacak şekilde üst yüzeye temas etmeden plakaya yerleştirin.
Ardından plakayı bir plazma odasına aktarın. Yüzeyleri hidrofilik hale getirmek için PDMS'ye ve kapak camına bir oksijen plazma işlemi uygulayın. Ardından plakayı plazma odasından çıkarın ve PDMS'nin plazma ile işlenmiş yüzeylerini kapak camına dikkatlice bağlayın.
PDMS ile kapak camı arasında hava kabarcığı olmadığından emin olun. Son olarak, cihazı bir fırına aktarın ve en az iki saat boyunca 75 santigrat derecede pişirin. PDMS çip hazırlığından bir gün önce giriş ve çıkış tüplerini %70 etanol çözeltisine batırın.
Ertesi gün beş mililitrelik bir şırıngayı otoklavlanmış su ile doldurun ve tüpü şırınganın üzerine yerleştirerek ve tüpü suyla yıkayarak her tüpü yıkayın. Kalan etanolü çıkarmak için yıkama adımını en az üç kez tekrarlayın. Daha sonra PDMS kanallarını optik mikroskop altında inceleyin.
10 X'lik bir objektif kullanarak, yapıların tutarlı ve sağlam olduğundan emin olun. Sağlam PDMS çipini Scotch bant kullanarak mikroskop platformunda stabilize edin. Steril su yüklü beş mililitrelik bir şırıngayı bir şırınga pompasına sabitleyin ve ilgili giriş ve çıkış tüplerini cihaza yerleştirin.
Akış hızını saatte 750 mikrolitreye ayarlayın ve çipi yaklaşık 10 dakika durulayın. Hava kabarcıklarının yıkandığından emin olmak için kanalları izleyin. 10 dakikalık durulamadan sonra herhangi bir kabarcık kalırsa, kabarcıkları gidermek için hızı manuel olarak ayarlayın.
Hazırlanmış bir maya örneğinin bir mililitresini iki adet 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve örnekleri 3.000 kez G'de beş dakika santrifüjleyin. Maya numunesi artık hazır olduğunda, giriş tüplerini PDMS çipinden çıkarın. Her bir giriş tüpü olan bir ila iki santimetre uzunluğunda küçük bir hava kabarcığını emmek için şırınga pompasını manuel olarak ters çevirin ve ardından hücre kültürlerini emdirin.
Ardından giriş tüpünü tekrar PDMS çipine takın ve hücreleri saatte 750 mikrolitre hızında yüklemek için pompayı yeniden başlatın. Şırınga pompasını 10 dakika açık bırakın ve ardından mikroskop altında hücre yükleme ilerlemesini inceleyin. Başarılı bir yükleme, hücreleri askıya alma direğinin %60'ından fazlasının altına hapsedecektir.
Maya hücrelerini korumak için, şırıngadaki çözeltiyi bir beslenme çözeltisine geçirin ve hızı saatte 400 mikrolitreye ayarlayın. Mayanın yaşam süresi fenotipi, sıkışan her bir ana hücre tarafından üretilen tomurcuk sayısını sayarak ve Kaplan-Meier tahmincisi tahmin edilerek elde edilebilir. Bu protokolü kullanarak, cihaz sık sık zaten hapsolmuş hücrelerden tomurcuklanan taze yavru hücreleri yakalar.
Bu hücreler daha sonra aşağı akış görüntü analiz yazılımı kullanılarak tanımlanabilen taze ana hücrelere dönüşür. Bu taze ana hücreler daha doğru bir yaşam süresi ölçümü sağlar. Bu deneyde, taze ana hücrelerin ortalama ömrü yaklaşık iki nesil kadar biraz daha uzundu.
Tomurcuk sayısına ek olarak, iki ardışık tomurcuklanma olayı arasındaki zaman aralığı görüntüleme verilerinden çıkarılabilir. Tomurcuklanma, ömürlerinin sonuna doğru önemli ölçüde yavaşlar ve bu yaşlı hücrelerin sağlıksız durumunu gösterir. Bu prosedürü denerken, hem kabarcıkları önlemeye yardımcı olmak için yeni yapılmış bir çip kullanmayı hem de gerektiğinde hücre yükleme verimliliğini artırmak için hücre konsantrasyonunu artırmayı unutmamak önemlidir.
Geliştirilmesinden sonra bu teknik, maya yaşlanması alanındaki araştırmacıların yaşlanma fenotipine neden olan erken moleküler değişiklikleri keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bu mikroakışkan cihazın nasıl yapılacağını ve tek hücrelerde yaşam süresini ve hücresel fenotipleri ölçmek için nasıl kullanılacağını iyi anlamalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Bu makale, tek bir maya hücresinin ömrünü ve hücresel fenotiplerin ölçümü için özel mikroakışkan cihazların oluşturulmasına yönelik bir protokol sunar. Bu yöntem, maya yaşlanma alanındaki önemli soruları, özellikle ana hücrelerin yaşlanma süreçleriyle ilgili olarak ele almayı amaçlamaktadır.
This microfluidic approach enables high-resolution, longitudinal tracking of single-cell aging dynamics, providing mechanistic insights into cellular homeostasis loss that can inform target validation in aging-related pathways. By correlating molecular markers with lifespan outcomes in a controlled microenvironment, the method supports predictive confidence in early-stage hypothesis testing for conserved longevity mechanisms. Its scalability across strains and conditions positions it as a reusable discovery platform for de-risking therapeutic targets in age-associated diseases.
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven aging research that informs lead identification through phenotypic anchoring of molecular targets.