Name: Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Öğrenin, mikroakışkan aygıtlar kullanarak tek maya hücrelerinin ömrünü ve hücresel fenotiplerini nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, anne hücrelerin yaşlanma süreçlerini ve moleküler belirteçleri izlemek için değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma NIH Grant AG043080 ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC), No. 11434001 tarafından desteklenmiştir. El yazmasını düzelttiği için Lucas Waldburger'e teşekkür ederiz.

1. Silikon Gofret Kalıp İmalat NOT: Işık maskesi AutoCAD yazılımı ile tasarlandı ve ticari bir firma tarafından üretilmektedir. Bu tasarım farklı desenler (üç kat içerir <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">Ek İçerik 1</a> ). Birinci, ikinci ve üçüncü tabakaların yükseklikleri sırasıyla yaklaşık 4 um, 10 um ve 50 um olan. Silikon gofret kalıp yumuşak litografi 9, 10 kullanılarak photomask oluşturuldu. <ol><li> 10 dk su buharı buharlaşması için 200 ° C&#39;da bir silikon gofret pişiriniz. Spin kat negatif fotorezist SU-8 silikon gofret üzerine. Not: Spin kat SU-8 3005, 30 ilk bir tabaka oluşturmak için 5000 rpm&#39;de, SU-8 2010 3000 rpm&#39;de 30 ikinci bir tabaka oluşturmak için, ve SU-8 3025 2,000 rpm&#39;de 30 saniye üretmek için üçüncü tabaka. </li><li> t önce kaplanmış gofret Yumuşak fırındaDesen transferini diye. Hizalayın ve bir maske hizalama kullanarak &quot;doğrudan temas&quot; modunda gofret maruz. Not: Yumuşak fırında birinci tabaka, 95 ° C&#39;de 2 dakika, ikinci tabaka 95 ° C &#39;de 3 dakika, ve üçüncü tabaka için 95 ° C&#39; de 15 dakika süre ile çok ince bisküvi. 100 mJ / Birinci tabaka için cm2, 130 mJ / ikinci katman için cm2 ve 200 mJ / üçüncü katmanın için cm2&#39;de maruz doz kullanın. </li><li> maruziyet sonrasında gofreti sonrası pişir ve SU-8 geliştirici kullanarak geliştirmek. N2 silah ve sert fırında 30 dakika 200 ° C &#39;de çok ince bisküvi ile gofret kurutun. Not: silikon gofret kalıp model tarafı yukarı bakacak şekilde, File bandı kullanılarak 15 cm çaplı plastik Petri kabına sabitlenmiştir. Genellikle, çok sayıda mikro-akışkan kartları aynı zamanda imal edilmesini sağlar aynı kalıp, birçok aynı çip yapıları koydu. Her bir kalıp mikroakışkan fiş imal etmek için pek çok kez yeniden kullanılabilmektedir. </li></ol> 2. mikroakışkanÇip Fabrikasyon <ol><li> Bir denge üzerinde temiz bir tartı tekne yerleştirin ve dengeyi daralayın. tartmak tekne içine PDMS tabanının 50 g dökün. </li><li> tartı teknesinde PDMS kürleme maddesi, 5 g ekleyin (ağırlık / PDMS tabanına 1:10 oranında ağırlık). NOT: Bu hacim, kalıp ile bir 15 cm çaplı bir Petri tabağına dayanır. Farklı büyüklükte bir petri kabı kullanarak, eğer reaktif miktarını ayarlayın. </li><li> PDMS tabanı ve tek kullanımlık bir pipet ile sertleştirme ajanı karıştırılır. tartım kabı kenarından başlayıp yavaş yavaş içeri doğru hareket eder. küçük kabarcıklar karışım boyunca meydana kadar birkaç dakika süreyle iyice karıştırılır; Karışımın tam PDMS polimerizasyonu için esastır. </li><li> yavaş Petri kabı içine dökün; Karışım, tam olarak silikon gofret kalıp kapsamalıdır. </li><li> 10 dakika PDMS karışımından tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için bir vakum içinde Petri tabağına yerleştirin. kabarcıklar karışımın yüzeyinde kalır ise, onları dışarı üflemek için bir pipet kullanın. </li><li> silikon inkübeyaklaşık 2 saat süreyle 75 ° C&#39;de bir fırın içinde PDMS ile gofret kalıbı. </li><li> Yavaşça gofret kalıp yapımı için herhangi bir zarar vermeden, silikon gofret kalıp kapalı polimerize PDMS tabaka soyun. Seçenek olarak ise, bir tek kenarlı endüstriyel jilet kullanılarak desen etrafında en az 5 mm aralık ile silikon gofret kalıp şirketinden PDMS kesme; hafifçe gofret kalıp kapalı PDMS katmanı soyun. </li><li> model tarafı yukarı bakacak şekilde tezgah PDMS tabaka yerleştirin. Dikkatle yapı hasarı önlemek için her bir çip kenarından uygun bir devamlılığının bir tek kenar endüstriyel jilet ile tek tek çip kesip. </li><li> yukarı bakacak şekilde model tarafı, her bir kanal tarafına düz bir şekilde giriş ve çıkış çevrelerine boyunca delikler bir zımba kalem (0.75 mm İD) kullanın. NOT: Bu delikler ortamın akışı için yol oluşturun. Nedenle, çevrelerinde geçmesi ve PDMS tabakasının içinden tüm yol yumruk için çok önemlidir. Emin oldelikten PDMS sütunları kaldırın. </li><li> deliğe tekrar delme kalem iğne sokarak her delinmiş delik edin. İğne herhangi bir blokaj bulunmamaktadır belirten diğer taraftan dışarı gelebilir emin olun. Desen yüzeye bant uygulama yavaşça toz parçacıklarını temizlemek için bant soyulabilir. bu adımı en az üç kez tekrarlayın. sterilizasyonu korumak için PDMS üzerinde viski bant temiz bir parça bırakın. </li><li> PDMS&#39;den karşı tarafında bu işlemi tekrarlayın ve yanı üzerine bant son dilimini bırakın. </li><li> 0,13-0,17 mm kalınlığında, 24 mm x 30 mm kapak camı hazırlayın. yüzey sterilize etmek için toz sökücü ile cam üzerinde% 70 etanol püskürtme ve kurutma; buna ek olarak, cam otoklavlanmış su ile yıkandı ve toz sökücü ile kurutulabilir. </li><li> Plastik bir plakaya kapak cam ve PDMS aktarın. PDMS viski bandını çıkarın ve yukarı bakacak desen tarafını yerleştirin. Aktarım sırasında desen yüzeye sahip herhangi bir temastan kaçının. </li><li&gt; Plazma makinesinde plastik levha yerleştirin. PDMS oksijen plazma işlemi, aşağıdaki işlem parametrelerine sahip hidrofilik yüzeyler oluşturmak için cam kapak geçerlidir: maruziyet, 75 s; Gaz sabitleme, 20 cc / dakika; basınç, 200; ve güç, 100 W </li><li> Dikkatle hidrofilik yüzeyler (plazma işlemi sırasında karşılaştığı yüzeyler), bağlantı, kapak camı üzerine PDMS yerleştirin. PDMS ve kapak cam arasında hava kabarcığı olmadığından emin olun. </li><li> en az 2 saat boyunca 75 ° C&#39;de bir fırın içinde PDMS çip inkübe edin. Not: Eksik mikro sıvılaştırma deney sırasında mikroskop üzerine sızıntıya neden olabilir. Bu nedenle, biraz cımbız ile kenarlarından PDMS kaldırarak PDMS ve kapak camı arasındaki bağı kontrol edilmesi önemlidir. Yavaşça başarılı bağı belirten kapak camı ayırmak gerektiğini PDMS kaldırarak. </li></ol> 3. Deney hazırlığı <ol><li&gt; Tüp hazırlanması. <ol><li> % 70 etanol çözeltisi ayrıca PDMS çip hazırlanmasından önce 1 gün içinde giriş ve çıkış boruları daldırın. </li><li> tüpleri yıkamak için otoklava su ile 5 ml şırınga doldurun. şırınga üzerindeki tüp takmayı ve su ile tüp ateş basması her tüp yıkayın. </li><li> etanol kalıntısını temizlemek için, yıkama adımı en az 3 kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> emin yapı, tutarlı ve sağlam olmak için 10X objektif ile bir optik mikroskop altında PDMS kanalları inceleyin. File bandı kullanılarak mikroskop platformu üzerine PDMS çip stabilize. NOT: İlk defa cihaz yapma, özellikle yedekleme cips var olmasını sağlamak için adım 2&#39;de tek seferde birden cips olun. </li><li> otoklava su ile 5 ml şırınga doldurun. bir şırınga pompası şırıngayı edin ve karşılık gelen giriş ve çıkış boruları yerleştirin. yaklaşık 10 dakika boyunca çip durulama 750 uL / ​​saat çamaşır hızını ayarlayın. şube kanallarında hava kabarcıklarıBu süre sırasında uzaklaşmış olmalıdır; Kalan kabarcıklar varsa, elle kabarcıklarını yok etmek için hızını ayarlamak. </li><li> Maya numune hazırlama. <ol><li> 3.000 x g&#39;de 5 dakika boyunca iki adet 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine ml hazırlanan maya örneği (OD600 0.6-0.8) devri 1 ve santrifüj. </li><li> Her bir tüpten yüzer çoğunluğu çıkarın ve 0.5 ml örnek oluşturmak üzere geri kalan birleştirir. </li></ol></li><li> şırınga pompası Pause ve PDMS, çip giriş tüpleri kaldırmak. </li><li> El ile her bir giriş tüpüne (uzunluk olarak 1 ila 2 cm) küçük bir hava kabarcığı emmek için şırınga pompası ters. maya örneğinde emmek geçin; hava kabarcığı örnek sınırını göstermek ve çizilmiştir ne kadar örnek gösterecektir. NOT: şırıngaya örnek emme kaçının. </li><li> Lütfen PDMS çip içine giriş tüpü yerleştirin ve 750 uL / ​​saat bir hızda hücrelerin yüklenmesi için pompayı yeniden. </li><li> 10 dakika üzerinde pompa şırınga bırakınburada n ve mikroskop altında hücre yükleme ilerlemesini incelemek; direği askıya fazla% 60 altında başarılı bir yükleme olacak tuzak hücreleri. </li><li> beslenme solüsyonu geçin ve hücre kültürü için 400 uL / ​​saat hızı ayarlayın. </li><li> mikroskop için seçin gözlem pozisyonlar. NOT: ömrü ölçümleri için, görüntüler 40x amacı ile bir optik mikroskop ile her 15 dakikada alındı. flüoresan raportör analizi için, görüntüler 60X petrol amacı ile bir floresan mikroskobu ile bir kez, her 15 dakikada bir alındı. </li></ol>

<ol><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li>
<li>Polymenis, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+High-tech+yeast+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: High-tech yeast ageing.</a> Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275(2012).</li>
<li>Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+technologies+for+yeast+replicative+lifespan+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies.</a> Mech Ageing Dev. , (2016).</li>
<li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra,, Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li>
<li>Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+high-resolution+microscopic+observation+of+replicative+aging+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast.</a> J Vis Exp. (78), e50143(2013).</li>
<li>Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).</li>
<li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/16/2/012/meta">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.matsci.28.1.153">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+telomerase+inactivation+accelerates+aging+independently+of+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length.</a> Cell. 160 (5), 928-939 (2015).</li>
<li>Boy-Marcotte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+shock+response+in+yeast%3A+differential+regulations+and+contributions+of+the+Msn2p%2FMsn4p+and+Hsf1p+regulons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons.</a> Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).</li>
<li>Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+principles+of+the+yeast+G1%2FS+switch%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Design principles of the yeast G1/S switch.</a> PLoS Biol. 11 (10), e1001673(2013).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

PDMS cihazı taze yapılmış olması gerekmektedir. Aksi takdirde, cihaz içine tüpler sokulması neden olduğu hava kabarcıkları uzaklaştırmak için zor olacaktır. Adım 3.4 hücrelerini yoğunlaşarak hücre yükleme verimliliğini artırmak için önemlidir. Deneyin verimini arttırmak için aynı PDMS çip üzerinde 4 ila 6 modül bağımsız olarak çalışan pompalar genellikle eş zamanlı olarak 4 ila 6 farklı deneyler (farklı tür ya da ortam bileşimler) gerçekleştirmek için kullanılan bağlı. (Mikrodiseksiyon kulla...

mayayı tomurcuklanan araştırma yaşlanma güçlü bir model organizmadır. Bununla birlikte, mayada, geleneksel bir ömrü deneyi sadece emek yoğun değil, aynı zamanda, düşük verimlilik, 1, 2 olan mikrodiseksiyon dayanır. yaşlandıkça Ayrıca, geleneksel mikrodiseksiyon yaklaşım bekar bir anne hücrelerde çeşitli hücresel ve moleküler özelliklerinin ayrıntılı bir görünümünü sağlamaz. Mikro-akışkan cihazlarının gelişimi maya ömrü ölçmek için hem de ana hücreleri, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ömrü boyunca moleküler işaretçileri ve çeşitli hücre fenotipleri takip otomatik bir prosedür sağladı. Maya hücreleri, bir mikro-akışkan cihazın içine yüklendikten sonra, bunlar otomatik zaman tur kullanılarak mikroskop altında izlenebilenE görüntüleme. Işleme araçları görüntülenmesi sayesinde, çeşitli hücresel ve moleküler fenotipleri, 3 elde edilebilir 6 kullanılarak elde edilmesi zor veya imkansız olan birçok vb ömrü, boyut, floresan haberci, hücre morfolojisi, hücre döngüsü dinamiği, dahil olmak üzere, 8, geleneksel mikrodiseksiyon yöntemi. Mikroakışkan cihazlar birkaç yıl önce 3, 4, 6, 7 başarılı gelişme beri maya yaşlanma araştırmalarında önem kazanmıştır. Çeşitli gruplar sonradan daha erken tasarımları 5 varyasyonları yayınlanan ve birçok maya laboratuarları kendi çalışma için microfluidic cihazlar kullanmışlardır. üstel büyümeyi geçiren bir hücre kültüründe, gözlem için mevcuttur yaşlı anne hücre sayısı miniscu olduğunule. Bu nedenle, ömrü ölçümler için mikro-akışkan cihazının genel tasarım prensibi anne hücreleri korumak için ve kızı hücreleri kaldırmaktır. Bu tür tasarımlar maya asimetrik hücre bölünmesini uğrar gerçeği kullanır. Cihaz irade kapanı büyük anne hücrelerinde yapı ve izin küçük kızı hücreleri uzakta yıkanacak. Bu makalede açıklanan mikro-akışkan çip tuzak ana hücrelere yumuşak polidimetilsiloksan (PDMS) ped (dikey sarkık sütun) (Şekil 1) kullanır. Benzer bir tasarıma sahip cihazlar daha önce 3, 4, 6, 7 bildirilmiştir. Bu protokol microfluidic cihazlar ve zaman atlamalı görüntüleme deneyleri için optimize edilmiş basit bir hücre yükleme yöntemi üretmek için daha basit bir prosedür kullanır. mikroakışkan cihaz önemli parametrelerden biri tuzak ana hücrelere kullanılan PDMS pedleri genişliğidir. Bizim dihaz hayatları boyunca izlenebilir taze anne hücrelerinin önemli bir kısmı dahil olmak üzere her yastık altında daha anne hücreleri tutabilir geniş yastıkları kullanır. Hücreler nesiller veya tüm ömrü boyunca bir gözlem gereklidir için izlenmesi gereken zaman ömrü ölçümlerine ek olarak, bu protokol, tek bir hücre zaman atlamalı görüntüleme deneyleri için kullanışlıdır.

<table><tbody><tr><td>3 inç < 111> silikon gofret</td><td>Addison Mühendislik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 ve 3000 Serisi</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard & reg; 184 Silikon Elastomer Kiti</td><td>ellsworth</td><td>2065622</td><td>Sylgard & reg; silikon elastomer taban ve kürleme maddesi</td></tr><tr><td>Petri kapları</td> içerir <td>VWR</td><td>391-1502</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-core&trade; zımba (ID 0.75 mm)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>29002513</tr><tr><td>24 mm x 40 mm SLIP-RITE&reg; kapak camı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>102440</td><td></td></tr><tr><td>3M Bant</td><td>ULINE</td><td>S-10223</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Tıraş Bıçakları</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Saf Etanol, Koptec</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Whoosh-Duster&trade;</td><td>VWR</td><td>16650-027</td><td></td></tr><tr><td>5 mL BD Şırınga (Luer-Lock & İpucu</td><td>)Becton, Dickinson and Company</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>PTFE Standart Duvar Borusu (100 ft, AWG Boyut: 22, Nominal Kimlik: 0.028)</td><td>Bileşen Tedarik Şirketi</td><td>SWTT-22</td><td></td></tr><tr><td>İğne Çeşitleri</td><td>Bileşen Tedarik Şirketi</td><td>NEKIT-1</td><td></td></tr><tr><td>Kurutucu</td><td>HACH</td><td>2238300</td><td></td></tr><tr><td>Lab Fırın</td><td>Fisher Scientific</td><td>13246516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>2000X ve 40X objektifli Nikon TE60 mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1, 40X ve 60X objektifli</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Pompası</td><td>Daha Uzun Pompa</td><td>TS-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroakışkan aygıtlar kullanma tek budding maya hücreleri ömrü ve hücresel fenotipleri Ölçmek için

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae, yaşlanma araştırmalarında önemli bir model organizmadır. Genetik çalışmalar, türler arasında yaşam süresi üzerinde korunmuş etkileri olan birçok geni ortaya çıkarmıştır. Bununla birlikte, yaşlanma ve ölümün moleküler nedenleri belirsizliğini korumaktadır. Maya yaşlanmasının altında yatan moleküler mekanizmaların sistematik bir şekilde anlaşılmasını sağlamak için, yaşam süresini ölçmek ve tek hücrelerde çeşitli hücresel ve moleküler fenotipleri ölçmek için yüksek verimli yöntemlere ihtiyacımız var. Daha önce, yeni doğan yavru hücreleri temizlerken tomurcuklanan maya ana hücrelerini ömürleri boyunca izlemek için mikroakışkan cihazlar geliştirdik. Bu makale, mikroakışkan çiplerin hazırlanması ve mikroakışkan deneylerin kurulması için bir yöntem sunmaktadır. Farklı koşullar altında veya farklı maya suşlarından hücreleri aynı anda izlemek için birden fazla kanal kullanılabilir. Tipik bir kurulum, kanal başına yüzlerce hücreyi izleyebilir ve hücrelerin ömrü boyunca yüksek çözünürlüklü mikroskop görüntülemeye izin verebilir. Yöntemimiz ayrıca tek hücrelerin ömrünün, moleküler belirteçlerin, hücre morfolojisinin ve hücre döngüsü dinamiklerinin ayrıntılı karakterizasyonuna izin verir. Ek olarak, mikroakışkan cihazımız, aşağı akış görüntü analizi ile tanımlanabilen önemli miktarda taze ana hücreyi yakalayabilir ve bu da kullanım ömrünün daha yüksek doğrulukla ölçülmesini mümkün kılar.

Deneylerden sonra, hücreler ve birçok hücresel ve moleküler fenotipleri yaşam süreleri kaydedilmiş zaman atlamalı görüntüleri elde edilebilir. her bir hücreden ekstre edilebilir, farklı bir dizi özellik olduğundan, analiz ilk adım, pozisyonları ve hücre sınırları ve izlenen çeşitli olayların zamanlama dahil olmak üzere hücreleri ve olayları, açıklama şekildedir tomurcuklanan olaylar olarak. Bu ek açıklamalar daha kolay gelecekte farklı özelliklere hücrelerin aynı setine dönmek ve analiz ...

Bu makalede, mikro akışkan cips üretim ve kullanım ömrü ve tek bir maya hücrelerinin hücresel fenotipleri ölçmek için mikro-akışkan deney kurulumu için optimize edilmiş bir protokol sunulur.

Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Bu deneyin genel amacı, özelleştirilmiş bir mikroakışkan cihaz üretmek ve bunu tek bir maya hücresinin yaşam süresini ve hücresel fenotiplerini ölçmek için kullanmaktır. Bu yöntem, maya yaşlanması alanındaki bazı temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, ana hücreler neden yaşlanır ve ölür ve hücresel homeostazın kaybına, nihayetinde ise hücre yaşlanmasına ve ölümüne yol açan erken moleküler olaylar nelerdir? Bu tekniğin temel avantajı, ana hücreleri, yaşam sürelerini ve çeşitli moleküler belirteçleri aynı anda takip edebilmemizdir; böylece yaşam süresiyle korele olan moleküler olayları araştırabiliriz.Bu yöntem maya yaşlanması hakkında bilgi sağlayabilse de, birçok nesil boyunca hücre kontrolü gerektiren katılıma karşı ikincil yanıtların izlenmesi gibi diğer alanlara da uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler zorlanacaktır çünkü mikroakışkan cihaz üretimi, hücre yükleme ve mikroskop kurulumunun başarıyla gerçekleştirilmesi çok fazla pratik gerektirir. Mikroakışkan cihazın mayalarla doğru şekilde doldurulması zor olduğu için, bu yöntemin önceden gösterilmesi kritik öneme sahiptir.Başlamak için, ekteki metin protokolünde açıklanan standart teknikleri kullanarak cihaz için bir silikon gofret kalıbı hazırlayın. Kalıbı, özellik tarafı yukarı bakacak şekilde 15 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Kalıbı bantlarla Petri kabına sabitleyin.Ardından, temiz bir tartım kabını teraziye yerleştirin ve teraziyi daralayın. Tartım kabına 50 gram PDMS baz dökün ve ardından beş gram PDMS kürleme ajanı ekleyin. PDMS baz ve kürleme ajanını tek kullanımlık bir pipetle karıştırın.Tartım kabının kenarından başlayarak yavaşça içeriye doğru ilerleyin. Karışımın her yerinde küçük kabarcıklar oluşana kadar birkaç dakika boyunca iyice karıştırın. Karışımı, silikon gofret kalıbını tamamen kaplayacak şekilde Petri kabına yavaşça dökün.Ardından, PDMS karışımındaki tüm hava kabarcıklarını gidermek için Petri kabını 10 dakika boyunca vakuma yerleştirin. Vakumdan çıkarıldığında karışımın yüzeyinde kabarcıklar kalmışsa, bunları bir pipet yardımıyla üfleyerek temizleyin. Sonrasında, düzeneği 75 °C'de iki saat boyunca fırınlayın.Oda sıcaklığına kadar soğutulduğunda, kalıbın etrafındaki PDMS'i dikkatlice kesin ve ardından silikon gofret kalıbının yapısına herhangi bir zarar vermemeye dikkat ederek polimerize olmuş PDMS tabakasını kalıptan nazikçe soyun. PDMS tabakasını, desenli yüzeyi yukarı bakacak şekilde tezgaha yerleştirin. Her bir çipin yapısını bozmamak için kenarlardan yeterli pay bırakarak, tek kenarlı endüstriyel bir jiletle her bir çipi dikkatlice kesin.Desenli taraf yukarı bakacak şekilde, kanalların her iki yanındaki giriş ve çıkış dairelerinden aşağıya doğru düz bir şekilde delikler açmak için bir delme kalemi kullanın. Delme kalemi iğnesini tekrar deliğe sokarak her bir deliği kontrol edin. İğnenin diğer taraftan çıktığından emin olun; bu, herhangi bir tıkanıklık olmadığını gösterir.Ardından, üst yüzeydeki toz partiküllerini ve kalıntıları temizlemek için bandı kullanın. Bu adımı en az üç kez tekrarlayın ve tozsuz bir yüzey sağlamak için PDMS üzerinde temiz bir parça Scotch bant bırakın. Daha sonra cihazı ters çevirin ve bu prosedürü PDMS'nin karşı tarafında tekrarlayın.Son bant parçasını bu tarafta da bırakın. Şimdi cihazın tabanı için cam bir yüzey hazırlayın. 24 mm x 30 mm boyutlarında ve 13 ile 17 mm arası kalınlıkta olan lamine cam parçasını seçin.Yüzeyi sterilize etmek için cama %70 etanol püskürtün ve toz temizleyici ile kurulayın. Ardından, lamel camı ve PDMS'yi plastik bir plakaya aktarın. PDMS üzerindeki Scotch bandını çıkarın ve üst yüzeye temas etmeyecek şekilde, desenli tarafı yukarı bakacak şekilde plakaya yerleştirin.Ardından plakayı bir plazma haznesine aktarın. Yüzeyleri hidrofilik hale getirmek için PDMS ve lamel camına oksijen plazma işlemi uygulayın. Daha sonra plakayı plazma haznesinden çıkarın ve PDMS'in plazma ile işlem görmüş yüzeylerini lamel camına dikkatlice bağlayın.PDMS ile lam arasında hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Son olarak, cihazı bir fırına aktarın ve en az iki saat boyunca 75 °C'de pişirin. PDMS çip hazırlığından bir gün önce giriş ve çıkış tüplerini %70 etanol çözeltisine daldırın.Ertesi gün beş mililitrelik bir şırıngayı otoklavlanmış suyla doldurun ve tüpü şırınganın üzerine yerleştirip suyla durulayarak her bir tüpü yıkayın. Kalıntı etanolü gidermek için yıkama adımını en az üç kez tekrarlayın. Ardından PDMS kanallarını bir optik mikroskop altında inceleyin.10 X objektif kullanarak yapıların tutarlı ve sağlam olduğundan emin olun. Sağlam PDMS çipi, Scotch bant kullanarak mikroskop platformu üzerinde sabitleyin. Steril su ile doldurulmuş beş mililitrelik bir şırıngayı bir şırınga pompasına sabitleyin ve ilgili giriş ve çıkış tüplerini cihaza yerleştirin.Akış hızını saatte 750 microliters olarak ayarlayın ve çipi yaklaşık 10 dakika boyunca durulayın. Hava kabarcıklarının tamamen temizlendiğinden emin olmak için kanalları izleyin. 10 dakikalık durulama sonrası kabarcıklar kalmışsa, kabarcıkları gidermek için hızı manuel olarak ayarlayın.Hazırlanmış bir maya örneğinin bir mililitresini iki adet 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve örnekleri 3.000 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Her tüpteki süpernatantın büyük kısmını uzaklaştırın ve geri kalanı 5 mililitrelik bir örnek oluşturacak şekilde birleştirin. Maya örneği hazır olduğunda, giriş tüplerini PDMS çipinden çıkarın. Her bir giriş tüpünden hücre kültürlerini çekmeden önce, bir ila iki santimetre uzunluğunda küçük bir hava kabarcığı çekmek için şırınga pompasını manuel olarak ters yönde çalıştırın.Ardından giriş tüpünü PDMS çipine geri yerleştirin ve hücreleri saatte 750 µL hızla yüklemek için pompayı yeniden başlatın. Şırınga pompasını 10 dakika boyunca açık bırakın ve ardından hücre yükleme ilerlemesini mikroskop altında inceleyin. Başarılı bir yükleme, askı sütunlarının %60'ından fazlasının altında hücrelerin tutulmasıyla sonuçlanacaktır.Maya hücrelerini sürdürmek için şırıngadaki solüsyonu bir besin solüsyonuyla değiştirin ve hızı saatte 400 microliters olarak ayarlayın. Mayanın yaşam süresi fenotipi, yakalanan her bir ana hücre tarafından üretilen tomurcuk sayısı sayılarak ve Kaplan-Meier tahmincisi hesaplanarak elde edilebilir. Bu protokolü kullanarak cihaz, halihazırda yakalanmış hücrelerden tomurcuklanarak ayrılan taze yavru hücreleri sıklıkla yakalar.Bu hücreler daha sonra, analiz sonrası görüntüleme yazılımı kullanılarak tanımlanabilen yeni ana hücrelere dönüşür. Bu yeni ana hücreler, daha doğru bir yaşam süresi ölçümü sağlar. Bu deneyde, yeni ana hücrelerin ortalama yaşam süresi yaklaşık iki nesil kadar daha uzundu.Görüntüleme verilerinden, tomurcuk sayısının yanı sıra iki ardışık tomurcuklanma olayı arasındaki zaman aralığı da elde edilebilir. Tomurcuklanma, yaşam sürelerinin sonuna doğru önemli ölçüde yavaşlar ve bu durum, yaşlanmış hücrelerin sağlıksız durumunu gösterir. Bu prosedürü uygularken, hava kabarcıklarını önlemeye yardımcı olmak için yeni hazırlanmış bir çip kullanmayı ve gerektiğinde hücre yükleme verimliliğini artırmak için hücre konsantrasyonunu artırmayı hatırlamak önemlidir.Geliştirilmesinin ardından bu teknik, maya yaşlanması alanındaki araştırmacıların yaşlanma fenotipine neden olan erken moleküler değişiklikleri keşfetmesinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, bu mikroakışkan cihazın nasıl yapılacağı ve tek hücrelerde yaşam süresini ve hücresel fenotipleri ölçmek için nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

using-microfluidic-devices-to-measure-lifespan-cellular-phenotypes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Maya Kronolojik yaşlanma, sabit faz zaman ile ilişkili hücre canlılığı kaybı anlamına gelmektedir. Burada maya kronolojik ömrü kantitatif olarak belirlenmesi için yüksek verimli bir yöntem açıklanmaktadır.

Yaşlı Hücre akıbet tarafından Maya Kronolojik Ömrü miktarının

Bu yazıda, maya anne hücreleri replikatif ömrü ölçümü için genel bir protokol mevcut.

Geliştirici Maya replikatif Ömrü Ölçüm

Burada bir dizi maya kronolojik yaşlanma sırasında düzenleyen veya genomik DNA istikrarsızlığa katkıda genlerin / yolları çalışma ömrü modeli ile kombine edilebilir DNA mutasyon deneyleri açıklar.

Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli

Biz temiz oda ya da yumuşak litografi gerek kalmadan, birden çok farklı suşları için benzer dinamik koşullar uygulanarak yeteneğine microfluidic cihazlar üretmek için basit bir yöntem sunulmaktadır.

Birden Farklı Suşlarının incelenmesi için bir mikroakışkan Cihazı

Biz burada onların tam replikatif ve / veya kronolojik ömrü boyunca tek tomurcuklanan maya hücreleri sürekli ve yüksek çözünürlüklü mikroskopik görüntüleme sağlayan bir mikroakışkan cihazın çalışmasını gösterir.

Replikatif sürekli yüksek çözünürlüklü Mikroskobik Gözlem geliştirici Maya Yaşlanma

Biz floresan büyüyen maya hücreleri mikroskop film ve tek hücreli zaman serisi veri ayıklamak için bir GUI tabanlı yazılım paketi elde etmek için basit protokol mevcut. Analizi otomatik soy ve görsel denetim ve izlenen verileri manuel küratörlüğü ile entegre bölümü zaman atama içerir.

Tomurcuklanma Maya Floresan Time-lapse Filmler Kazanılması ve GREFTLERİ kullanarak Tek hücreli Dynamics analiz

Bu protokolde, prokaryotik mikroorganizmaların tek hücreli analizi için bir mikroakışkan pikolitre biyoreaktörün (PLBR) üretimi, kurulumu ve temel çalışması tanıtılmaktadır. Endüstriyel olarak ilgili mikroorganizmalar, geleneksel yöntemlerle neredeyse imkansız olan, belirli zaman dilimlerinde büyüme hızı, morfoloji ve fenotipik heterojenlik hakkında bilgi sahibi olmaya izin veren ilke kanıtı olarak analiz edildi.

Mikrobiyal Tek Hücreli Analiz için Mikroakışkan Pikolitre Biyoreaktör: Fabrikasyon, Sistem Kurulumu ve Çalışması

Maya mayalarındaki canlı hücrelerin bir hücreli katlanarak değerlendirilmesi (ODELAY) olarak adlandırılan zaman atlamalı mikroskobi kullanarak katı miyar üzerinde kolonilere dönüşürken tek tek maya hücrelerinin büyüme fenotiplerini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Kolonilere dönüşen genetik olarak özdeş hücrelerin popülasyon heterojenliği doğrudan gözlemlenebilir ve nicelenebilir.

ODELAY: Maya Büyümesinin Çok Parametreli Niceleşmesi İçin Büyük Ölçekli Bir Yöntem

Biz örnek olarak Bacillus subtilis kullanarak bireysel bakteri hücre soy mikrosıvısal çözümlenmesi için bir yöntem mevcut. Yöntemi gözlem, hücre nesiller sıkı bir şekilde kontrol edilebilir ve düzgün büyüme koşullar altında yüzlerce izin vererek Mikrobiyoloji geleneksel analitik yöntemleri eksikliklerin üstesinden gelir.

Bacillus subtilis tek hücreli mikrosıvısal analizi

Burada Saccharomyces cerevisiaeartan bir kopya numarası bastırıcı ekran aracılığıyla genetik etkileşimleri belirlemek için bir protokoldür. Bu yöntem araştırmacılar, klon ve kısa ömürlü maya mutantlar test bastırıcılar sağlar. SIR2'nin kopya sayısı artışının otofaji null mutantında kullanım ömrü üzerindeki etkisini test ediyoruz.

Saccharomyces cerevisiae Kronolojik Yaşam Süresini Düzenleyen Genetik Bağlantıların Karakterizasyonu için Bastırıcı Ekran

Öğrenin, mikroakışkan aygıtlar kullanarak tek maya hücrelerinin ömrünü ve hücresel fenotiplerini nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, anne hücrelerin yaşlanma süreçlerini ve moleküler belirteçleri izlemek için değerli bilgiler sunar.

Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

Daha fazla video keşfet