Biyomoleküler etkileşimleri algılamak için bir Conductimetric Biyoalgılayıcı β-lactamase tabanlı tahlil kullanımı

Bu İletken Biyosensör Testinin genel amacı, hibrit beta-laktamaz teknolojisini kullanarak biyomoleküler etkileşimleri tespit etmektir. Bir kimerik beta-laktamaz proteini kullanarak antikor antijen etkileşimlerini tespit etmek için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu yöntemin prensibi, beta-laktamaz aktivitesinin proton salınımını ölçerek bağlanmayı tespit etmeye dayanır.

Bu tekniğin konvansiyonel bir immünosensörlere göre ana avantajı, kimerik bir beta-laktamaz kullanılmasıdır, analitleri tespit etmek için hibrit bir protein kullanarak daha ucuz ve daha hızlı duyusal testler yapar Prosedürü gösteren, lisansüstü bir araştırmacı olan Mathieu Dondelinger olacaktır. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi protein numunesi ve çözelti hazırlama ile başlayın. Elektrot hazırlama çözeltisinin her bir oyuğu başına 300 mikrolitre içeren 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına, oda sıcaklığında hafifçe karıştırarak iki dakika boyunca uçları daldırarak yeniden kullanılabilir elektrodu hazırlayın.

Bu adımı üç kez tekrarlayın. Daha sonra, uçları oda sıcaklığında hafifçe karıştırarak iki dakika boyunca damıtılmış su kuyusu başına 300 mikrolitre içeren 96 oyuklu bir plakanın kuyularına daldırarak elektrotları durulayın. Elektrotları rejenere etmek için, uçları gece boyunca dört santigrat derecede veya oda sıcaklığında bir saat boyunca rejenerasyon çözeltisi kuyusu başına 300 mikrolitre içeren 96 oyuklu bir plakanın kuyularına daldırın.

Daha sonra, uçları fosfat tamponlu tuzlu su kuyusu başına 300 mikrolitre içeren 96 oyuklu plakanın kuyularına daldırarak elektrotların üç yıkamasını gerçekleştirin. Her yıkamayı oda sıcaklığında hafifçe karıştırarak iki dakika boyunca gerçekleştirin. Elektrot yüzeyine fosfat tamponunda hazırlanan HEWL'nin mililitresi başına 40 mikrogramlık 15 mikrolitrelik bir damla bırakarak elektrotun polianilin yüzeyine tavuk yumurtası akı lizozimi kaplayın.

Elektrodu oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, sensör çiplerinin elektrot parçalarını, fosfat tamponu kuyusu başına 300 mikrolitre içeren 96 oyuklu bir plakanın kuyusuna daldırarak elektrotların fosfat tamponu ile üç kez yıkanmasını gerçekleştirin. Her yıkamayı oda sıcaklığında hafifçe karıştırarak iki dakika boyunca gerçekleştirin.

Elektrotun yüzeyine 30 mikrolitrelik bir damla blokaj çözeltisi ekleyerek elektrotları doyurun. Oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından, daha önce olduğu gibi üç kez yıkayın.

BlaP-cAb-Lys3 veya BlaP çözeltilerini bağlayıcı tamponda mililitre başına 20 mikrograma seyreltin. Ardından, bu seyreltilmiş çözeltiden 15 mikrolitrelik bir damla elektrotların üzerine uygulayın. Elektrotları oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Antijen nano cisim reaksiyonundan sonra, elektrotları yıkama solüsyonu ile üç kez yıkayın. Ardından, elektrotları algılama tamponu kuyusu başına 300 mikrolitre içeren 96 oyuklu bir plakanın kuyusuna daldırarak sensörün elektrotlarını algılama tamponunda yıkayın. Ve bir dakika boyunca kısa bir süre kuluçkaya yatırın.

Algılama için dijital multimetreyi bilgisayara bağlayın. Ardından, sensör çipini bakır devre parçası aracılığıyla dijital multimetreye takın. Pozitif etiketli elektrotlar üzerine 50 mikrolitrelik bir damla dört milimolar benzilpenisilin çözeltisi uygulayarak sensör yanıtını başlatın.

Negatif kontrol görevi görmesi için negatif etiketli elektrotlara 50 mikrolitrelik bir damla algılama çözeltisi uygulayın. Bağlı dijital multimetre ile iletkentometrik değerleri 30 dakika boyunca izleyin. Verileri gerçek zamanlı olarak doğrudan ekranda görselleştirin veya dijital verileri bir metin dosyası olarak dışa aktarın.

Bu ham veriler, referans ve numune elektrotları arasındaki iletkenlik değişikliklerinin zamana karşı ölçümlerini temsil eden grafiksel bir çıktı oluşturmak için çizilebilir. Kimerik proteini oluşturmak için, taşıyıcı protein olarak A sınıfı beta-laktamaz BlaP kullanıldı. Burada katalitik kalıntılar kırmızı ile gösterilmiştir.

Solvente maruz kalan bir döngüde bulunan yerleştirme yeri sarı renkle gösterilir. cAb-Lys3 adı verilen deve antikor parçası BlaP'ye yerleştirildi. Elde edilen kimerik protein, BlaP-cAb-Lyse3, beta-laktamaz aktivitesi korunurken HEWL'yi bağlayabilir.

HEWL, BlaP-cAb-Lys3 yüklenmeden önce polianilin kodlu bir elektrot üzerine immobilize edildi. İmmobilize kimerik protein tarafından benzilpenisilin hidrolizi üzerine protonların salınması, kullanıcı tarafından yorumlanabilen iletkenlik değişikliklerine neden olur. Sensörler, dört çift olarak düzenlenmiş sekiz çip içerir.

Her çip üç elektrot, bir polianilin kaplı çalışma elektrodu, bir referans elektrotu ve bir karşı elektrot içerir. Her çift için, negatif etiketli çip negatif bir kontrole karşılık gelirken, pozitif etiketli çip test edilen numuneye karşılık gelir. Burada, BlaP-cAb-Lys3'ün HEWL ile spesifik etkileşimini gösteren iletkenlik ölçümleri gösterilmektedir.

İletkenlik değişiklikleri, hareketsizleştirilmiş kimerik beta-laktamaz tarafından antibiyotik hidrolizi ile indüklenen proton salınımından kaynaklanır. Negatif kontrol, doğal beta-laktamaz BlaP için herhangi bir bağlanma tespit edilemedi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse ve deney koşulları optimize edilirse günde 1/2 içinde yapılabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, bir antikor parçasının BlaP'ye yerleştirilmesi zor olduğu için mücadele edecektir. Bu prosedürü denerken, üretilen verilerin kalitesinin kimerik beta-laktamazın işlevselliğine bağlı olacağını hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, bu etkileşimin denge ilişkilendirme sabitini belirlemek için tespit edilen etkileşimin nicelleştirilmesine izin veren diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Geliştirildikten sonra bu teknik, immün biyosensör alanındaki araştırmacıların canlı organizmalardan farklı ortamlara kadar çeşitli örneklerdeki moleküler etkileşimleri keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu tekniğin sonuçları, çok sayıda biyomolekülün saptanmasına doğru uzanır, çünkü kimerik beta-laktamaz teknolojisi, ana hattaki herhangi bir antikoru veya bir protein parçasını işlevsel hale getirmek için çok yönlü bir araçtır. Bu nedenle, insan ve hayvan sağlığı gibi birçok alanda ucuz ve hızlı teşhis araçları geliştirmek için kullanılabilir.