Name: Peptid, bir monoklonal antikor tarafından tanınan lineer B-hücresi epitopunun belirlenmesi: Tarama destekli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Öğrenin, dot-blot hibridizasyonu ve peptid tarama yöntemiyle monoklonal antikor tarafından tanınan lineer B-hücresi epitopunun nasıl belirleneceğini. Bu basit ve verimli teknik, terapötik ve tanısal uygulamalar için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Academia Sinica Hücresel ve Organizma Biyolojisi Enstitüsü (ICOB) Çekirdek Tesisi'nden Bayan Ching-Chun Lin ve Bayan Diana Lin'e sırasıyla peptit sentezi ve DNA dizilimi konusundaki uzmanlıklarını sundukları için teşekkür eder. Bu çalışma Academia Sinica tarafından desteklenmiştir.

Monoklonal antikor hazırlanması 1. <ol><li> Kültür,% 5 CO2 ilave ile 37 ° C &#39;de 175T şişelerinde serum içermeyen ortam içinde RG-M56 tek klonlu fare hibridoma hücreleri, 2. orta renk inkübasyon beş gün sonra sarı döndüğünde süpernatant toplayın. Not: hibridoma hücreleri cenin sığır serumu antikor kirlenmesini önlemek için, serum barındırmayan ortam içinde kültürlenmiştir. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 4500 x g&#39;de santrifüj süpernatan ve hücre yıkıntıları pelet haline atın. </li><li> 5 ml kolonuna (% 50 bulamaç olarak verilir), protein G agaroz 2 ml ilave edilir ve buz soğukluğunda PBS 10 reçine hacim (10 mL) ile dengeye getirin. </li><li> Antikor süpernatant yükleyin 200 mL kolonuna (adım 1.2) ve geçişini atın. </li><li> yıkamak için sütuna buz soğukluğunda 10 ml PBS ilave edin. İki kez tekrarlayın. </li><li> protein G-bağlı antikor elüt edilmesi için sütun 50 mM glisin, pH 2.7, 10 ml ekleyin. ColCollect 10x nötralizasyon tampon 100 ul (1 M Tris, 1.5 M NaCl ve 1 mM EDTA, pH 8.0) ihtiva eden bir mikrosantrifüj tüpü içinde, 900 uL fraksiyonlar. </li><li> -20 ° C&#39;de% 0.03 NaN 3 ile% 50 gliserol saflaştırılmış antikor saklayın. </li></ol> 2. İnşaat ve seri olarak Kesik Rekombinant Proteinlerin İfadesi <ol><li> (10x Pfu tampon maddesi 5 uL, her dNTP 0.2 mM, 0.2 uM ileri primer 3, 0.2 uM ters primer 3, 2 mM MgSO 4, pET20b-1A59 3 plasmid DNA 1 ng ve 2.5 U: PCR reaksiyon karışımı hazırlandı ünite) Pfu DNA polimeraz, 50 ul&#39;lik nihai bir hacme kadar O GKD 2 ekleyin. <ol><li> Otomatik termal döngü çalıştırmak örnekler aşağıdaki parametreler kullanılarak: Döngü 1 (5 dakika 94 ° C); döngüleri 2-36 (30 s için 94 ° C, 30 sn için 63 ° C ve 60 sn için 72 ° C); ve çevrim 37 (7 dakika süreyle 72 ºC). </li></ol></li><li> Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), aşağıdaki kısıtlayıcı enzim sindirimi kolaylaştırmak için PCR saflaştırma kiti 5 kullanarak ürün ekstrakte edin. </li><li> Nde I ve Xho I sınırlama enzimleri ile PCR amplifiye edilmiş DNA fragmanları sindirimi ve Nde I ve Xho I enzim ayrıldı pET-20b (+) vektörüne, bu DNA parçalarının her biri ligate. Escherichia coli DH-5α-kompetan hücreler 6 içine yapıları dönüştürmek. <ol><li> Sindirim tamponu sindirim karışım hazırlayın (20 mM Tris-asetat, 10 mM Mg (CH3COO) 2, 50 mM KCH 3 COO ve 1 mM DTT, pH 7.9) ile 1 PCR ile amplifiye DNA ya da PET-20b ug Nde I ve Xho I sınırlama (+) vektörü, DNA, ve 2 U 20 uL nihai hacim içinde enzim. </li><li> yavaşça sindirim karışımı karıştırın ve hızlı bir şekilde aşağı doğru döndürün. sınırlama tam kesim oturup sağlamak için kuru bir banyo içinde, 2 saat boyunca 37 ° C de kuluçkaya bırakılıres. </li><li> Aşağıdaki plazmid yapı kolaylaştırmak için PCR saflaştırma kiti 5 ile sınır enzimi ile sindirilmiş DNA fragmanları ekstrakte edin. </li><li> Ligasyon tamponu bağlanma karışımının hazırlanması (66 mM Tris, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP, ve 5 mM DTT, pH 7.5) önceden sindirilmiş, PCR ile amplifiye DNA 100 ng, predigested pET-20b, 10 ng (+) vektör DNA, 10 uL nihai hacim içinde, 5 U T4 DNA ligaz. </li><li> yavaşça ligasyon karışımı karıştırın ve hızlı bir şekilde aşağı doğru döndürün. Bir su banyosu içinde 18 saat boyunca 16 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> DH-5α-kompetan hücreler 100 uL ligasyon numunelerinin 10 uL koyun ve 30 dakika boyunca buz üzerinde mikrosantrifüj tüpü yerleştirmeden önce yavaşça karıştırın. Isı şoku 7 ikna etmek 90 saniye süreyle 42 ºC kuru bir banyosunda ependorf tüp koyun. Hemen 2 dakika süreyle buz üzerine tüp aktarın. </li><li> % 0.5 Bacto maya Extrac Luria-Bertani (LB) ortamı (% 1 Bacto tripton, 900 uL, eklemetüpe T ve% 0.5 NaCl, pH 7.0). 150 rpm&#39;de 45 dakika boyunca çalkalama ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. 10 dakika süre ile 4,000 x g &#39;de santrifüj ile hücreler pelet ve süpernatant atılır. </li><li> LB suyu 50 uL ile pelet yeniden süspanse edin ve 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden, önceden-ısıtılmış LB plakaları üzerine her dönüşümü yayıldı. 16 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 200 uL ucunu kullanarak tek bir koloni Pick up ve gevşek kapatılmış 15 ml tüp içinde 100 ug / ml ampisilin içeren 3 ml LB suyu içine yerleştirin. 150 rpm&#39;de 12 saat boyunca çalkalanarak 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Her bir kültürden plazmid DNA 8 ekstrakte ve sırası 9 teyit etmek için T7 destekleyici ve T7 bitirme primerler kullanılarak, sekans. </li></ol></li><li> Sekans doğrulandıktan sonra, bu, pET-20b DNA, 10 ng (+) tarafımızdan, E. coli BL-21 (DE3) &#39;e suşa YGNNV kılıf proteini geni uzunlukları farklı olan plazmidler dönüşümüısı-şok yöntemi 7 ing. adımları izleyin 2.3.6-2.3.8 dönüşümü gerçekleştirmek için. </li><li> Gevşek kapaklı 15 ml bir tüp içinde 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden 3 ml LB suyu her bir transforme edilmiş E. coli BL-21, hücre tek bir koloni aktarın. 150 rpm çalkalanarak 37 ºC&#39;de kültür inkübe edin. </li><li> Kültür OD 600 yaklaşık 0.6 olduğu zaman 25 ° C, kültür soğutun ve yeniden birleştirici proteinin ifadesini uyarmak için 0.4 mM nihai bir konsantrasyona kadar IPTG ilave edin. 200 rpm çalkalanarak 25 ° C&#39;de fazladan 4 saat süreyle kültür inkübe edin. </li><li> mikrosantrifüj tüpü içine kültürün 1 ml&#39;sinin aktarın. 1 dakika için 12,000 x g&#39;de santrifüj ile hücreler pelet ve süpernatant atılır. </li><li> Mikropipet ile pipetleme aşağı denatürasyon tampon maddesi 100 uL (8 M üre, 20 mM sodyum fosfat, 0.5 M NaCI, pH 7.4) içinde hücre pelletini. dinç vorteks ile karıştırın. NOT: Örnek solutions artık nokta blot hibridizasyon analizi için, yarı-saydam az yapışkan ve hazır olmalıdır. </li></ol> Çakışan Peptitler 3. Tasarım ve Sentezi <ol><li> Tasarım ve her nokta lekeleme tarafından RG-M56 mAb epitop bölgesini daraltmak için YGNNV kat proteininin 195-338 aa bölgesinden 10 aa artıkları ile halefi ile örtüşen 3 seri 20-mer peptidler sentez. </li><li> Tasarım ve sentez 3 üç 8-mer peptitler (202 195 VNVSVLCR, 197 VSVLCRWS 204 ve 199 VLCRWSVR 206) aşağıdaki sentetik peptid üzerine 6 aa artıkları bir örtüşme ile noktalama yöntemiyle 195-206 aa epitop bölgesini daraltmak için. </li><li> Tasarım ve 3 7-mer sentez (196 NVSVLCR 202 ve 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201 ve 1En aza indirmek için komşu peptit üzerinde sırasıyla, 6, 5 üst üste binmekte ve 4 aa artıkları, 97 VSVLCR 202) ve 5-mer peptidleri (202 195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201 ve 198 SVLCR) noktalama yöntemiyle epitop bölgesi. </li></ol> 4. Nokta benek hibridizasyonu <ol><li> 10 mg / mL&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde, her sentez peptidi çözülür. Not: sentetik peptidler değişik çözünürlüğe üstesinden gelmek için, tüm sentetik peptidler DMSO içinde çözündürülmelidir. DMSO tamamen hidrofobik ya da hidrofilik peptitleri çözündürmek için iyi bir çözücüdür. </li><li> 2 dakika boyunca metanol ile poliviniliden florit (PVDF) membran bekletin. NOT: PVDF membran DMSO dayanıklı% 100 kadardır; diğerleri kadar olmayabilir. </li><li> modifiye Towbin tamponu (25 mM Tris, 192 mM glisin ve% 0.1 SDS, pH 8.3) için, PVDF membranı ile dengeye2 dakika. Not:% 10-20 (h / h) metanol transfer sonuçlarını geliştirmek için modifiye Towbin tamponu ilave edilebilir. </li><li> modifiye Towbin tamponu ile kromatografi bir parça kağıt durulayın. kromatografi kağıdı üzerine PVDF membran yerleştirin. modifiye Towbin tampon sonraki adıma geçmeden önce PVDF membran yüzeyinden kaybolana kadar bekleyin. </li><li> 10 uL ucu ile membrana her peptid numunesi 2 ul ekle. 10 dakika süre ile kromatografi kağıdı üzerinde PVDF membran hava-kurutun. Çok fazla difüzyon önlemek için zar üzerine yavaş ve aşamalı olarak, her peptit örnek ekleyin. </li><li> hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 5 yağsız süt ile TBST tamponu içinde membran (% 0.05 (h / h) Tween-20, 20 mM Tris, 150 mM NaCI, pH 7.4) ile bloke edin. </li><li> zara% 5 yağsız süt ile TBST tamponu içinde 1.000: 1 oranında bir nihai seyreltme ile RG-M56 mAb ekleyin. hafifçe çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de membran inkübe edin. </li><li> bu nedenle antikorunu çıkarındökülmesinden. hafifçe çalkalanarak 5 dakika süreyle TBST tamponu içinde membran yıkayın. İki kez tekrarlayın. </li><li> zara% 5 yağsız süt ile TBST tamponu içinde 5.000: 1 bir son seyreltide ikincil antikor (keçi anti-fare IgG, Fc, konjuge alkalin fosfataz) ekleyin. hafifçe çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de membran inkübe edin. </li><li> antikor çözüm atın. hafifçe çalkalanarak 5 dakika süreyle TBST tamponu içinde membran yıkayın. iki kez yıkama adımı yineleyin. </li><li> karanlıkta 15 dakika için oda sıcaklığında BCIP / NBT substrat çözeltisi ile membran geliştirir. Sinyal göründüğünde GKD 2 O ile membran yıkayarak gelişmekte durdurun. </li><li> membran Hava kurutun ve bir görüntü sistemi kullanılarak dot-blot görüntü yakalamak. </li><li> Görüntü analiz yazılımı 3 kullanarak her nokta leke yoğunluğunu ölçmek. </li></ol> 5. Alanin Tarama ve Değişiklik <ol><li> Tasarım ve 3 alanin ve Methi sentezonine, ikame peptidler. VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202 8-mer peptidi 195 VNVSVLCR 202 alanine her AA artığı yerine sentez peptidleri 195 ANVSVLCR 202, 195, ve 195 VNVSVLCA 202 . SJNNV genotip epitop peptit 195 VNVSVMCR 202 oluşturmak için metionin aa kalıntısı lösin 200 değiştirin. </li><li> alanin tarama ve ikame mutagenez nokta blotlama gerçekleştirmek için Bölüm 4 izleyin. </li></ol>

<ol><li>Milstein, C., Kohler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+variations+of+myelomatous+cells+%28proceedings%29%5BTitle%5D)+AND+%22Minerva+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal variations of myelomatous cells (proceedings).</a> Minerva Med. 68 (50), 3453(1977).</li>
<li>Lai, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2761.2001.00293.x/abstract">In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel).</a> J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).</li>
<li>Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+Linear+B-Cell+Epitope+of+Betanodavirus+Coat+Protein+by+RG-M18+Neutralizing+mAB+Inhibits+Giant+Grouper+Nervous+Necrosis+Virus+%28GGNNV%29+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection.</a> PLoS One. 10 (5), 0126121(2015).</li>
<li>Lai, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2761.2001.00303.x/abstract">Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue.</a> J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).</li>
<li>Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+HLA+typing+designed+for+solid+organ+transplantation%3A+epityping+and+its+application+to+the+HLA-A+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Immunogenet%22%5BJournal%5D)">A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus.</a> Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).</li>
<li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre%2Flox+based+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnol. 11, 24(2011).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Miraprep%3A+A+Protocol+that+Uses+a+Miniprep+Kit+and+Provides+Maxiprep+Yields%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields.</a> PLoS One. 11 (8), e0160509(2016).</li>
<li>Metzker, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+technologies+in+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Emerging technologies in DNA sequencing.</a> Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).</li>
<li>Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+ayu+%28Plecoglossus+altivelis%29+Pit-1+in+Escherichia+coli%3A+its+purification+and+immunohistochemical+detection+using+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody.</a> Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).</li>
<li>Atassi, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+structures+of+proteins.+Their+determination+has+revealed+important+aspects+of+immune+recognition+and+generated+strategies+for+synthetic+mimicking+of+protein+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites.</a> Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).</li>
<li>Opuni, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+epitope+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric epitope mapping.</a> Mass Spectrom Rev. , (2016).</li>
<li>Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. <a target="_blank" href="http://library.wur.nl/WebQuery/clc/1931063">The Aquaculture of Groupers</a>. Liao, I. C., Leaño, E. M. , Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).</li>
<li>Conti-Tronconi, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-bungarotoxin+and+the+competing+antibody+WF6+interact+with+different+amino+acids+within+the+same+cholinergic+subsite%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite.</a> Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).</li>
<li>Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+specificity+of+antibody+recognition+of+carcinoma-associated+epithelial+mucins%3A+antibody+binding+to+synthetic+peptide+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes.</a> Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).</li>
<li>Chen, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structures+of+a+Piscine+Betanodavirus%3A+Mechanisms+of+Capsid+Assembly+and+Viral+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection.</a> PLoS Pathog. 11 (10), e1005203(2015).</li>
<li>Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+entry+inhibitors+of+enveloped+viruses%3A+The+importance+of+interfacial+hydrophobicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity.</a> Biochim Biophys Acta. , (2014).</li>
<li>Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+putative+cellular+receptor+for+HIV-1+transmembrane+glycoprotein+using+synthetic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides.</a> AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).</li>
</ol>

Yazarların bu raporla ilgili herhangi bir çıkar çatışması bulunmamaktadır.

Bu protokol, mAb tanınan lineer epitopunu belirlemek için hızlı ve basit bir teknik sunmaktadır. dikkate peptit sentezi ve sentez peptidlerin üretim verimliliği maliyeti alarak, virüs kaplama proteininin antijenik bölgenin peptit tarama analizinden önce seri kesik rekombinant proteinleri ifade azaltılmıştır. 10 ila 50 arasındaki moleküler ağırlıklara sahip bir araya getiren proteinler kDa kolaylıkla bu sistem ile ifade edilebilir Bu nedenle, güvenli ve etkili bir E.coli pET ifade sistemi, bu seri olarak kısaltı...

Bağışıklık sisteminde, V, D ve J segmentlerinin rekombinasyon antikorları patojenik enfeksiyon ana korumak için çeşitli antijenlere bağlanması için tamamlayıcılığı belirleyici bölgelerinde (CDR&#39;ler) muazzam varyasyonlarını oluşturmak için sağlar. antijenlere karşı antikorların nötralize savunma antikorlarının CDR ve antijenlerin epitoplarına arasındaki mekansal tamamlayıcılık bağlıdır. Bu nedenle, bu moleküler etkileşim bir anlayış profilaktik aşı tasarımı ve terapötik peptid ilaç geliştirme yardımcı olacaktır. Bununla birlikte, bu nötrleştirme etkileşimi, tek bir antijen birden fazla antijenik alan ile ve dolayısıyla epitop belirleme süreci daha karmaşık hale antikor çoklu CDR&#39;ler, hem de etkilenebilir. Neyse ki, miyelom hücreleri ile, bireysel antikor üreten hücrelerin sigortalar hibridom teknolojisinin gelişmesi, sn hücrelerin sürekli bölünmesi toplu sağlarBir monoklonal antikor (mAb) olarak bilinen retenin belirli bir antikor, 1. Hibridoma hücreleri, spesifik antijenin tek bir antijenik alana bağlanabilir, bu, saf, yüksek afiniteli mAbs üretir. Kurulan antijen-antikor, peptit taraması dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar arasında bir ilişki ile, karşılık gelen mAb kullanan bir antijenin epitopunun belirlenmesi için kullanılabilir. sentetik peptid teknolojisindeki son gelişmeler peptid tarama tekniği daha erişilebilir ve gerçekleştirmek için daha uygun hale getirmiştir. Kısaca, üst üste binen sentetik peptidlere bir dizi, bir hedef bir antijen dizisine göre üretilir mAb hibridizasyona katı destekli zara ilişkilidir. Peptid tarama bölgesinin antikor bağlanmasını eşlemek için kolay bir yol sunar, ancak, aynı zamanda epitop peptit her AA tortu antikorun CDR arasındaki bağlanma etkileşimini değerlendirmek için tortu, tarama veya ikame arası amino asit (aa) mutagenez kolaylaştırmaktadır. 2, 3, 4 ile san bir orfoz sinir nekroz virüsü (YGNNV) kaplama proteininin lineer epitopa etkin tanımlanması için bir protokol açıklamaktadır. Protokol mAb, inşaat ve seri kesik rekombinant proteinlerin ekspresyonu sentetik üstüste binen peptit tasarım, nokta-benek hibridizasyonu, alanin tarama ve ikame mutagenezi bulunmaktadır. Peptit sentezi yüksek maliyeti göz önüne alındığında, seri arzu edilen bir hedef proteini rekombinant proteinleri kesilmesi aşamasının tadil edilmiş, ve sentetik peptid dizisi nokta-blot analizi gerçekleştirilmiştir önce antijenik bölge yaklaşık 100 ila 200 aa artıkları kadar daraltılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Hibrit-SFM ortamı</td><td>Gibco</td><td>12045-076</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos'un Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Pfu DNA Polimeraz&nbsp;</td><td>Termo Bilimsel&nbsp;</td><td>EP0502&nbsp;</td><td>Tamponlar dahil</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td>Tamponlar dahil</td></tr><tr><td>NdeI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>Tamponlar dahil</td></tr><tr><td>XhoI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Tamponlar</td></tr><tr><td>dahil pET-20b (+) vektör</td><td>Novagen, Merck Millipore</td><td>69739</td><td></td></tr><tr><td> E. coli DH-5 ve alfa; yetkili hücre</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH617</td><td></td></tr><tr><td> E. coli BL-21 (DE3) yetkili hücre</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH217</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB et suyu&nbsp;</td><td>Invitrongen</td><td>12780-052</td><td></td></tr><tr><td>İzopropiltio-&beta;-D-tiyogalaktozit (IPTG)</td><td>MDBio, Inc.</td><td>101-367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck Milipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Polioksietilen 20 Sorbitan Monolaurat (Tween-20)</td><td>JTBaker</td><td>X251-07</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Amresco</td><td>0167-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Affymetrix, USB</td><td>75825</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco</td><td>0241-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Amresco</td><td>0105-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaN 3 </td><td>Sigma</td><td>S2002-500G</td><td></td></tr><tr><td>BCIP / NBT</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL937001PK</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Fare IgG, Fc fragman antikoru</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (Poliviniliden florür, PVDF)</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Agaroz Hızlı</td><td>Akış Merck Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Saflaştırma kiti</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>UVP BioSpectrum 600 Görüntü Sistemi</td><td>UVP</td><td>yok</td><td></td></tr><tr><td>VisionWorks LS Analiz Yazılımı Sürüm 6.8</td><td>UVP</td><td>yok</td><td></td></tr><tr><td>MyCycler termal döngüleyici</td><td>BioRad</td><td>1709713</td><td></td></tr></tbody></table>

peptid, bir monoklonal antikor tarafından tanınan lineer b-hücresi epitopunun belirlenmesi: tarama destekli

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

bağışıklık sisteminin bir antijenik epitopa tanımlanması aşılar ve peptid ilaçların geliştirilmesi kolaylaştırabilir nötralize edici antikorların bir koruyucu mekanizma anlaşılabilmiştir. Peptid tarama delikanlı monoklonal bir antikor (mAb) tarafından tanınan lineer epitop harita basit ve etkili bir yöntemdir. Burada, yazarlar nötrleştirici mAb kullanılarak sinir nekroz virüsü kaplama proteininin antigenik tanınması için seri kesik rekombinant proteinleri, sentetik peptid tasarımı ve nokta-benek hibridizasyonu ile ilgili bir epitop belirlenmesi yöntemi sunulmaktadır. Bu teknik, bir poliviniliden florür (PVDF) membran üzerinde sentetik peptidler ve mAb&#39;lerin nokta benek hibridizasyonu dayanır. RG-M56 mAb tarafından tanınan bir viral kat proteininin en az antijenik bölge 6-mer peptit epitopu üzerine peptit haritalama kesilmiş adım adım daraltıldığı edilebilir. Buna ek olarak, alanin tarama mutajenezi ve tortu, altikamesi veya epitopu oluşturan her bir amino asit tortusu bağlanması önem karakterize etmek için gerçekleştirilebilir. epitop sitesini kuşatan kalıntıları peptid konformasyon düzenlenmesinde kritik roller oynamaya bulundu. tanımlanan epitop peptit bir X-ışını kırılım çalışmasının ve fonksiyonel rekabet veya tedavi için epitopunun peptid-antikor komplekslerinin kristalleri meydana getirmek üzere kullanılabilir.

Bu deneyin amacı, mAb kullanılarak nokta blotlama yoluyla bir epitopu belirlemek için yapıldı. Hızlı ve verimli bir şekilde mAb tarafından algılanan antijenik bölge daraltmak için, C-terminali bir 6xHis füzyon etiketidir tam boyunda ve seri olarak kesildi YGNNV rekombinant kaplama proteinleri bir E. coli pET ifade sistemi 10 (Şekil 1 A) ile ilgili olarak ifade edildi. Elde edilen rekombinant proteinleri nokta benek hibridizasyonu için RG-...

Burada yazarlar, saflaştırılmış bir monoklonal antikor ve nokta-leke hibridizasyonulama yoluyla peptit taraması kullanarak doğrusal bir antijenik epitop tanımlamak için basit ve verimli bir protokol sunmaktadır. Tanımlanan epitop daha sonra terapötik ve tanısal uygulamalarda kullanılabilir.

Peptid, bir monoklonal antikor tarafından tanınan lineer B-hücresi epitopunun belirlenmesi: Tarama destekli

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Bu protokolün genel amacı, seri olarak kısaltılmış rekombinant proteinler ve dot-blot hibridizasyon yöntemiyle peptid taraması kullanarak, monoklonal bir antikor tarafından tanınan lineer B-hücresi epitopunu belirlemektir. Bu yöntem, antijen ve antikor arasındaki moleküler etkileşime ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları basitliği ve verimliliğidir.Tanımlanan epitop daha sonra terapötik ve diyagnostik uygulamalar gibi daha kapsamlı araştırmalarda kullanılabilir. Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Chien-Wen Chen gerçekleştirecektir. Başlamak için, RGM56 fare monoklonal hibridoma hücrelerini serumsuz bir hibrit ortamda büyütün.Hücre kültürlerini 175 T flasklarda, 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit ortamında muhafaza edin. Beş günlük inkübasyonun ardından, sarı renge dönen kültür ortamını toplayın ve süpernatantı 4 °C'de, 30 dakika boyunca 4.500 ×g hızında santrifüjleyin. Ardından, çözeltideki antikoru elde etmek için çöken hücre kalıntılarını atın.Ardından, beş mililitrelik bir kolona iki mililitre %50 protein G agro slurry ekleyin ve reçineyi, önceden yüklenmiş reçine hacminin 10 katına denk gelen 10 mililitre buz gibi soğuk PBS ile dengeleyin. Önceden hazırlanmış antikor çözeltisinden 200 mililitreyi dengelenmiş kolona yükleyin ve kolonun içinden geçen fraksiyonu atın. Kolonu, 10 mililitre buz gibi soğuk PBS kullanarak iki kez yıkayın.Son olarak, antikoru reçineden ayırmak için kolona pH 2.7 değerinde 10 mililitre milimolar gliserin çözeltisi ekleyin. Daha önceden 100 mikrolitre 10X nötralizasyon tamponu ile doldurulmuş mikrosantrifüj tüplerine 900 mikrolitrelik fraksiyonlar toplayın. Saflaştırılmış antikoru, sodyum azid ile desteklenmiş %50 gliserol çözeltisi içinde -20 °C'de saklayın.Konstrüktleri hazırlayın ve E.coli BL21 hücrelerini metin protokolünde açıklandığı şekilde transforme edin. Ardından, tek bir koloniyi, 100 µg/mL ampisilin ile desteklenmiş 3 mL LB besiyeri içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve tüpün kapağını gevşekçe kapatın. Kültürü 37 °C'de 150 RPM çalkalama ile inkübe edin.Kültürün optik yoğunluğunu 600 nanometrede takip edin. Yoğunluk yaklaşık 0.6'ya ulaştığında, kültürü 25 degrees Celsius'ye soğutun. Ardından, rekombinant proteinin ekspresyonunu indüklemek için son konsantrasyonu 0.4 millimolar olacak şekilde IPTG ekleyin.Kültürü 25 °C'de 200 RPM çalkalamayla dört saat daha inkübe edin. İnkübasyon sonrası, bakteriyel kültürden bir mililitreyi bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri 12,000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı uzaklaştırın.Hücre peletini 100 µL denatürasyon tamponu içinde mikropipet ile yukarı-aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Kullanıma hazır rekombinant protein örneği elde etmek için ortaya çıkan süspansiyonu güçlü şekilde vorteksleyerek karıştırın. Dot-blot hibridizasyonuna devam etmek için her bir sentetik peptidi DMSO içinde çözerek 10 mg/mL çözeltiler hazırlayın.Ardından, PVDF membranı iki dakika boyunca metanol ile aktive edin ve iki dakika daha modifiye Towbin tamponu ile dengeleyin. Bir parça kromatografi kağıdını modifiye Towbin tamponu ile durulayın ve dengelenmiş PVDF membranı üzerine yerleştirin. Tampon yüzeyden kaybolana kadar membranı bekletin.10 µL'lik bir uç kullanarak, her bir peptit veya rekombinant protein örneğinden iki µL'yi membrana ekleyin ve 10 dakika boyunca havada kurumaya bırakın. Membran üzerine örnek damlatmak, bu protokolün en kritik adımıdır. PVDF membranının küçük bir alanına kesin miktarda örnek yüklemek dikkatli bir çalışma gerektirir.Ardından, membranı %5 yağsız süt ile desteklenmiş TBST tamponunda, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak bloke edin. RGM56 monoklonal antikoru, %5 yağsız süt ile desteklenmiş TBST tamponu içerisinde seyreltin ve antikor çözeltisini membrana ekleyin.Membranı 37 °C'de bir saat boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. İnkübasyonun ardından antikor çözeltisini uzaklaştırın. Ardından membranı, hafifçe çalkalayarak TBST tamponunda beşer dakikadan iki kez yıkayın.Ardından, %5 yağsız süt içeren TBST tamponunda seyreltilmiş sekonder antikor çözeltisini membrana ekleyin. Membranı 37 °C'de, hafifçe çalkalayarak bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından antikor çözeltisini dökün ve membranı hafifçe çalkalayarak TBST tamponu ile beşer dakikalık iki yıkama işlemine tabi tutun.Ardından, membranı oda sıcaklığında, karanlıkta 15 dakika boyunca substrat çözeltisi ile geliştirmeye bırakın. Sinyal ortaya çıktığında, membranı çift distile su ile yıkayarak reaksiyonu durdurun. Membran havada kuruduktan sonra, bir görüntüleme sistemi kullanarak dot-blot görüntüsünü yakalayın.Son olarak, görüntü analiz yazılımı kullanarak her bir dot-blot'un yoğunluğunu ölçün. Burada, 1 ile 338 arasındaki amino asitlerden oluşan tam uzunluktaki sinir nekrozu virüsü kod proteini ve onun seri olarak kısaltılmış varyantları sunulmuştur. Transforme edilmiş bakteriyel hücrelerdeki proteinlerin ekspresyonunu doğrulamak için anti-6XHis antikor kullanılarak dot-blot analizi yapılmış ve incelenen tüm proteinlerin varlığı gösterilmiştir.Ardından, rekombinant proteinler, RG-M56 monoklonal antikorunun kullanıldığı dot-blot hibridizasyonu ile analiz edildi. Analiz, antikor tarafından tanınan protein epitopunun 195 ila 338 arasındaki peptitte bulunduğunu ortaya koydu. Son olarak, peptid taraması ile 20 veya sekiz amino asit kalıntısından oluşan bir epitop tanımlandı.Alanin tarama, 197 ve 199 konumlarındaki valin kalıntılarının yanı sıra 201 konumundaki bir sistein ile yapılan değişimlerin, epitopun bağlanma kapasitesini ve dot-blot hibridizasyonunu ortadan kaldırdığını göstermiştir. Benzer şekilde, bağlanma yoğunluğu analizinde gözlemlenen azalmış bağlanma afinitesi, tanımlanan kalıntıların epitopun RGM56 monoklonal antikora bağlanması için temel olduğunu doğrulamıştır. Bu peptid tanımlama tekniği, terapötik peptid ilaçların veya peptid ilaçların geliştirilmesinde kullanılabilir.

peptide-scanning-assisted-identification-monoclonal-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Epitopa spesifik T-hücrelerinin alçak frekans popülasyonları izole etmek ve akış sitometrisi ile analiz etmek için bunları MHC tetramerleri ve manyetik mikro-küreler: Bu protokol peptit kullanımı açıklanmıştır. Bu yöntem ilgi endojen T hücre popülasyonlarının doğrudan çalışma...

Peptid: Epitop-spesifik T-hücrelerinin MHC tetramer bazlı Zenginleştirme

Bu video, histon peptitleri üzerindeki translasyon sonrası modifikasyonları (PTM'ler) tanıyan antikorların özgüllüğünü profillemek için peptit mikrodizi teknolojisini uygulayan bir tekniği göstermektedir. Bilinen PTM kombinasyonlarına sahip hareketsizleştirilmiş florofor konjuge histon peptitleri içeren bir mikrodizi slaytı, hedef PTM'ye özgü antikorlarla muamele edilir. Bu işlem, antikorun hedef için özgüllüğünü ve hedef olmayan PTM'lerle potansiyel çapraz reaktivitesini tanımlamaya yardımcı...

Antikorların Özgüllük Profili için Bir Peptit Mikroarray Teknolojisi

Rekombinant insan MHC II molekülleri ile biyokimyasal analizler hızlı, kantitatif immünojenik epitop tanımlaması içine anlayışlar, silme ya da tasarım sağlayabilir. Burada, 384 oyuklu plakalara ölçekli bir peptid MHC-II bağlama deneyi açıklanmıştır. Bu maliyet etkin biçim protein deimmunization ve aşı tasarım ve geliştirme alanlarında yararlı ispatlamak zorundadır.

Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi

Bu protokol, deniz memelilerinin miyoglobine güçlü bir şekilde reaktif olan iki IgG sınıfı monoklonal antikorun (mAb) gelişimini açıklar. Bu mAb'ler, deniz memelilerinin Mb'sini fok ve diğer hayvanlardan ayırt etmek için sandviç formatına dayalı bir kolloidal altın immünokromatografik test şeridi üzerine uygulanır.

Deniz Memelileri Miyoglobin Tespiti için bir Kolloidal Altın merkezli İmmunokromatografik Testi Strip Gelişimi

Biopanning bakteriyel görüntü kitaplıkları peptid benzeşme reaktifler, antikorlar için güçlü bir alternatif keşfi için kanıtlanmış bir tekniktir. Yarı Otomatik sıralama yöntemini burada yanlış pozitif oluşumunu azaltmak için biopanning aerodinamik. Burada düşünce süreci ve adayların değerlendirilmesi ve aşağı akım analizi en aza indirerek uygulanan teknikler gösterilmektedir.

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

İnsan lökosit antijeni (HLA) serileri organ donörü ve alıcı çiftleri arasındaki uyuşmazlıklar antikor aracılıklı ret organ nakli yapılan en önemli nedeni vardır. Burada Anti-donör HLA alloantibodies organ alıcıları içinde soruşturma için bireysel bağış HLA dizileri üzerinde temel alan özel antijen diziler kullanımı mevcut.

Peptid diziler HLA Alloantibodies Organ nakli olarak algılanması için kişiselleştirilmiş

Qa-1 (HLA-E insan) klasik olmayan MHC kompleksi 1b molekülleri bir gruba ait. Bağışıklama Qa-1-bağlama epitopları ile doku özgü bağışıklık yönetmelik çoğaltmak ve birkaç otoimmün hastalıkları iyileştirmek için gösterilmiştir. Burada biz bir protein Qa-1 epitopları tanımlanması için çakışan bir peptid Kütüphane strateji tanımlarlar.

Qa-1 epitopları bir protein eşlemek için çakışan Peptide Kütüphane

Biz insan kanında dolaşan nadir B hücreleri başlayarak insan antikorlar faiz, bir antijen için belirli üretim için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu doğal antikorlar nesil verimli ve hızlı ve elde edilen antikor arasında son derece ilgili antijenleri ayırt edebilirsiniz.

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

BSelex yöntemi tanımlamak ve insan periferik kan mononükleer hücrelerden bireysel antijen özgü antikorlar kurtarmak için tek hücreli PCR ve klonlama ile akış sitometri birleştirir.

Zenginleştirilmiş İnsan Hafızası B Hücre Popülasyonlarından İstenilen Özgülliklerle Antikorların Seçimi ve Geri Kazanımı İçin Tek Hücreli Tarama Yöntemi

Hepatit B virüsü (HBV) türevi peptit matrisi baz alınarak, HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtları HBV'ye özgü CD4 T hücreli epitopların tanımlanmasına paralel olarak değerlendirilebilir.

Peptit Matrisi Bazlı HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitoplarının HBV'ye Özgü CD4 T hücre yanıtlarının analizi ve tanımlanması

Öğrenin, dot-blot hibridizasyonu ve peptid tarama yöntemiyle monoklonal antikor tarafından tanınan lineer B-hücresi epitopunun nasıl belirleneceğini. Bu basit ve verimli teknik, terapötik ve tanısal uygulamalar için uygundur.

Peptid, bir monoklonal antikor tarafından tanınan lineer B-hücresi epitopunun belirlenmesi: Tarama destekli

Daha fazla video keşfet