Peptid, bir monoklonal antikor tarafından tanınan lineer B-hücresi epitopunun belirlenmesi: Tarama destekli

Bu protokolün genel amacı, seri olarak kısaltılmış rekombinant proteinler ve dot-blot hibridizasyon yöntemiyle peptid taraması kullanarak, monoklonal bir antikor tarafından tanınan lineer B-hücresi epitopunu belirlemektir. Bu yöntem, antijen ve antikor arasındaki moleküler etkileşime ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları basitliği ve verimliliğidir.

Tanımlanan epitop daha sonra terapötik ve diyagnostik uygulamalar gibi daha kapsamlı araştırmalarda kullanılabilir. Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Chien-Wen Chen gerçekleştirecektir. Başlamak için, RGM56 fare monoklonal hibridoma hücrelerini serumsuz bir hibrit ortamda büyütün.

Hücre kültürlerini 175 T flasklarda, 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit ortamında muhafaza edin. Beş günlük inkübasyonun ardından, sarı renge dönen kültür ortamını toplayın ve süpernatantı 4 °C'de, 30 dakika boyunca 4.500 ×g hızında santrifüjleyin. Ardından, çözeltideki antikoru elde etmek için çöken hücre kalıntılarını atın.

Ardından, beş mililitrelik bir kolona iki mililitre %50 protein G agro slurry ekleyin ve reçineyi, önceden yüklenmiş reçine hacminin 10 katına denk gelen 10 mililitre buz gibi soğuk PBS ile dengeleyin. Önceden hazırlanmış antikor çözeltisinden 200 mililitreyi dengelenmiş kolona yükleyin ve kolonun içinden geçen fraksiyonu atın. Kolonu, 10 mililitre buz gibi soğuk PBS kullanarak iki kez yıkayın.

Son olarak, antikoru reçineden ayırmak için kolona pH 2.7 değerinde 10 mililitre milimolar gliserin çözeltisi ekleyin. Daha önceden 100 mikrolitre 10X nötralizasyon tamponu ile doldurulmuş mikrosantrifüj tüplerine 900 mikrolitrelik fraksiyonlar toplayın. Saflaştırılmış antikoru, sodyum azid ile desteklenmiş %50 gliserol çözeltisi içinde -20 °C'de saklayın.

Konstrüktleri hazırlayın ve E.coli BL21 hücrelerini metin protokolünde açıklandığı şekilde transforme edin. Ardından, tek bir koloniyi, 100 µg/mL ampisilin ile desteklenmiş 3 mL LB besiyeri içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve tüpün kapağını gevşekçe kapatın. Kültürü 37 °C'de 150 RPM çalkalama ile inkübe edin.

Kültürün optik yoğunluğunu 600 nanometrede takip edin. Yoğunluk yaklaşık 0.6'ya ulaştığında, kültürü 25 degrees Celsius'ye soğutun. Ardından, rekombinant proteinin ekspresyonunu indüklemek için son konsantrasyonu 0.4 millimolar olacak şekilde IPTG ekleyin.

Kültürü 25 °C'de 200 RPM çalkalamayla dört saat daha inkübe edin. İnkübasyon sonrası, bakteriyel kültürden bir mililitreyi bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri 12,000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı uzaklaştırın.

Hücre peletini 100 µL denatürasyon tamponu içinde mikropipet ile yukarı-aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Kullanıma hazır rekombinant protein örneği elde etmek için ortaya çıkan süspansiyonu güçlü şekilde vorteksleyerek karıştırın. Dot-blot hibridizasyonuna devam etmek için her bir sentetik peptidi DMSO içinde çözerek 10 mg/mL çözeltiler hazırlayın.

Ardından, PVDF membranı iki dakika boyunca metanol ile aktive edin ve iki dakika daha modifiye Towbin tamponu ile dengeleyin. Bir parça kromatografi kağıdını modifiye Towbin tamponu ile durulayın ve dengelenmiş PVDF membranı üzerine yerleştirin. Tampon yüzeyden kaybolana kadar membranı bekletin.

10 µL'lik bir uç kullanarak, her bir peptit veya rekombinant protein örneğinden iki µL'yi membrana ekleyin ve 10 dakika boyunca havada kurumaya bırakın. Membran üzerine örnek damlatmak, bu protokolün en kritik adımıdır. PVDF membranının küçük bir alanına kesin miktarda örnek yüklemek dikkatli bir çalışma gerektirir.

Ardından, membranı %5 yağsız süt ile desteklenmiş TBST tamponunda, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak bloke edin. RGM56 monoklonal antikoru, %5 yağsız süt ile desteklenmiş TBST tamponu içerisinde seyreltin ve antikor çözeltisini membrana ekleyin.

Membranı 37 °C'de bir saat boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. İnkübasyonun ardından antikor çözeltisini uzaklaştırın. Ardından membranı, hafifçe çalkalayarak TBST tamponunda beşer dakikadan iki kez yıkayın.

Ardından, %5 yağsız süt içeren TBST tamponunda seyreltilmiş sekonder antikor çözeltisini membrana ekleyin. Membranı 37 °C'de, hafifçe çalkalayarak bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından antikor çözeltisini dökün ve membranı hafifçe çalkalayarak TBST tamponu ile beşer dakikalık iki yıkama işlemine tabi tutun.

Ardından, membranı oda sıcaklığında, karanlıkta 15 dakika boyunca substrat çözeltisi ile geliştirmeye bırakın. Sinyal ortaya çıktığında, membranı çift distile su ile yıkayarak reaksiyonu durdurun. Membran havada kuruduktan sonra, bir görüntüleme sistemi kullanarak dot-blot görüntüsünü yakalayın.

Son olarak, görüntü analiz yazılımı kullanarak her bir dot-blot'un yoğunluğunu ölçün. Burada, 1 ile 338 arasındaki amino asitlerden oluşan tam uzunluktaki sinir nekrozu virüsü kod proteini ve onun seri olarak kısaltılmış varyantları sunulmuştur. Transforme edilmiş bakteriyel hücrelerdeki proteinlerin ekspresyonunu doğrulamak için anti-6XHis antikor kullanılarak dot-blot analizi yapılmış ve incelenen tüm proteinlerin varlığı gösterilmiştir.

Ardından, rekombinant proteinler, RG-M56 monoklonal antikorunun kullanıldığı dot-blot hibridizasyonu ile analiz edildi. Analiz, antikor tarafından tanınan protein epitopunun 195 ila 338 arasındaki peptitte bulunduğunu ortaya koydu. Son olarak, peptid taraması ile 20 veya sekiz amino asit kalıntısından oluşan bir epitop tanımlandı.

Alanin tarama, 197 ve 199 konumlarındaki valin kalıntılarının yanı sıra 201 konumundaki bir sistein ile yapılan değişimlerin, epitopun bağlanma kapasitesini ve dot-blot hibridizasyonunu ortadan kaldırdığını göstermiştir. Benzer şekilde, bağlanma yoğunluğu analizinde gözlemlenen azalmış bağlanma afinitesi, tanımlanan kalıntıların epitopun RGM56 monoklonal antikora bağlanması için temel olduğunu doğrulamıştır. Bu peptid tanımlama tekniği, terapötik peptid ilaçların veya peptid ilaçların geliştirilmesinde kullanılabilir.