Peptid, bir monoklonal antikor tarafından tanınan lineer B-hücresi epitopunun belirlenmesi: Tarama destekli

Bu protokolün genel amacı, seri olarak kesilmiş rekombinant proteinler ve nokta-blot hibridizasyonulama ile peptit taraması kullanarak monoklonal antikor tarafından tanınan doğrusal B hücresi epitopunu tanımlamaktır. Bu yöntem, antijen ve antikor arasındaki molekül etkileşimi ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları basitliği ve verimliliğidir.

Tanımlayıcı epitop daha sonra terapötik ve tanısal uygulamalar gibi daha kapsamlı araştırmalarda kullanılabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan doktora sonrası bir öğrenci olan Chien-Wen Chen olacak. Başlamak için, RGM56 fare monoklonal hibridoma hücrelerini hibrit serum içermeyen bir ortamda büyütün.

Hücre kültürlerini 175 T'lik şişelerde 37 santigrat derece% 5 karbondioksitte tutun. Beş günlük inkübasyondan sonra, sarardıktan sonra kültür ortamını toplayın ve süpernatanı dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 4.500 kez G'de santrifüjleyin. Ardından, çözelti içindeki antikoru elde etmek için peletlenmiş hücre kalıntılarını atın.

Daha sonra, beş mililitrelik bir kolona iki mililitre% 50 protein G agro bulamacı ekleyin ve reçineyi 10 mililitre buz gibi soğuk PBS ile dengeleyin, bu da 10 hacim önceden yüklenmiş reçineye eşittir. Önceden hazırlanmış antikor çözeltisinin 200 mililitresini dengelenmiş kolona yükleyin ve kolondan geçen fraksiyonu atın. 10 mililitre buz gibi soğuk PBS kullanarak, sütunu iki kez yıkayın.

Son olarak, antikoru reçineden yağmalamak için, kolona pH 2.7'de 10 milimolar gliserin çözeltisi ekleyin. Daha önce 100 mikrolitre 10X nötralizasyon tamponu ile doldurulmuş mikrosantrifüj tüplerinde 900 mikrolitrelik fraksiyonları toplayın. Saflaştırılmış antikoru, eksi 20 santigrat derecede sodyum azid ile desteklenmiş% 50 gliserol çözeltisinde saklayın.

Yapıları hazırlayın ve E.coli BL21 hücrelerini metin protokolünde açıklandığı gibi dönüştürün. Daha sonra, tek bir koloniyi, mililitre ampisilin başına 100 mikrogram ile desteklenmiş üç mililitre LB suyu içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpü gevşek bir şekilde kapatın. Kültürü 150 RPM çalkalama ile 37 santigrat derecede inkübe edin.

Kültürün optik yoğunluğunu 600 nanometrede izleyin. Yaklaşık 0.6'ya ulaştığında, kültürü 25 santigrat dereceye kadar soğutun. Daha sonra, rekombinant proteinin ekspresyonunu indüklemek için 0.4 milimolar nihai konsantrasyonda IPTG ekleyin.

Kültürü, 200 RPM çalkalama ile 25 santigrat derecede dört saat daha inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bakteri kültürünün bir mililitresini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri bir dakika boyunca 12.000 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Bir mikropipet ile yukarı ve aşağı pipetleyerek, hücre peletini 100 mikrolitre denatürasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Ve elde edilen süspansiyonu, kullanıma hazır bir rekombinant protein örneği elde etmek için kuvvetli girdaplama ile karıştırın. Nokta-leke hibridizasyonuna devam etmek için, mililitre çözelti başına 10 miligram elde etmek için her bir sentetik peptidi DMSO'da çözün.

Ardından, PVDF membranını metanol içinde iki dakika etkinleştirin ve iki dakika daha modifiye Towbin tamponu ile dengeleyin. Bir parça kromatografi kağıdını modifiye Towbin tamponu ile durulayın ve dengelenmiş PVDF membranını üzerine yerleştirin. Tampon yüzeyinden kaybolana kadar membranın oturmasına izin verin.

10 mikrolitrelik bir uç kullanarak, her bir peptit veya rekombinant protein örneğinden iki mikrolitre zarın üzerine ekleyin ve 10 dakika kurumaya bırakın. Zar üzerine bir sembol tespit etmek, bu protokoldeki en kritik adımdır. PVDF membranının küçük bir alanına kesin miktarda numune yüklemek dikkatli bir dikkat gerektirir.

Daha sonra, zarı %5 yağsız sütle takviye edilmiş TBST tamponunda oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak bloke edin. RGM56 monoklonal antikorunu% 5 yağsız süt ile desteklenmiş TBST tamponunda seyreltin. Ve antikor çözeltisini zara ekleyin.

Membranı 37 santigrat derecede bir saat boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. İnkübasyondan sonra, antikor çözeltisini çıkarın. Ve membranı TBST tamponunda iki kez hafifçe çalkalayarak beş dakika boyunca yıkayın.

Daha sonra,% 5 yağsız süt ile TBST tamponu içinde seyreltilmiş ikincil antikor çözeltisini zara ekleyin. Membranı hafifçe çalkalayarak 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, antikor çözeltisini atın ve zarı TBST tamponunda iki kez beş dakika boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın.

Ardından, karanlıkta 15 dakika boyunca oda sıcaklığında substrat çözeltisi ile zarı geliştirin. Sinyal göründüğünde, zarı iki kez damıtılmış suyla yıkayarak reaksiyonu durdurun. Membranı havayla kuruttuktan sonra, bir görüntüleme sistemi kullanarak nokta lekesi görüntüsünü yakalayın.

Son olarak, görüntü analiz yazılımı kullanarak her bir nokta lekesinin yoğunluğunu ölçün. Burada sunulan, seri olarak kesilmiş varyantları ile birlikte bir ila 338 amino asitleri içeren tam uzunlukta sinir nekroz virüsü kod proteinidir. Transforme edilmiş bakteri hücrelerindeki proteinlerin ekspresyonunu doğrulamak için, araştırılan tüm proteinlerin varlığını gösteren anti-6XHis antikoru kullanılarak nokta-blot analizi yapıldı.

Daha sonra, rekombinant proteinler, RG-M56 monoklonal antikorunun kullanıldığı nokta-blot hibridizasyonulama ile analiz edildi. Analiz, antikor tarafından tanınan protein epitopunun peptit 195 ila 338'de bulunduğunu ortaya koydu. Son olarak, peptit taraması ile 20 veya sekiz amino asit kalıntısından oluşan bir epitop tanımlandı.

Alanin taraması, 197 ve 199 pozisyonlarında valin kalıntılarının ve 201'de bir sistin ikamelerinin, epitopun bağlanma kabiliyetini ve nokta-blot hibridizasyonunu ortadan kaldırdığını gösterdi. Benzer şekilde, bağlanma yoğunluğu analizinde azalmış bağlanma afinitesi gözlendi ve tanımlanan kalıntıların epitopun RGM56 monoklonal antikoruna bağlanması için gerekli olduğunu doğruladı. Bu peptit tanımlama tekniği, terapötik peptit ilaçları veya peptit ilaçları geliştirmek için kullanılabilir.