Genetik Taramalar
Genetik taramalar, ilgilenilen fenotiplerden sorumlu genleri ve mutasyonları tanımlamak ve genlerin biyolojik süreçlerde nasıl işlev gördüğünü anlamak için önemli araçlardır. Taramalar, sinekler, solucanlar, bitkiler ve hücre kültürü dahil olmak üzere çeşitli model sistemlerde gerçekleştirilir ve insan hastalıkları için yeni hücresel yolların ve potansiyel ilaç hedeflerinin keşfedilmesine yol açmıştır.
Bu video, farklı genetik ekran türlerine genel bir bakış sunacak, nematod solucanlarındaki ekranlar için iki genel protokolü açıklayacak ve günümüzde laboratuvarlarda ekranların nasıl uygulandığını gösterecektir.
İlk olarak, genetik taramaların ne olduğuna ve onlardan neler öğrenebileceğimize bir göz atalım.
Genetik taramalar ileri veya geri genetiğe dayanır. İleri veya "klasik" bir genetik ekranda, mutasyonlar, mutajenler olarak bilinen radyasyon veya kimyasallar kullanılarak bir organizmanın DNA'sında rastgele oluşturulur. Örneğin, genom içinde farklı pozisyonlarda bütünleşebilen ve içine girdikleri genlerin işlevini bozabilen transpozonlar olarak bilinen diziler kullanılarak DNA'ya ek bazlar da eklenebilir. Bu tür eklemeler, mutasyona uğramış organizmaların doğrudan tespit edilmesini sağlamak için genellikle floresan raportörlerle birleştirilir. Bir mutantın ilgilenilen bir fenotip sergilediği bulunduğunda, mutasyona uğrayan bilinmeyen gen daha sonra bir kromozoma eşlenebilir ve dizilenebilir.
Taramaya zıt yaklaşım, araştırmacıların birçok aday genin ekspresyonunu bozduğu ve daha sonra bu manipülasyonlardan kaynaklanan mutant fenotipleri aradığı ters bir genetik ekrandır.
Bir genin aktivitesini bozan "fonksiyon kaybı" mutasyonlarına ek olarak, genetik taramalar, bir genin ekspresyonunun veya işlevselliğinin artmasına neden olan "fonksiyon kazancı" mutasyonlarına da dayanabilir. Bu, gen düzenleyici elementlerin genoma rastgele yerleştirilmesiyle başarılabilir, bu da elementin yukarı akışa eklediği bir genin aşırı ekspresyonunu tetikleyecektir.
Alternatif olarak, "ekspresyon taraması" adı verilen bir yöntemde, araştırmacılar, çeşitli genlerin protein kodlayan dizilerini içeren plazmit kütüphanelerini kullanırlar ve bunları, genlerin yüksek oranda eksprese edileceği hücrelere sokarlar. Elde edilen fenotipler daha sonra gen fonksiyonunu anlamak için kullanılabilir.
Bilinen bir gen veya mutasyon hakkında daha fazla bilgi ortaya çıkarmak için değiştirici ekranlar kullanılabilir. Bir baskılayıcı ekran, karakterize edilmiş bir mutant ile başlar ve mutant fenotipini daha az şiddetli hale getiren ek mutasyonları tanımlar. Orijinal mutasyonla aynı gende bulunan bir baskılayıcı mutasyon "intragenik" olarak adlandırılırken, farklı bir gende bulunan bir baskılayıcı mutasyon "ekstragenik" olarak kabul edilir.
Buna karşılık, güçlendirici ekranlar mutant bir fenotipin şiddetini artıran ek mutasyonları tanımlar. Bunlar, gereksiz olan veya işlevsel olarak etkileşime girebilen genleri belirlemek için yardımcı olabilir. İki veya daha fazla mutasyonun kombinasyonu ciddi şekilde bozulmuş büyüme ve hatta ölümle sonuçlanırsa, duruma "sentetik hastalık veya ölümcüllük" denir. Sentetik hasta veya ölümcül mutasyonlar için bir tarama, gereksiz, ancak gerekli biyolojik yollarda işlev gören genleri ortaya çıkarır. Bu, örneğin, kanser hücrelerini öldürmek için ilaçlarla aynı anda hedeflenebilen birden fazla gen ürününün tanımlanmasında özellikle yararlıdır.
Artık bazı yaygın genetik tarama stratejilerini anladığınıza göre, popüler bir model organizma olan nematod solucanında ileri ekran için genel bir protokole bakalım.
Bu örnekte, kimyasal mutajenez, guanin nükleotidlerini kimyasal olarak modifiye ederek çalışan ve sonraki DNA replikasyon turlarında timin ile uygunsuz bir şekilde eşleşmelerine neden olan etil metansülfonat veya EMS ile gerçekleştirilecektir. EMS bir mutajen ve olası bir kanserojen olduğundan, yalnızca çift kat eldiven giyilirken ele alınmalı ve çalışma çeker ocakta yapılmalıdır.
Başlamak için, son larva aşamasında çok sayıda solucan seçilir, yıkanır ve toplanır. EMS daha sonra solucanlara eklenir ve solucanlar mutasyonları indüklemek için birkaç saat kuluçkaya yatırılır. Mutajenezi takiben, EMS solucanlardan uzaklaştırılmalı ve sodyum hidroksit ile inaktive edilmelidir. Solucanlar daha sonra büyüme ortamında birçok kez yıkanır ve agar plakalarına kaplanır.
Daha sonra, sağlıklı görünen solucanlar, besin kaynağı olarak bakterilerle taze tohumlanmış yeni plakalara aktarılır ve üremelerine izin verilir. İkinci nesil döller, lokomotif kusurları gibi mutant fenotipler için görsel olarak taranabilir.
Şimdi, nematodlarda ters genetik tarama için bir protokol üzerinden geçelim.
Solucanlarda ters taramalar yapmak için yaygın bir yaklaşım, hayvanlara, bakteri suşu başına bir tane olmak üzere çift sarmallı RNA'ları ifade eden bir bakteri kütüphanesini beslemektir, bu da solucanların her birinde bir aday genin ekspresyonunu azaltacaktır. Bu kitaplıklar genellikle ticari olarak temin edilebilir ve ekranlarda kullanılmak üzere alt kültüre alınabilir.
Başlamak için, bireysel kütüphane klonları içeren tek bakteri kolonileri kültürlenir ve çift sarmallı RNA üretimi indüklenir. Kültürler daha sonra nematod büyüme ortamı olan bir plakanın ayrı oyuklarına lekelenir ve steril bir davlumbazda kurumaya bırakılır.
Daha sonra, solucanlar bakterilerin üzerine kaplanır ve üç ila dört gün boyunca nemlendirilmiş bir odada beslenmelerine izin verilir. Mutant fenotipler, besleme plakalarına yerleştirilen orijinal solucanlarda veya birinci nesil döllerde hızlı bir şekilde gözlemlenebilir.
Artık ileri ve geri genetik taramaların nasıl yapıldığını gördüğünüze göre, mevcut uygulamalarından bazılarını tartışalım.
Bazı genetik ekranlar, bilim adamlarının aynı moleküler yolda fiziksel olarak etkileşime giren veya işlev gören proteinleri tanımlamalarına yardımcı olmak için kullanılır. Bu deneyde, bilim adamları, belirli bir sinyal molekülünü aktive eden yeni transmembran reseptörlerini keşfetmek için yüksek verimli mikroskopi tabanlı bir ekran tasarladılar. Floresan etiketli sinyal proteinini içeren insan embriyonik böbrek hücrelerinde çeşitli genleri aşırı eksprese ederek, hangi reseptörlerin proteinin hücre altı lokalizasyonunu etkilediğini izleyebildiler.
Genetik taramanın bir başka uygulaması, gen-ilaç etkileşimlerinin karakterizasyonudur. Burada, transpozon eklemeleri ile büyük ölçekli rastgele mutajenez kullanılarak bir mutant maya kütüphanesi oluşturuldu. Her mutant suş daha sonra bir ilacın varlığında büyütüldü. Her bir suşun büyümesi, mutasyona uğramamış kontrollere kıyasla hangi mutantların ilaç tedavisine duyarlı olduğunu belirlemek için PCR ve ardından mikrodiziler veya sıralama analizi kullanılarak ölçüldü.
Son olarak, ekranlar insan hastalıklarında bozulan genleri ve moleküler ağları anlamak için kullanılabilir. Bu deneydeki araştırmacılar, birçok farklı hedef genin ekspresyonunu yıkmak için RNA kodlayan virüslerin varlığında nöronları kültürlediler. İmmün lekeli hücrelerin otomatik analizi daha sonra nörit büyümesi gibi nöronların fiziksel özelliklerini etkileyen genleri ortaya çıkarmak için kullanıldı. Bu yaklaşım, nörodejeneratif hastalıklarda rol oynayan genleri başarıyla tanımlamıştır.
Az önce JoVE'nin videosunu genetik ekranlarda izlediniz - önemli biyolojik süreçlerde yer alan genleri ortaya çıkarmak için güçlü bir teknik. Bu videoda, bazı ana genetik tarama türlerini, hem ileri hem de geri taramaları gerçekleştirmek için genel protokolleri gözden geçirdik ve bu yöntemlerin bugün laboratuvarlarda nasıl uygulandığını tartıştık. İzlediğiniz için teşekkürler!
Genetik taramalar, gen fonksiyonunu tanımlamak ve gen etkileşimlerini anlamak için kritik araçlardır. Ekranlar tipik olarak genlerin mutasyona uğramas…
Genetik taramalar, ilgilenilen fenotiplerden sorumlu genleri ve mutasyonları tanımlamak ve genlerin biyolojik süreçlerde nasıl işlev gördüğünü anlamak için önemli araçlardır. Taramalar, sinekler, solucanlar, bitkiler ve hücre kültürü dahil olmak üzere çeşitli model sistemlerde gerçekleştirilir ve insan hastalıkları için yeni hücresel yolların ve potansiyel ilaç hedeflerinin keşfedilmesine yol açmıştır.
Bu video, farklı genetik ekran türlerine genel bir bakış sunacak, nematod solucanlarındaki ekranlar için iki genel protokolü açıklayacak ve günümüzde laboratuvarlarda ekranların nasıl uygulandığını gösterecektir.
İlk olarak, genetik taramaların ne olduğuna ve onlardan neler öğrenebileceğimize bir göz atalım.
Genetik taramalar ileri veya geri genetiğe dayanır. İleri veya "klasik" bir genetik ekranda, mutasyonlar, mutajenler olarak bilinen radyasyon veya kimyasallar kullanılarak bir organizmanın DNA'sında rastgele oluşturulur. Örneğin, genom içinde farklı pozisyonlarda bütünleşebilen ve içine girdikleri genlerin işlevini bozabilen transpozonlar olarak bilinen diziler kullanılarak DNA'ya ek bazlar da eklenebilir. Bu tür eklemeler, mutasyona uğramış organizmaların doğrudan tespit edilmesini sağlamak için genellikle floresan raportörlerle birleştirilir. Bir mutantın ilgilenilen bir fenotip sergilediği bulunduğunda, mutasyona uğrayan bilinmeyen gen daha sonra bir kromozoma eşlenebilir ve dizilenebilir.
Taramaya zıt yaklaşım, araştırmacıların birçok aday genin ekspresyonunu bozduğu ve daha sonra bu manipülasyonlardan kaynaklanan mutant fenotipleri aradığı ters bir genetik ekrandır.
Bir genin aktivitesini bozan "fonksiyon kaybı" mutasyonlarına ek olarak, genetik taramalar, bir genin ekspresyonunun veya işlevselliğinin artmasına neden olan "fonksiyon kazancı" mutasyonlarına da dayanabilir. Bu, gen düzenleyici elementlerin genoma rastgele yerleştirilmesiyle başarılabilir, bu da elementin yukarı akışa eklediği bir genin aşırı ekspresyonunu tetikleyecektir.
Alternatif olarak, "ekspresyon taraması" adı verilen bir yöntemde, araştırmacılar, çeşitli genlerin protein kodlayan dizilerini içeren plazmit kütüphanelerini kullanırlar ve bunları, genlerin yüksek oranda eksprese edileceği hücrelere sokarlar. Elde edilen fenotipler daha sonra gen fonksiyonunu anlamak için kullanılabilir.
Bilinen bir gen veya mutasyon hakkında daha fazla bilgi ortaya çıkarmak için değiştirici ekranlar kullanılabilir. Bir baskılayıcı ekran, karakterize edilmiş bir mutant ile başlar ve mutant fenotipini daha az şiddetli hale getiren ek mutasyonları tanımlar. Orijinal mutasyonla aynı gende bulunan bir baskılayıcı mutasyon "intragenik" olarak adlandırılırken, farklı bir gende bulunan bir baskılayıcı mutasyon "ekstragenik" olarak kabul edilir.
Buna karşılık, güçlendirici ekranlar mutant bir fenotipin şiddetini artıran ek mutasyonları tanımlar. Bunlar, gereksiz olan veya işlevsel olarak etkileşime girebilen genleri belirlemek için yardımcı olabilir. İki veya daha fazla mutasyonun kombinasyonu ciddi şekilde bozulmuş büyüme ve hatta ölümle sonuçlanırsa, duruma "sentetik hastalık veya ölümcüllük" denir. Sentetik hasta veya ölümcül mutasyonlar için bir tarama, gereksiz, ancak gerekli biyolojik yollarda işlev gören genleri ortaya çıkarır. Bu, örneğin, kanser hücrelerini öldürmek için ilaçlarla aynı anda hedeflenebilen birden fazla gen ürününün tanımlanmasında özellikle yararlıdır.
Artık bazı yaygın genetik tarama stratejilerini anladığınıza göre, popüler bir model organizma olan nematod solucanında ileri ekran için genel bir protokole bakalım.
Bu örnekte, kimyasal mutajenez, guanin nükleotidlerini kimyasal olarak modifiye ederek çalışan ve sonraki DNA replikasyon turlarında timin ile uygunsuz bir şekilde eşleşmelerine neden olan etil metansülfonat veya EMS ile gerçekleştirilecektir. EMS bir mutajen ve olası bir kanserojen olduğundan, yalnızca çift kat eldiven giyilirken ele alınmalı ve çalışma çeker ocakta yapılmalıdır.
Başlamak için, son larva aşamasında çok sayıda solucan seçilir, yıkanır ve toplanır. EMS daha sonra solucanlara eklenir ve solucanlar mutasyonları indüklemek için birkaç saat kuluçkaya yatırılır. Mutajenezi takiben, EMS solucanlardan uzaklaştırılmalı ve sodyum hidroksit ile inaktive edilmelidir. Solucanlar daha sonra büyüme ortamında birçok kez yıkanır ve agar plakalarına kaplanır.
Daha sonra, sağlıklı görünen solucanlar, besin kaynağı olarak bakterilerle taze tohumlanmış yeni plakalara aktarılır ve üremelerine izin verilir. İkinci nesil döller, lokomotif kusurları gibi mutant fenotipler için görsel olarak taranabilir.
Şimdi, nematodlarda ters genetik tarama için bir protokol üzerinden geçelim.
Solucanlarda ters taramalar yapmak için yaygın bir yaklaşım, hayvanlara, bakteri suşu başına bir tane olmak üzere çift sarmallı RNA'ları ifade eden bir bakteri kütüphanesini beslemektir, bu da solucanların her birinde bir aday genin ekspresyonunu azaltacaktır. Bu kitaplıklar genellikle ticari olarak temin edilebilir ve ekranlarda kullanılmak üzere alt kültüre alınabilir.
Başlamak için, bireysel kütüphane klonları içeren tek bakteri kolonileri kültürlenir ve çift sarmallı RNA üretimi indüklenir. Kültürler daha sonra nematod büyüme ortamı olan bir plakanın ayrı oyuklarına lekelenir ve steril bir davlumbazda kurumaya bırakılır.
Daha sonra, solucanlar bakterilerin üzerine kaplanır ve üç ila dört gün boyunca nemlendirilmiş bir odada beslenmelerine izin verilir. Mutant fenotipler, besleme plakalarına yerleştirilen orijinal solucanlarda veya birinci nesil döllerde hızlı bir şekilde gözlemlenebilir.
Artık ileri ve geri genetik taramaların nasıl yapıldığını gördüğünüze göre, mevcut uygulamalarından bazılarını tartışalım.
Bazı genetik ekranlar, bilim adamlarının aynı moleküler yolda fiziksel olarak etkileşime giren veya işlev gören proteinleri tanımlamalarına yardımcı olmak için kullanılır. Bu deneyde, bilim adamları, belirli bir sinyal molekülünü aktive eden yeni transmembran reseptörlerini keşfetmek için yüksek verimli mikroskopi tabanlı bir ekran tasarladılar. Floresan etiketli sinyal proteinini içeren insan embriyonik böbrek hücrelerinde çeşitli genleri aşırı eksprese ederek, hangi reseptörlerin proteinin hücre altı lokalizasyonunu etkilediğini izleyebildiler.
Genetik taramanın bir başka uygulaması, gen-ilaç etkileşimlerinin karakterizasyonudur. Burada, transpozon eklemeleri ile büyük ölçekli rastgele mutajenez kullanılarak bir mutant maya kütüphanesi oluşturuldu. Her mutant suş daha sonra bir ilacın varlığında büyütüldü. Her bir suşun büyümesi, mutasyona uğramamış kontrollere kıyasla hangi mutantların ilaç tedavisine duyarlı olduğunu belirlemek için PCR ve ardından mikrodiziler veya sıralama analizi kullanılarak ölçüldü.
Son olarak, ekranlar insan hastalıklarında bozulan genleri ve moleküler ağları anlamak için kullanılabilir. Bu deneydeki araştırmacılar, birçok farklı hedef genin ekspresyonunu yıkmak için RNA kodlayan virüslerin varlığında nöronları kültürlediler. İmmün lekeli hücrelerin otomatik analizi daha sonra nörit büyümesi gibi nöronların fiziksel özelliklerini etkileyen genleri ortaya çıkarmak için kullanıldı. Bu yaklaşım, nörodejeneratif hastalıklarda rol oynayan genleri başarıyla tanımlamıştır.
Az önce JoVE'nin videosunu genetik ekranlarda izlediniz - önemli biyolojik süreçlerde yer alan genleri ortaya çıkarmak için güçlü bir teknik. Bu videoda, bazı ana genetik tarama türlerini, hem ileri hem de geri taramaları gerçekleştirmek için genel protokolleri gözden geçirdik ve bu yöntemlerin bugün laboratuvarlarda nasıl uygulandığını tartıştık. İzlediğiniz için teşekkürler!
Genetik taramalar, ilgilenilen fenotiplerden sorumlu genleri ve mutasyonları tanımlamak ve genlerin biyolojik süreçlerde nasıl işlev gördüğünü anlamak için önemli araçlardır. Taramalar, sinekler, solucanlar, bitkiler ve hücre kültürü dahil olmak üzere çeşitli model sistemlerde gerçekleştirilir ve insan hastalıkları için yeni hücresel yolların ve potansiyel ilaç hedeflerinin keşfedilmesine yol açmıştır.
Bu video, farklı genetik ekran türlerine genel bir bakış sunacak, nematod solucanlarındaki ekranlar için iki genel protokolü açıklayacak ve günümüzde laboratuvarlarda ekranların nasıl uygulandığını gösterecektir.
İlk olarak, genetik taramaların ne olduğuna ve onlardan neler öğrenebileceğimize bir göz atalım.
Genetik taramalar ileri veya geri genetiğe dayanır. İleri veya "klasik" bir genetik ekranda, mutasyonlar, mutajenler olarak bilinen radyasyon veya kimyasallar kullanılarak bir organizmanın DNA'sında rastgele oluşturulur. Örneğin, genom içinde farklı pozisyonlarda bütünleşebilen ve içine girdikleri genlerin işlevini bozabilen transpozonlar olarak bilinen diziler kullanılarak DNA'ya ek bazlar da eklenebilir. Bu tür eklemeler, mutasyona uğramış organizmaların doğrudan tespit edilmesini sağlamak için genellikle floresan raportörlerle birleştirilir. Bir mutantın ilgilenilen bir fenotip sergilediği bulunduğunda, mutasyona uğrayan bilinmeyen gen daha sonra bir kromozoma eşlenebilir ve dizilenebilir.
Taramaya zıt yaklaşım, araştırmacıların birçok aday genin ekspresyonunu bozduğu ve daha sonra bu manipülasyonlardan kaynaklanan mutant fenotipleri aradığı ters bir genetik ekrandır.
Bir genin aktivitesini bozan "fonksiyon kaybı" mutasyonlarına ek olarak, genetik taramalar, bir genin ekspresyonunun veya işlevselliğinin artmasına neden olan "fonksiyon kazancı" mutasyonlarına da dayanabilir. Bu, gen düzenleyici elementlerin genoma rastgele yerleştirilmesiyle başarılabilir, bu da elementin yukarı akışa eklediği bir genin aşırı ekspresyonunu tetikleyecektir.
Alternatif olarak, "ekspresyon taraması" adı verilen bir yöntemde, araştırmacılar, çeşitli genlerin protein kodlayan dizilerini içeren plazmit kütüphanelerini kullanırlar ve bunları, genlerin yüksek oranda eksprese edileceği hücrelere sokarlar. Elde edilen fenotipler daha sonra gen fonksiyonunu anlamak için kullanılabilir.
Bilinen bir gen veya mutasyon hakkında daha fazla bilgi ortaya çıkarmak için değiştirici ekranlar kullanılabilir. Bir baskılayıcı ekran, karakterize edilmiş bir mutant ile başlar ve mutant fenotipini daha az şiddetli hale getiren ek mutasyonları tanımlar. Orijinal mutasyonla aynı gende bulunan bir baskılayıcı mutasyon "intragenik" olarak adlandırılırken, farklı bir gende bulunan bir baskılayıcı mutasyon "ekstragenik" olarak kabul edilir.
Buna karşılık, güçlendirici ekranlar mutant bir fenotipin şiddetini artıran ek mutasyonları tanımlar. Bunlar, gereksiz olan veya işlevsel olarak etkileşime girebilen genleri belirlemek için yardımcı olabilir. İki veya daha fazla mutasyonun kombinasyonu ciddi şekilde bozulmuş büyüme ve hatta ölümle sonuçlanırsa, duruma "sentetik hastalık veya ölümcüllük" denir. Sentetik hasta veya ölümcül mutasyonlar için bir tarama, gereksiz, ancak gerekli biyolojik yollarda işlev gören genleri ortaya çıkarır. Bu, örneğin, kanser hücrelerini öldürmek için ilaçlarla aynı anda hedeflenebilen birden fazla gen ürününün tanımlanmasında özellikle yararlıdır.
Artık bazı yaygın genetik tarama stratejilerini anladığınıza göre, popüler bir model organizma olan nematod solucanında ileri ekran için genel bir protokole bakalım.
Bu örnekte, kimyasal mutajenez, guanin nükleotidlerini kimyasal olarak modifiye ederek çalışan ve sonraki DNA replikasyon turlarında timin ile uygunsuz bir şekilde eşleşmelerine neden olan etil metansülfonat veya EMS ile gerçekleştirilecektir. EMS bir mutajen ve olası bir kanserojen olduğundan, yalnızca çift kat eldiven giyilirken ele alınmalı ve çalışma çeker ocakta yapılmalıdır.
Başlamak için, son larva aşamasında çok sayıda solucan seçilir, yıkanır ve toplanır. EMS daha sonra solucanlara eklenir ve solucanlar mutasyonları indüklemek için birkaç saat kuluçkaya yatırılır. Mutajenezi takiben, EMS solucanlardan uzaklaştırılmalı ve sodyum hidroksit ile inaktive edilmelidir. Solucanlar daha sonra büyüme ortamında birçok kez yıkanır ve agar plakalarına kaplanır.
Daha sonra, sağlıklı görünen solucanlar, besin kaynağı olarak bakterilerle taze tohumlanmış yeni plakalara aktarılır ve üremelerine izin verilir. İkinci nesil döller, lokomotif kusurları gibi mutant fenotipler için görsel olarak taranabilir.
Şimdi, nematodlarda ters genetik tarama için bir protokol üzerinden geçelim.
Solucanlarda ters taramalar yapmak için yaygın bir yaklaşım, hayvanlara, bakteri suşu başına bir tane olmak üzere çift sarmallı RNA'ları ifade eden bir bakteri kütüphanesini beslemektir, bu da solucanların her birinde bir aday genin ekspresyonunu azaltacaktır. Bu kitaplıklar genellikle ticari olarak temin edilebilir ve ekranlarda kullanılmak üzere alt kültüre alınabilir.
Başlamak için, bireysel kütüphane klonları içeren tek bakteri kolonileri kültürlenir ve çift sarmallı RNA üretimi indüklenir. Kültürler daha sonra nematod büyüme ortamı olan bir plakanın ayrı oyuklarına lekelenir ve steril bir davlumbazda kurumaya bırakılır.
Daha sonra, solucanlar bakterilerin üzerine kaplanır ve üç ila dört gün boyunca nemlendirilmiş bir odada beslenmelerine izin verilir. Mutant fenotipler, besleme plakalarına yerleştirilen orijinal solucanlarda veya birinci nesil döllerde hızlı bir şekilde gözlemlenebilir.
Artık ileri ve geri genetik taramaların nasıl yapıldığını gördüğünüze göre, mevcut uygulamalarından bazılarını tartışalım.
Bazı genetik ekranlar, bilim adamlarının aynı moleküler yolda fiziksel olarak etkileşime giren veya işlev gören proteinleri tanımlamalarına yardımcı olmak için kullanılır. Bu deneyde, bilim adamları, belirli bir sinyal molekülünü aktive eden yeni transmembran reseptörlerini keşfetmek için yüksek verimli mikroskopi tabanlı bir ekran tasarladılar. Floresan etiketli sinyal proteinini içeren insan embriyonik böbrek hücrelerinde çeşitli genleri aşırı eksprese ederek, hangi reseptörlerin proteinin hücre altı lokalizasyonunu etkilediğini izleyebildiler.
Genetik taramanın bir başka uygulaması, gen-ilaç etkileşimlerinin karakterizasyonudur. Burada, transpozon eklemeleri ile büyük ölçekli rastgele mutajenez kullanılarak bir mutant maya kütüphanesi oluşturuldu. Her mutant suş daha sonra bir ilacın varlığında büyütüldü. Her bir suşun büyümesi, mutasyona uğramamış kontrollere kıyasla hangi mutantların ilaç tedavisine duyarlı olduğunu belirlemek için PCR ve ardından mikrodiziler veya sıralama analizi kullanılarak ölçüldü.
Son olarak, ekranlar insan hastalıklarında bozulan genleri ve moleküler ağları anlamak için kullanılabilir. Bu deneydeki araştırmacılar, birçok farklı hedef genin ekspresyonunu yıkmak için RNA kodlayan virüslerin varlığında nöronları kültürlediler. İmmün lekeli hücrelerin otomatik analizi daha sonra nörit büyümesi gibi nöronların fiziksel özelliklerini etkileyen genleri ortaya çıkarmak için kullanıldı. Bu yaklaşım, nörodejeneratif hastalıklarda rol oynayan genleri başarıyla tanımlamıştır.
Az önce JoVE'nin videosunu genetik ekranlarda izlediniz - önemli biyolojik süreçlerde yer alan genleri ortaya çıkarmak için güçlü bir teknik. Bu videoda, bazı ana genetik tarama türlerini, hem ileri hem de geri taramaları gerçekleştirmek için genel protokolleri gözden geçirdik ve bu yöntemlerin bugün laboratuvarlarda nasıl uygulandığını tartıştık. İzlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between forward and reverse genetic screens?
Forward genetic screens randomly generate mutations in an organism's DNA using mutagens or transposons, then identify unknown genes responsible for phenotypes of interest. Reverse genetic screens take the opposite approach: researchers target specific candidate genes for disruption, then observe resulting mutant phenotypes. Both methods help uncover gene function and biological pathways.
Q2: How do loss-of-function and gain-of-function mutations differ in genetic screens?
Loss-of-function mutations disrupt a gene's activity, reducing its expression or function. Gain-of-function mutations increase a gene's expression or functionality, often by inserting regulatory elements that drive overexpression. Expression screening uses plasmid libraries containing protein-coding sequences to achieve gain-of-function effects and understand gene function.
Q3: What are suppressor and enhancer screens used for?
Suppressor screens identify mutations that reduce the severity of an existing mutant phenotype, revealing genes that interact or compensate for the original mutation. Enhancer screens find mutations that increase phenotype severity, helping determine redundant or functionally interacting genes. Synthetic lethality screens reveal genes in essential but redundant pathways, useful for identifying drug targets in cancer therapy.
Q4: How is chemical mutagenesis performed in nematode worms?
In forward screens using nematodes, worms at the last larval stage are exposed to ethyl methanesulfonate (EMS), a chemical mutagen that modifies guanine nucleotides, causing mispairing with thymine during DNA replication. After several hours of incubation, EMS is removed and inactivated with sodium hydroxide. Worms are then washed, plated on agar with bacterial food, and allowed to reproduce for screening.
Q5: What is the protocol for reverse genetic screening in nematodes?
Reverse screens in nematodes use bacterial libraries expressing double-stranded RNA targeting individual candidate genes. Bacteria are cultured, spotted onto plates with nematode growth medium, and allowed to dry. Worms feed on the bacteria for three to four days in a humidified chamber, and mutant phenotypes are observed in original worms or first-generation progeny.
Q6: How are genetic screens applied to identify protein interactions and drug targets?
Researchers use high-throughput microscopy-based screens to discover receptors affecting signaling protein localization by overexpressing genes in cultured cells. For drug interactions, mutant libraries are grown with drugs, and growth is quantified using detection and quantification of nucleic acids by real time PCR followed by microarray or sequencing analysis to identify drug-sensitive strains.
Q7: How can genetic screens help understand genes involved in neurodegenerative diseases?
Researchers culture neurons in the presence of RNA-encoding viruses to knock down expression of many target genes. Automated analysis of immunostained cells reveals genes influencing neuronal properties like neurite outgrowth. This approach has successfully identified genes involved in neurodegenerative diseases, demonstrating how screens uncover molecular networks disrupted in human disease.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
0:48
Genetic Screens
3:56
General Protocol for Forward Genetic Screen
5:22
General Protocol for Reverse Genetic Screen
6:30
Applications
8:21
Summary