Doku spesifik Hücre Kültürü ve Delivery Platform olarak Ekstrasellüler Matriks kaynaklı Köpükler ve mikro Fabrikasyon

Bu protokolün genel amacı, 3D in vitro hücre kültürü modellerindeki uygulamalar veya hücre iletim sistemlerinde pro-rejeneratif iskeleler olarak kullanılmak üzere, dokuya özgü hücre dışı matriksten türetilen kimyasal olarak çapraz bağlanmamış köpüklerin veya mikro taşıyıcıların boyutlandırılmasına yardımcı olmaktır. Bu yöntem, 3D hücresel mikro çevrenin hücre fonksiyonunu ve doku rejenerasyonunu nasıl yönettiği gibi, uygulamalı hücre biyolojisi ve doku mühendisliği alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, doğal dokuya özgü ECM kompozisyonunu taklit eden ve ek çapraz bağlama işlemi olmadan uzun süreli kültürlerde stabil kalan, ayarlanabilir geometrilere sahip iskelelerin üretimine olanak tanımasıdır.

Metin protokolüne göre doku kaynaklı ECM liyofilize edildikten sonra, deselülarize dokuyu ince ince kıymak için keskin cerrahi makaslar kullanın. İşlenmiş dokuyu kriyojenik değirmenden geçirmek için, bir laboratuvar bilyalı değirmen sistemine ait 25 mililitrelik paslanmaz çelik öğütme haznesini kıyılmış liyofilize ECM ile doldurun ve iki adet 10 mililitrelik paslanmaz çelik öğütme bilyası ekleyin. Doldurulmuş öğütme haznesini kapatın ve üç dakika boyunca sıvı azotun içine tamamen daldırın.

Ardından, dondurulmuş numuneyi 30 Hertz hızda üç dakika boyunca öğütün. ECM ince bir toz haline gelene kadar sıvı azota daldırma ve öğütme işlemini tekrarlayın. Kıyılmış veya kriyomilled ECM'den 250 miligram tartın ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Santrifüj tüpüne beş mililitre 22 molar NaH2PO4 tamponu ekleyin ve tüp üzerindeki sıvı seviyesini işaretleyin. Ardından, bir mililitre 22 molar NaH2PO4 tamponuna 7,5 miligram alfa amilaz ekleyerek bir alfa amilaz stok çözeltisi hazırlayın. Sonrasında, numuneye 100 mikrolitre alfa amilaz stok çözeltisi ekleyin.

Ardından, toplam hacmi 10 mililitreye tamamlamak için 22 molar NaH2PO4 ekleyin. Süspansiyonu 72 saat boyunca 300 RPM'de ve oda sıcaklığında sürekli olarak karıştırın. Süspansiyonu 1500 xg'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Sindirilmiş ECM peletini bozmadan süpernatantı dikkatlice toplayın ve atın. Ardından, peletlenmiş materyali yeniden süspanse etmek için çift distile su ile seyreltilmiş yüzde beş NaCl'den 10 mililitre kullanın ve 300 RPM'de 10 dakika boyunca sürekli olarak ajite edin. Peleti yeniden süspanse etmek için 10 mililitre çift distile su kullanmadan önce yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın.

Ardından süspansiyonu oda sıcaklığında, 300 RPM'de 10 dakika boyunca sürekli olarak karıştırın. Numuneyi tekrar santrifüjledikten sonra, sindirilmiş ECM peletini bozmadan süpernatantı dikkatlice toplayıp atın. Beş mililitre çizgisine kadar 2 molar asetik asit ekleyin.

Ardından vorteksleyin. Daha sonra süspansiyonu gece boyunca 120 RPM ve 37 °C'de sürekli karıştırın. Ertesi gün, 10 mm genişliğinde testere dişli bir proba sahip el tipi homogenizatör kullanarak, görünür fragman kalmayana kadar ECM süspansiyonunu oda sıcaklığında 10 saniyelik aralıklarla homogenize edin.

Aşırı ısınmayı önlemek için homojenizasyon aralıkları arasında süspansiyonu soğuk su dolu bir behere yerleştirin. ECM süspansiyonunu, süspansiyon ısınana kadar 37 °C'de 120 RPM'de sürekli ajitasyonla inkübe edin. Ardından, örnek süspansiyonunu istenen konsantrasyona seyreltmek için 2 M asetik asit kullanın.

Üç mililitrelik bir şırınga ve 18 gauge iğne kullanarak, istenen kalıbı ECM süspansiyonu ile doldurun. Kalıbın şekline bağlı olarak çeşitli geometrilerde köpükler üretilebilir. Kalıpların üzerini kapatın ve eksi 20 veya eksi 80 derece Celsius'ta dondurun.

Ardından kalıpları bir liyofilizatör şişesine yerleştirin. Şişeyi laboratuvar dondurarak kurutma sistemine bağlayın ve kalıpları 24 saat boyunca veya tamamen kuruyana kadar kurutun. Kriyomilled ECM süspansiyonunu, 100 RPM'de sürekli ajitasyonla gece boyunca inkube edin.

Üç mililitre ECM süspansiyonunu üç mililitrelik bir luer lock şırıngaya yükleyin ve şırınga ucuna kanatlı bir infüzyon seti takın. Şırıngayı şırınga pompasının içine sabitleyin. Ardından iğneyi bir laboratuvar ayağına sabitleyin ve iğne ucunu, düşük formlu bir Dewar balonunun üst kısmından dört ila altı santimetre uzaklıkta dikey olarak konumlandırın.

Ardından, timsah ağzı klipsli bir elektrodu iğnenin ucuna takın ve klipsin yüksek voltajlı güç kaynağının pozitif terminaline bağlı olduğundan emin olun. Bir alüminyum folyo şeridini vakum flaskının kenarına katlayarak yerleştirin. Daha sonra, ikinci bir timsah ağzı klipsli elektrodu folyonun dış kenarına takın.

Bunu güç kaynağının toprak hattı terminaline bağlayın. Dewar flaskını, folyonun dörtte üçü suya gömülecek şekilde, üstten yaklaşık bir santimetre boşluk kalana kadar sıvı nitrojenle doldurun. Ardından şırınga pompasını saatte 30 mililitre infüzyon hızına ayarlayın ve örnekleri metin protokolüne uygun olarak elektrospray yöntemiyle analiz edin.

İnfüzyon tamamlandığında, mikro taşıyıcıların donmuş halde kalmasını sağlamak için yaklaşık 25 mililitre sıvı azot içinde askıda kalacak şekilde, Dewar'daki fazla sıvı azotu dikkatlice dökün. Ardından, sıvı azotla birlikte mikro taşıyıcıları tek bir pürüzsüz hareketle dökerek derhal 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, Dewar'da kalan donmuş mikro taşıyıcıları toplamak için bir Scoopula kullanın.

Bunları da santrifüje ekleyin. Liyofilizasyona hazırlamak için, santrifüj tüpünün üzerini küçük deliklerle delinmiş alüminyum folyo ile kapatın. Kapalı santrifüj tüplerini bir liyofilizatör flaskına yerleştirin.

Ardından balonu hemen liyofilizatöre bağlayın ve örnekleri gece boyunca kurutun. Liyofilize köpüğü, fazla miktarda absolut etanol içeren 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne nazikçe aktarın. Benzer şekilde, liyofilize mikro taşıyıcıları, toplama işlemi için kullanılan orijinal santrifüj tüpü içerisinde fazla miktarda absolut etanol ile yeniden süspanse edin.

Agregatları gidermek ve istenen boyut aralıklarını seçmek için, mikro taşıyıcıları bir serolojik pipet kullanarak belirli bir gözenek boyutuna sahip paslanmaz çelik bir süzgeçten geçirerek yeni bir 50 ml santrifüj tüpüne filtreleyin. Numuneyi 4 °C'de dört saat boyunca veya köpük ya da mikro taşıyıcılar santrifüj tüpünün dibine çökene kadar inkübe edin. Ardından, aseptik teknikle bir laminar akış kabini altında, iskelelerdeki mutlak etanolü uzaklaştırmak için serolojik bir pipet kullanın ve steril PBS ile seyreltilmiş fazla %95 etanol ekleyin.

İskeleleri dört derece Celsius'ta dört saat boyunca veya iskeleler rehidrasyon kabının tabanına çökene kadar inkübe edin. İskeleleri bir etanol serisi aracılığıyla kademeli olarak rehidre edin. Her adımda, çözeltiyi değiştirmeden önce iskeleleri, kabın tabanına çökene kadar dört derece Celsius'ta inkübe edin.

Kalıntı etanolü uzaklaştırmak için steril PBS'yi iki ek durulama ile değiştirin. Örnekleri, hücre kültürü aşamasına kadar dört santigrat derecede %100 steril PBS içinde saklayın. İskeleleri, rehidrasyondan sonra bir ila iki hafta içinde kullanın.

Burada, deselülerize edilmiş adipoz doku kullanılarak üretilen ECM türevli köpüklerin ve mikro taşıyıcıların türlerine ilişkin örnekler gösterilmektedir. Porcine deselülerize dermal doku ve porcine deselülerize sol ventrikül. Bu durum, tekniklerin ECM kaynakları olarak çeşitli deselülerize dokular kullanılarak dokuya özgü biyoiskeletler üretmek için uygulanabileceğini kanıtlamaktadır.

Kriyomilling veya kıyma işlemi, enzimatik sindirim ve homojenizasyonun ardından, örnekler dondurulmadan ve liyofilizasyon işlemine tabi tutulmadan önce bir kaba yerleştirilebilir. Bu şekil, 48 kuyucuklu doku kültürü plakası kalıbında sentezlenmiş, rehidre edilmiş DAT, DDT ve DLV öğütülmüş köpükleri göstermektedir. Bu DAT, DDT ve DLV köpükleri, 35 mg/mL konsantrasyonda kriyomill edilmiş ECM ve -80 °C dondurma sıcaklığında üretilmiştir.

Elektrospray tekniği kullanılarak ECM türevli mikro taşıyıcılar üretmek için, her bir ECM kaynak süspansiyon konsantrasyonu için iğne çapı, infüzyon hızı ve voltaj, kontrollü rehidratasyon sonrası çapları 350 ile 500 mikrometre arasında değişen ayrı küresel mikro taşıyıcılar oluşturacak şekilde ayarlanabilir. Son olarak, burada SEM ile gösterilen DAT, DDT ve DLV mikro taşıyıcıları, boyut açısından ultrastrüktürün deselülarize ECM kaynağına bağlı olarak değişebileceğini ortaya koymaktadır. Bu videoda sunulan yöntemler, matris kaynağı olarak deselülarize doku kullanarak, saf ve kimyasal olarak çapraz bağlanmamış ECM'den oluşan çok çeşitli dokuya özgü mikro taşıyıcılar ve köpükler üretmek için kullanılabilir.

Bu prosedürlerin ardından, köpükler ve mikro taşıyıcılar statik veya dinamik koşullar altında hücrelerle ekilebilir ve invitro hücre kültürü ile invivo uygulamaları için hücre yönlendirici bir substrat olarak kullanılabilir.