Doku spesifik Hücre Kültürü ve Delivery Platform olarak Ekstrasellüler Matriks kaynaklı Köpükler ve mikro Fabrikasyon

Bu protokolün genel amacı, 3D invitro hücre kültürü modellerinde veya hücre dağıtım sistemlerinde pro-rejeneratif iskeleler olarak uygulamalar için dokuya özgü ekstra hücresel matristen türetilen kimyasal olarak çapraz bağlı köpüklerin veya mikro taşıyıcıların boyutuna yardımcı olmaktır. Bu yöntem, 3D hücresel mikro ortamın hücre fonksiyonuna ve doku yenilenmesine nasıl aracılık ettiği gibi uygulamalı hücre biyolojisi ve doku mühendisliği alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, doğal dokuya özgü ECM bileşimini taklit eden ve ek çapraz bağlama olmadan uzun süreli kültürde stabil olan ayarlanabilir geometrilere sahip iskelelerin imalatına olanak sağlamasıdır.

Dokudan türetilen ECM'yi metin protokolüne göre liyofilize ettikten sonra, hücreden arındırılmış dokuyu ince bir şekilde kıymak için keskin cerrahi makas kullanın. İşlenmiş dokuyu kriyodeğirmen yapmak için, kıyılmış liyofilize ECM ile bir laboratuvar bilyalı değirmen sistemi için 25 mililitrelik paslanmaz çelik freze haznesini doldurun ve iki adet 10 mililitre paslanmaz çelik freze bilyesi ekleyin. Yüklü freze haznesini kapatın ve üç dakika boyunca sıvı nitrojene tamamen daldırın.

Daha sonra donmuş numuneyi 30 Hertz'de üç dakika öğütün. Sıvı nitrojene batırma işlemini ve ECM ince bir toz haline gelene kadar frezelemeyi tekrarlayın. 250 miligram kıyılmış veya kriyofrezelenmiş ECM'yi tartın ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Santrifüj tüpüne beş mililitre 22 molar NaH2PO4 tamponu ekleyin ve tüp üzerindeki sıvı seviyesini işaretleyin. Daha sonra, bir mililitre 22 molar NaH2PO4 tamponuna 7.5 miligram alfa amilaz ekleyerek bir alfa amilaz stok çözeltisi hazırlayın. Ardından, numuneye 100 mikrolitre alfa amilaz stok çözeltisi ekleyin.

Daha sonra 22 mililitrelik bir son hacim elde etmek için 22 molar NaH4PO10 ekleyin. Süspansiyonu 300 RPM'de ve oda sıcaklığında 72 saat boyunca sürekli olarak çalkalayın. Süspansiyonu 10 dakika boyunca 1500 kez G'de santrifüjleyin.

Sindirilmiş ECM peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice toplayın ve atın. Daha sonra, peletlenmiş malzemeyi yeniden süspanse etmek için çift damıtılmış suda seyreltilmiş 10 mililitre yüzde beş NaCl kullanın ve 300 RPM'de 10 dakika boyunca sürekli çalkalayın. Peleti yeniden süspanse etmek için 10 mililitre çift damıtılmış su kullanmadan önce yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.

Ardından süspansiyonu oda sıcaklığında 300 RPM'de 10 dakika boyunca sürekli olarak çalkalayın. Numuneyi tekrar santrifüjledikten sonra, sindirilmiş ECM peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice toplayın ve atın. Beş mililitre işaretine 2 molar asetik asit ekleyin.

Ve girdap. Ardından süspansiyonu gece boyunca 120 RPM ve 37 santigrat derecede sürekli olarak çalkalayın. Ertesi gün, 10 milimetre genişliğinde testere dişi probu ile donatılmış bir el tipi homojenizatör kullanarak, ECM süspansiyonunu oda sıcaklığında 10 saniyelik aralıklarla görünür parça kalmayana kadar homojenize edin.

Aşırı ısınmayı önlemek için süspansiyonu homojenizasyon aralıkları arasında soğuk su dolu bir kabın içine yerleştirin. ECM süspansiyonunu, süspansiyon ısınana kadar 120 RPM'de sürekli çalkalama ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, numune süspansiyonunu istenen konsantrasyona seyreltmek için 2 molar asetik asit kullanılır.

Üç mililitrelik bir şırınga ve 18 gauge bir iğne ile istenen kalıbı ECM süspansiyonu ile doldurun. Köpükler, kalıbın şekline bağlı olarak çeşitli geometrilerde üretilebilir. Kalıpları örtün ve eksi 20 veya eksi 80 santigrat derecede dondurun.

Ardından kalıpları bir liyofilizatör şişesine yerleştirin. Şişeyi laboratuvar dondurarak kurutma sistemine bağlayın ve kalıpları 24 saat veya tamamen kuruyana kadar kurutun. Kriyofrezelenmiş ECM süspansiyonunu gece boyunca 100 RPM'de sürekli çalkalama ile inkübe edin.

Üç mililitre luer kilitli şırıngaya üç mililitre ECM süspansiyonu yükleyin ve şırınganın deliğine kanatlı bir infüzyon seti takın. Şırıngayı şırınga pompasının içine sabitleyin. Ardından iğneyi bir imbik standına sabitleyin ve iğne ucunu, düşük şekillendirilmiş bir Dewar şişesinin tepesinden dört ila altı santimetre mesafede dikey olarak konumlandırın.

Ardından, iğnenin ucuna bir timsah klipsi elektrodu takın ve timsah klipsinin yüksek voltajlı güç kaynağının pozitif terminaline bağlı olduğundan emin olun. Termosun kenarına bir alüminyum folyo şeridi katlayın. Ardından folyonun dış kenarına ikinci bir timsah klipsi elektrodu takın.

Güç kaynağının toprak kaynağı terminaline bağlayın. Dewar şişesini, folyonun dörtte üçü suya batırılacak şekilde üstten yaklaşık bir santimetre uzakta sıvı nitrojen ile doldurun. Ardından şırınga pompasını saatte 30 mililitre infüzyon hızına ayarlayın ve numuneleri metin protokolüne göre elektro püskürtün.

İnfüzyon tamamlandıktan sonra, Dewar'daki fazla sıvı nitrojeni dikkatlice boşaltın ve mikro taşıyıcıyı donmuş kalmalarını sağlamak için yaklaşık 25 mililitre sıvı nitrojen içinde asılı bırakın. Sıvı nitrojen içeren mikro taşıyıcıları hemen 50 mililitrelik bir santrifüj tüpe tek bir yumuşak hareketle dökerek aktarın. Ardından, Dewar'da kalan donmuş mikro taşıyıcıları toplamak için bir Scoopula kullanın.

Onları da santrifüje ekleyin. Liyofilizasyona hazırlanmak için santrifüj tüpünü küçük deliklerle delikli alüminyum folyo ile örtün. Kapalı santrifüj tüplerini bir liyofilizatör şişesine yerleştirin.

Ardından şişeyi hemen liyofilizatöre bağlayın ve numuneleri gece boyunca kurutun. Liyofilize köpüğü, fazla mutlak etanol içeren 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yavaşça aktarın. Benzer şekilde, toplama için kullanılan orijinal santrifüj tüpü içinde liyofilize mikro taşıyıcıları fazla mutlak etanol içinde yeniden askıya alın.

Serolojik bir pipet kullanarak, mikro taşıyıcıları, herhangi bir agregayı çıkarmak ve istenen boyut aralıklarını seçmek için tanımlanmış bir ağ boyutuna sahip paslanmaz bir elekten yeni bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne süzün. Numuneyi dört santigrat derecede dört saat boyunca veya köpük veya mikro taşıyıcılar santrifüj tüpünün dibine çökene kadar inkübe edin. Daha sonra, aseptik teknikli bir laminer akış başlığı altında, mutlak etanolü iskelelerden çıkarmak için bir Serolojik pipet kullanın ve steril PBS ile seyreltilmiş fazla% 95 etanol ekleyin.

İskeleleri dört santigrat derecede dört saat boyunca veya iskeleler rehidrasyon kabının dibine batana kadar kuluçkaya yatırın. İskeleleri bir etanol serisi boyunca kademeli olarak yeniden sulandırın. Her adımda, çözeltiyi değiştirmeden önce iskeleleri kabın dibine batana kadar dört santigrat derecede inkübe edin.

Kalan etanolü çıkarmak için steril PBS'yi ek iki durulama ile değiştirin. Numuneleri hücre kültürü için hazır olana kadar dört santigrat derecede %100 steril PBS'de saklayın. İskeleleri rehidrasyonu takip eden bir ila iki hafta içinde kullanın.

Burada, hücreden arındırılmış yağ dokusu kullanılarak üretilen ECM türevi köpük ve mikro taşıyıcı tiplerinin örnekleri gösterilmektedir. Domuz hücresinden arındırılmış dermal doku ve domuz hücresinden arındırılmış sol ventrikül. ECM kaynakları olarak çeşitli hücrelerden arındırılmış dokular kullanılarak dokuya özgü biyo-iskeleler oluşturmak için tekniklerin gösterilebilir.

Kriyofrezeleme veya kıyma, enzimatik sindirim ve homojenizasyonun ardından, numuneler dondurma ve liyofilizasyondan önce bir kaseye dağıtılabilir. Bu şekil, 48 oyuklu bir doku kültürü plakası kalıbında sentezlenen rehidre edilmiş DAT, DDT ve DLV öğütülmüş köpükleri temsil eder. Bu DAT, DDT ve DLV köpükleri, mililitre başına 35 miligram konsantrasyonda ve eksi 80 santigrat derece donma sıcaklığında kriyofrezelenmiş ECM ile üretildi.

Bir elektro püskürtme tekniği kullanarak ECM'den türetilmiş mikro taşıyıcıları imal etmek için, her ECM kaynağı süspansiyon konsantrasyonu için, iğne göstergesi infüzyon hızı ve voltaj, kontrollü rehidrasyonu takiben çapı 350 ila 500 mikrometre arasında değişen ayrı küresel mikro taşıyıcılar üretecek şekilde ayarlanabilir. Son olarak, burada SEM tarafından gösterilen DAT, DDT ve DLV mikro taşıyıcıları, boyuttaki ultra yapının hücresellikten arındırılmış ECM kaynağına bağlı olarak değişebileceğini ortaya koymaktadır. Bu videoda sunulan yöntemler, bir matris kaynağı olarak hücreden arındırılmış doku kullanılarak saf, kimyasal olarak çapraz bağlı ECM'den oluşan çok çeşitli dokuya özgü mikro taşıyıcılar ve köpükler üretmek için kullanılabilir.

Bu prosedürleri takiben, köpükler ve mikro taşıyıcılar statik veya dinamik koşullar altında hücrelerle tohumlanabilir ve invitro hücre kültürü ve invivo uygulamalar için hücre öğretici bir substrat olarak uygulanabilir.