SNP Genotipleme
Genetik çeşitlilik hem farklı popülasyonlar içinde hem de arasında meydana gelir ve bireyler arasında hastalığa yatkınlık da dahil olmak üzere özelliklerdeki çeşitliliğe katkıda bulunur. En yaygın varyasyonlar, tek nükleotid polimorfizmleri veya SNP'lerdir. SNP genotiplemesi, bir bireyde bulunan spesifik varyant setlerinin, bu durumda SNP'lerin belirlenmesini içerir.
Bu video, SNP genotiplemesinin arkasındaki bazı ilkeleri tartışacak, birkaç yaygın SNP tanımlama yöntemine giriş yapacak ve son olarak bu tekniklerin bazı uygulamalarını sunacaktır.
İlk olarak, bir SNP'nin ne olduğunu ve genotiplemede nasıl kullanılabileceğini tartışalım.
"Polimorfizmler", bir popülasyon içinde kayda değer bir sıklıkta bulunan aleller veya bir genetik lokusun farklı versiyonlarıdır ve baz ikamelerinin yanı sıra eklemeleri veya silmeleri içerir. Tek nükleotid polimorfizmleri, tek bir DNA bazındaki varyasyonlardır. SNP'ler tüm genom boyunca ortaya çıkabilir ve çoğu protein yapısını veya gen ekspresyonunu değiştirmez. Bununla birlikte, hastalığa neden olan bir genetik varyanta fiziksel yakınlıkları veya "bağlantıları" nedeniyle hala hastalıklarla ilişkili olabilirler. Öte yandan, kistik fibroz, orak hücreli anemi ve β-talasemi gibi hastalıklara doğrudan neden olduğu bilinen birkaç belirgin SNP vardır.
SNP genotiplemesi için pratik bir uygulama, hastalıklarla ilişkili SNP'lerin tanımlanmasının veya bir ilaca veya tedaviye farklı yanıtların doktorların hastaları daha iyi teşhis etmesine ve tedavi etmesine yardımcı olabileceği kişiselleştirilmiş tıptır.
SNP'ler, özellikler veya hastalıklarla ilişkili olanları belirlemek için tüm genom boyunca yüz binlerce SNP'yi inceleyen genom çapında ilişkilendirme çalışmaları için de yararlıdır. GWAS, "haplotipler" olarak bilinen SNP gruplarından yararlanır. Bir haplotip içindeki SNP'ler "bağlantı dengesizliği" içindedir, bu da varyantların belirli kombinasyonunun, genellikle bir kromozom üzerindeki fiziksel yakınlıklarının bir sonucu olarak, şans eseri beklenenden daha fazla meydana gelme olasılığının daha yüksek olduğu anlamına gelir. Bu, haplotiplerin yalnızca az sayıda bireysel SNP'nin genotiplendirilmesiyle ayırt edilebileceği ve genetik ilişkilendirme çalışmalarını daha az maliyet veya emek yoğun hale getireceği anlamına gelir.
SNP'lerin ne olduğuna ve nasıl kullanılabileceğine baktıktan sonra, SNP'leri genotiplemek için geliştirilmiş sayısız metodolojiden birkaçını inceleyelim. Bunlar arasında doğrudan hibridizasyon, PCR tabanlı yöntemler, parça analizi ve dizileme yer alır.
SNP dizileri gibi doğrudan hibridizasyon teknikleri, tek tek SNP'leri doğrudan tanımlamak için kısa oligonükleotid probları kullanır. Yüz binlerce SNP tek bir biyoçip üzerinde test edilebilir. Problar, tipik olarak bir cam slayt olan çip matrisine kimyasal olarak sabitlenir. Bir numunedeki SNP'leri tespit etmek için, izole edilmiş genomik DNA, PCR ile amplifiye edilir ve prob bağlama verimliliğini artırmak için parçalanır. DNA daha sonra tipik olarak bir floresan işaretleyici ile etiketlenir ve ardından çipe hibridizasyon yapılır. Numune DNA'sının problara bağlanmasına izin verildikten sonra, bağlanmamış veya spesifik olarak bağlanmamış tüm DNA yıkanır. Her bir prob noktasındaki sinyalin ölçülmesiyle, numunedeki hedef alelin varlığı belirlenebilir.
Başka bir SNP tipleme yöntemi, primerlerin SNP içeren dizilere karşı tasarlandığı, böylece yalnızca mükemmel tamamlayıcı alele hibritleşecek şekilde tasarlandığı alele özgü PCR'dir. PCR ürünleri, floresan etiketler gibi yöntemlerle tespit edilebilir. Alternatif olarak, SNP'nin ilgilenilen bölgesini çevreleyen PCR primerleri, TaqMan PCR testinde olduğu gibi, SNP'ye özgü bir prob ile birlikte tasarlanabilir. Burada, prob bir floresan işaretleyicinin yanı sıra yakındaki işaretleyiciden gelen floresansı bastıran bir söndürücü molekül içerir. PCR sırasında, yalnızca spesifik olarak bağlı prob dizisi, polimerazın 5' eksonükleaz aktivitesi ile bozulacak, floresan etiketini söndürücüden ayıracak ve belirli varyantın varlığını gösteren bir floresan sinyali ile sonuçlanacaktır.
Parça analizi adı verilen üçüncü bir yöntem kategorisi, belirli bir SNP'nin varlığına veya yokluğuna bağlı olarak çeşitli boyutlarda veya etiketlerde DNA parçalarının oluşturulmasını içerir. Restriksiyon fragmanı uzunluk polimorfizmi analizi, bir alelin parçalandığı ve diğerinin ayrılmadığı hedef dizileri için restriksiyon endonükleazlarının katı özgüllüğünden yararlanır. Ligasyon testi, biri hedef SNP baz çiftinde sonlanan, doğrudan yan yana yerleştirilmiş iki prob kullanır. SNP içeren prob mükemmel bir şekilde bağlanırsa, ligasyon meydana gelebilir. Primer uzatma testi, hedef SNP'den kısa bir nükleotidi bağlayan primerleri içerir. Bu astar daha sonra mevcut bireysel alele bağlı olarak değişken şekilde uzatılır. Bu yöntemlerle üretilen fragmanlar daha sonra jel veya kılcal elektroforez veya kütle spektrometresi kullanılarak ayırt edilebilir.
Son olarak, dizileme, SNP'leri çok spesifik olarak algılayabilir ve bilinmeyen dizilere sahip yeni SNP'leri tanımlayabilir. Bununla birlikte, gerçek SNP'leri sıralama okuma hatalarından ayırt etmek için ekstra özen ve ek deneysel kopyalar yapılmalıdır. Dizileme teknolojileri daha ucuz ve daha erişilebilir hale geldikçe, araştırmacılar genotipleme için dizilemeyi giderek daha fazla kullanıyorlar.
SNP'lerin nasıl genotiplenebileceğini gördükten sonra, bu teknikler için bazı özel uygulamalara bakalım.
Genotipleme, neredeyse aynı görünüme sahip bir türün çeşitlerini ayırt etmek için kullanılabilir. Bu, önce genomik DNA'nın izole edilmesi, ardından dizileri bilinen SNP'ler veya diğer genetik varyantlarla bağlamak için tasarlanmış primerler kullanılarak PCR ile gerçekleştirilir. Bu primerler, yalnızca spesifik polimorfizmi içeren çeşidin DNA'sını çoğaltacaktır ve bu nedenle bu benzerleri ayırt etmek için kullanılabilir.
Araştırmacılar ayrıca, spesifik ilaca dirençli mutasyonları barındıran patojenik bakterileri tanımlamak için genotipleme kullanırlar. Düşük kaynak ayarları için kolaylaştırılmış bir SNP dizi protokolü, genomik DNA ve PCR ana karışımının doğrudan bir çipe eklenmesiyle oluşturulur. Numune amplifikasyonu ve hibridizasyon tek adımda gerçekleşir. Diziler daha sonra yıkanır, görüntülenir ve sonuçlar, tüberküloz bakterilerinin varlığını veya yokluğunu ve ayrıca ilaca dirençli mutasyonları belirlemek için analiz edilir.
Son olarak, SNP'ler, ilişkilendirme çalışmaları ile hastalık riskini artırdığı bulunan genetik varyantların işlevini değerlendirmek için kullanılabilir. Burada, bilim adamları, ilgilenilen bir genin kopyalanmış kısmında bulunan nötr bir "işaretleyici" SNP için heterozigot olan bir hücre hattı ve ayrıca hastalıkla ilişkili kopyalanmamış bir test SNP'si ile deneyler yaptılar. Belirteç SNP için heterozigot olan, ancak test SNP'nin hastalıkla ilişkili olmayan varyantı için homozigot olan bir negatif kontrol hücresi hattı seçilir. Alele özgü primer uzatması, genomik DNA ve ayrıca eksprese edilen mRNA'dan kopyalanan cDNA tersi üzerinde gerçekleştirildi. Astar uzatma ürünleri daha sonra MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak niceliklendirildi. Araştırmacılar, iki işaretleyici SNP aleli ile ilişkili fragmanların nispi bolluğunu karşılaştırarak, hastalıkla ilişkili SNP'nin gen ekspresyonunun azalmasına neden olup olmadığını belirleyebilirler.
JoVE'nin SNP genotiplemesi hakkındaki videosunu az önce izlediniz. Bu video, SNP'lerin kavramını ve kullanımlarını, SNP'leri tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılan birkaç temel yöntemi tanıttı ve SNP genotiplemesinin üç uygulamasını vurguladı. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Tek nükleotid polimorfizmleri veya SNP'ler, insanlarda en yaygın genetik varyasyon şeklidir. DNA'daki bireysel bazlardaki bu farklılıklar genellikle g…
Genetik çeşitlilik hem farklı popülasyonlar içinde hem de arasında meydana gelir ve bireyler arasında hastalığa yatkınlık da dahil olmak üzere özelliklerdeki çeşitliliğe katkıda bulunur. En yaygın varyasyonlar, tek nükleotid polimorfizmleri veya SNP'lerdir. SNP genotiplemesi, bir bireyde bulunan spesifik varyant setlerinin, bu durumda SNP'lerin belirlenmesini içerir.
Bu video, SNP genotiplemesinin arkasındaki bazı ilkeleri tartışacak, birkaç yaygın SNP tanımlama yöntemine giriş yapacak ve son olarak bu tekniklerin bazı uygulamalarını sunacaktır.
İlk olarak, bir SNP'nin ne olduğunu ve genotiplemede nasıl kullanılabileceğini tartışalım.
"Polimorfizmler", bir popülasyon içinde kayda değer bir sıklıkta bulunan aleller veya bir genetik lokusun farklı versiyonlarıdır ve baz ikamelerinin yanı sıra eklemeleri veya silmeleri içerir. Tek nükleotid polimorfizmleri, tek bir DNA bazındaki varyasyonlardır. SNP'ler tüm genom boyunca ortaya çıkabilir ve çoğu protein yapısını veya gen ekspresyonunu değiştirmez. Bununla birlikte, hastalığa neden olan bir genetik varyanta fiziksel yakınlıkları veya "bağlantıları" nedeniyle hala hastalıklarla ilişkili olabilirler. Öte yandan, kistik fibroz, orak hücreli anemi ve β-talasemi gibi hastalıklara doğrudan neden olduğu bilinen birkaç belirgin SNP vardır.
SNP genotiplemesi için pratik bir uygulama, hastalıklarla ilişkili SNP'lerin tanımlanmasının veya bir ilaca veya tedaviye farklı yanıtların doktorların hastaları daha iyi teşhis etmesine ve tedavi etmesine yardımcı olabileceği kişiselleştirilmiş tıptır.
SNP'ler, özellikler veya hastalıklarla ilişkili olanları belirlemek için tüm genom boyunca yüz binlerce SNP'yi inceleyen genom çapında ilişkilendirme çalışmaları için de yararlıdır. GWAS, "haplotipler" olarak bilinen SNP gruplarından yararlanır. Bir haplotip içindeki SNP'ler "bağlantı dengesizliği" içindedir, bu da varyantların belirli kombinasyonunun, genellikle bir kromozom üzerindeki fiziksel yakınlıklarının bir sonucu olarak, şans eseri beklenenden daha fazla meydana gelme olasılığının daha yüksek olduğu anlamına gelir. Bu, haplotiplerin yalnızca az sayıda bireysel SNP'nin genotiplendirilmesiyle ayırt edilebileceği ve genetik ilişkilendirme çalışmalarını daha az maliyet veya emek yoğun hale getireceği anlamına gelir.
SNP'lerin ne olduğuna ve nasıl kullanılabileceğine baktıktan sonra, SNP'leri genotiplemek için geliştirilmiş sayısız metodolojiden birkaçını inceleyelim. Bunlar arasında doğrudan hibridizasyon, PCR tabanlı yöntemler, parça analizi ve dizileme yer alır.
SNP dizileri gibi doğrudan hibridizasyon teknikleri, tek tek SNP'leri doğrudan tanımlamak için kısa oligonükleotid probları kullanır. Yüz binlerce SNP tek bir biyoçip üzerinde test edilebilir. Problar, tipik olarak bir cam slayt olan çip matrisine kimyasal olarak sabitlenir. Bir numunedeki SNP'leri tespit etmek için, izole edilmiş genomik DNA, PCR ile amplifiye edilir ve prob bağlama verimliliğini artırmak için parçalanır. DNA daha sonra tipik olarak bir floresan işaretleyici ile etiketlenir ve ardından çipe hibridizasyon yapılır. Numune DNA'sının problara bağlanmasına izin verildikten sonra, bağlanmamış veya spesifik olarak bağlanmamış tüm DNA yıkanır. Her bir prob noktasındaki sinyalin ölçülmesiyle, numunedeki hedef alelin varlığı belirlenebilir.
Başka bir SNP tipleme yöntemi, primerlerin SNP içeren dizilere karşı tasarlandığı, böylece yalnızca mükemmel tamamlayıcı alele hibritleşecek şekilde tasarlandığı alele özgü PCR'dir. PCR ürünleri, floresan etiketler gibi yöntemlerle tespit edilebilir. Alternatif olarak, SNP'nin ilgilenilen bölgesini çevreleyen PCR primerleri, TaqMan PCR testinde olduğu gibi, SNP'ye özgü bir prob ile birlikte tasarlanabilir. Burada, prob bir floresan işaretleyicinin yanı sıra yakındaki işaretleyiciden gelen floresansı bastıran bir söndürücü molekül içerir. PCR sırasında, yalnızca spesifik olarak bağlı prob dizisi, polimerazın 5' eksonükleaz aktivitesi ile bozulacak, floresan etiketini söndürücüden ayıracak ve belirli varyantın varlığını gösteren bir floresan sinyali ile sonuçlanacaktır.
Parça analizi adı verilen üçüncü bir yöntem kategorisi, belirli bir SNP'nin varlığına veya yokluğuna bağlı olarak çeşitli boyutlarda veya etiketlerde DNA parçalarının oluşturulmasını içerir. Restriksiyon fragmanı uzunluk polimorfizmi analizi, bir alelin parçalandığı ve diğerinin ayrılmadığı hedef dizileri için restriksiyon endonükleazlarının katı özgüllüğünden yararlanır. Ligasyon testi, biri hedef SNP baz çiftinde sonlanan, doğrudan yan yana yerleştirilmiş iki prob kullanır. SNP içeren prob mükemmel bir şekilde bağlanırsa, ligasyon meydana gelebilir. Primer uzatma testi, hedef SNP'den kısa bir nükleotidi bağlayan primerleri içerir. Bu astar daha sonra mevcut bireysel alele bağlı olarak değişken şekilde uzatılır. Bu yöntemlerle üretilen fragmanlar daha sonra jel veya kılcal elektroforez veya kütle spektrometresi kullanılarak ayırt edilebilir.
Son olarak, dizileme, SNP'leri çok spesifik olarak algılayabilir ve bilinmeyen dizilere sahip yeni SNP'leri tanımlayabilir. Bununla birlikte, gerçek SNP'leri sıralama okuma hatalarından ayırt etmek için ekstra özen ve ek deneysel kopyalar yapılmalıdır. Dizileme teknolojileri daha ucuz ve daha erişilebilir hale geldikçe, araştırmacılar genotipleme için dizilemeyi giderek daha fazla kullanıyorlar.
SNP'lerin nasıl genotiplenebileceğini gördükten sonra, bu teknikler için bazı özel uygulamalara bakalım.
Genotipleme, neredeyse aynı görünüme sahip bir türün çeşitlerini ayırt etmek için kullanılabilir. Bu, önce genomik DNA'nın izole edilmesi, ardından dizileri bilinen SNP'ler veya diğer genetik varyantlarla bağlamak için tasarlanmış primerler kullanılarak PCR ile gerçekleştirilir. Bu primerler, yalnızca spesifik polimorfizmi içeren çeşidin DNA'sını çoğaltacaktır ve bu nedenle bu benzerleri ayırt etmek için kullanılabilir.
Araştırmacılar ayrıca, spesifik ilaca dirençli mutasyonları barındıran patojenik bakterileri tanımlamak için genotipleme kullanırlar. Düşük kaynak ayarları için kolaylaştırılmış bir SNP dizi protokolü, genomik DNA ve PCR ana karışımının doğrudan bir çipe eklenmesiyle oluşturulur. Numune amplifikasyonu ve hibridizasyon tek adımda gerçekleşir. Diziler daha sonra yıkanır, görüntülenir ve sonuçlar, tüberküloz bakterilerinin varlığını veya yokluğunu ve ayrıca ilaca dirençli mutasyonları belirlemek için analiz edilir.
Son olarak, SNP'ler, ilişkilendirme çalışmaları ile hastalık riskini artırdığı bulunan genetik varyantların işlevini değerlendirmek için kullanılabilir. Burada, bilim adamları, ilgilenilen bir genin kopyalanmış kısmında bulunan nötr bir "işaretleyici" SNP için heterozigot olan bir hücre hattı ve ayrıca hastalıkla ilişkili kopyalanmamış bir test SNP'si ile deneyler yaptılar. Belirteç SNP için heterozigot olan, ancak test SNP'nin hastalıkla ilişkili olmayan varyantı için homozigot olan bir negatif kontrol hücresi hattı seçilir. Alele özgü primer uzatması, genomik DNA ve ayrıca eksprese edilen mRNA'dan kopyalanan cDNA tersi üzerinde gerçekleştirildi. Astar uzatma ürünleri daha sonra MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak niceliklendirildi. Araştırmacılar, iki işaretleyici SNP aleli ile ilişkili fragmanların nispi bolluğunu karşılaştırarak, hastalıkla ilişkili SNP'nin gen ekspresyonunun azalmasına neden olup olmadığını belirleyebilirler.
JoVE'nin SNP genotiplemesi hakkındaki videosunu az önce izlediniz. Bu video, SNP'lerin kavramını ve kullanımlarını, SNP'leri tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılan birkaç temel yöntemi tanıttı ve SNP genotiplemesinin üç uygulamasını vurguladı. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Genetik çeşitlilik hem farklı popülasyonlar içinde hem de arasında meydana gelir ve bireyler arasında hastalığa yatkınlık da dahil olmak üzere özelliklerdeki çeşitliliğe katkıda bulunur. En yaygın varyasyonlar, tek nükleotid polimorfizmleri veya SNP'lerdir. SNP genotiplemesi, bir bireyde bulunan spesifik varyant setlerinin, bu durumda SNP'lerin belirlenmesini içerir.
Bu video, SNP genotiplemesinin arkasındaki bazı ilkeleri tartışacak, birkaç yaygın SNP tanımlama yöntemine giriş yapacak ve son olarak bu tekniklerin bazı uygulamalarını sunacaktır.
İlk olarak, bir SNP'nin ne olduğunu ve genotiplemede nasıl kullanılabileceğini tartışalım.
"Polimorfizmler", bir popülasyon içinde kayda değer bir sıklıkta bulunan aleller veya bir genetik lokusun farklı versiyonlarıdır ve baz ikamelerinin yanı sıra eklemeleri veya silmeleri içerir. Tek nükleotid polimorfizmleri, tek bir DNA bazındaki varyasyonlardır. SNP'ler tüm genom boyunca ortaya çıkabilir ve çoğu protein yapısını veya gen ekspresyonunu değiştirmez. Bununla birlikte, hastalığa neden olan bir genetik varyanta fiziksel yakınlıkları veya "bağlantıları" nedeniyle hala hastalıklarla ilişkili olabilirler. Öte yandan, kistik fibroz, orak hücreli anemi ve β-talasemi gibi hastalıklara doğrudan neden olduğu bilinen birkaç belirgin SNP vardır.
SNP genotiplemesi için pratik bir uygulama, hastalıklarla ilişkili SNP'lerin tanımlanmasının veya bir ilaca veya tedaviye farklı yanıtların doktorların hastaları daha iyi teşhis etmesine ve tedavi etmesine yardımcı olabileceği kişiselleştirilmiş tıptır.
SNP'ler, özellikler veya hastalıklarla ilişkili olanları belirlemek için tüm genom boyunca yüz binlerce SNP'yi inceleyen genom çapında ilişkilendirme çalışmaları için de yararlıdır. GWAS, "haplotipler" olarak bilinen SNP gruplarından yararlanır. Bir haplotip içindeki SNP'ler "bağlantı dengesizliği" içindedir, bu da varyantların belirli kombinasyonunun, genellikle bir kromozom üzerindeki fiziksel yakınlıklarının bir sonucu olarak, şans eseri beklenenden daha fazla meydana gelme olasılığının daha yüksek olduğu anlamına gelir. Bu, haplotiplerin yalnızca az sayıda bireysel SNP'nin genotiplendirilmesiyle ayırt edilebileceği ve genetik ilişkilendirme çalışmalarını daha az maliyet veya emek yoğun hale getireceği anlamına gelir.
SNP'lerin ne olduğuna ve nasıl kullanılabileceğine baktıktan sonra, SNP'leri genotiplemek için geliştirilmiş sayısız metodolojiden birkaçını inceleyelim. Bunlar arasında doğrudan hibridizasyon, PCR tabanlı yöntemler, parça analizi ve dizileme yer alır.
SNP dizileri gibi doğrudan hibridizasyon teknikleri, tek tek SNP'leri doğrudan tanımlamak için kısa oligonükleotid probları kullanır. Yüz binlerce SNP tek bir biyoçip üzerinde test edilebilir. Problar, tipik olarak bir cam slayt olan çip matrisine kimyasal olarak sabitlenir. Bir numunedeki SNP'leri tespit etmek için, izole edilmiş genomik DNA, PCR ile amplifiye edilir ve prob bağlama verimliliğini artırmak için parçalanır. DNA daha sonra tipik olarak bir floresan işaretleyici ile etiketlenir ve ardından çipe hibridizasyon yapılır. Numune DNA'sının problara bağlanmasına izin verildikten sonra, bağlanmamış veya spesifik olarak bağlanmamış tüm DNA yıkanır. Her bir prob noktasındaki sinyalin ölçülmesiyle, numunedeki hedef alelin varlığı belirlenebilir.
Başka bir SNP tipleme yöntemi, primerlerin SNP içeren dizilere karşı tasarlandığı, böylece yalnızca mükemmel tamamlayıcı alele hibritleşecek şekilde tasarlandığı alele özgü PCR'dir. PCR ürünleri, floresan etiketler gibi yöntemlerle tespit edilebilir. Alternatif olarak, SNP'nin ilgilenilen bölgesini çevreleyen PCR primerleri, TaqMan PCR testinde olduğu gibi, SNP'ye özgü bir prob ile birlikte tasarlanabilir. Burada, prob bir floresan işaretleyicinin yanı sıra yakındaki işaretleyiciden gelen floresansı bastıran bir söndürücü molekül içerir. PCR sırasında, yalnızca spesifik olarak bağlı prob dizisi, polimerazın 5' eksonükleaz aktivitesi ile bozulacak, floresan etiketini söndürücüden ayıracak ve belirli varyantın varlığını gösteren bir floresan sinyali ile sonuçlanacaktır.
Parça analizi adı verilen üçüncü bir yöntem kategorisi, belirli bir SNP'nin varlığına veya yokluğuna bağlı olarak çeşitli boyutlarda veya etiketlerde DNA parçalarının oluşturulmasını içerir. Restriksiyon fragmanı uzunluk polimorfizmi analizi, bir alelin parçalandığı ve diğerinin ayrılmadığı hedef dizileri için restriksiyon endonükleazlarının katı özgüllüğünden yararlanır. Ligasyon testi, biri hedef SNP baz çiftinde sonlanan, doğrudan yan yana yerleştirilmiş iki prob kullanır. SNP içeren prob mükemmel bir şekilde bağlanırsa, ligasyon meydana gelebilir. Primer uzatma testi, hedef SNP'den kısa bir nükleotidi bağlayan primerleri içerir. Bu astar daha sonra mevcut bireysel alele bağlı olarak değişken şekilde uzatılır. Bu yöntemlerle üretilen fragmanlar daha sonra jel veya kılcal elektroforez veya kütle spektrometresi kullanılarak ayırt edilebilir.
Son olarak, dizileme, SNP'leri çok spesifik olarak algılayabilir ve bilinmeyen dizilere sahip yeni SNP'leri tanımlayabilir. Bununla birlikte, gerçek SNP'leri sıralama okuma hatalarından ayırt etmek için ekstra özen ve ek deneysel kopyalar yapılmalıdır. Dizileme teknolojileri daha ucuz ve daha erişilebilir hale geldikçe, araştırmacılar genotipleme için dizilemeyi giderek daha fazla kullanıyorlar.
SNP'lerin nasıl genotiplenebileceğini gördükten sonra, bu teknikler için bazı özel uygulamalara bakalım.
Genotipleme, neredeyse aynı görünüme sahip bir türün çeşitlerini ayırt etmek için kullanılabilir. Bu, önce genomik DNA'nın izole edilmesi, ardından dizileri bilinen SNP'ler veya diğer genetik varyantlarla bağlamak için tasarlanmış primerler kullanılarak PCR ile gerçekleştirilir. Bu primerler, yalnızca spesifik polimorfizmi içeren çeşidin DNA'sını çoğaltacaktır ve bu nedenle bu benzerleri ayırt etmek için kullanılabilir.
Araştırmacılar ayrıca, spesifik ilaca dirençli mutasyonları barındıran patojenik bakterileri tanımlamak için genotipleme kullanırlar. Düşük kaynak ayarları için kolaylaştırılmış bir SNP dizi protokolü, genomik DNA ve PCR ana karışımının doğrudan bir çipe eklenmesiyle oluşturulur. Numune amplifikasyonu ve hibridizasyon tek adımda gerçekleşir. Diziler daha sonra yıkanır, görüntülenir ve sonuçlar, tüberküloz bakterilerinin varlığını veya yokluğunu ve ayrıca ilaca dirençli mutasyonları belirlemek için analiz edilir.
Son olarak, SNP'ler, ilişkilendirme çalışmaları ile hastalık riskini artırdığı bulunan genetik varyantların işlevini değerlendirmek için kullanılabilir. Burada, bilim adamları, ilgilenilen bir genin kopyalanmış kısmında bulunan nötr bir "işaretleyici" SNP için heterozigot olan bir hücre hattı ve ayrıca hastalıkla ilişkili kopyalanmamış bir test SNP'si ile deneyler yaptılar. Belirteç SNP için heterozigot olan, ancak test SNP'nin hastalıkla ilişkili olmayan varyantı için homozigot olan bir negatif kontrol hücresi hattı seçilir. Alele özgü primer uzatması, genomik DNA ve ayrıca eksprese edilen mRNA'dan kopyalanan cDNA tersi üzerinde gerçekleştirildi. Astar uzatma ürünleri daha sonra MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak niceliklendirildi. Araştırmacılar, iki işaretleyici SNP aleli ile ilişkili fragmanların nispi bolluğunu karşılaştırarak, hastalıkla ilişkili SNP'nin gen ekspresyonunun azalmasına neden olup olmadığını belirleyebilirler.
JoVE'nin SNP genotiplemesi hakkındaki videosunu az önce izlediniz. Bu video, SNP'lerin kavramını ve kullanımlarını, SNP'leri tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılan birkaç temel yöntemi tanıttı ve SNP genotiplemesinin üç uygulamasını vurguladı. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Q1: What is a single nucleotide polymorphism and why is it important in genetics?
A single nucleotide polymorphism (SNP) is a variation at a single DNA base that occurs throughout the genome. SNPs are the most common form of genetic variation in humans. While most SNPs do not alter protein structure or gene expression, they can be associated with diseases through linkage to disease-causing variants or by directly causing conditions like cystic fibrosis and sickle cell anemia.
Q2: How do SNP arrays work to identify genetic variants?
SNP arrays use short oligonucleotide probes chemically fixed to a glass slide biochip to identify individual SNPs directly. Hundreds of thousands of SNPs can be tested simultaneously. Isolated genomic DNA is amplified by PCR, fragmented, labeled with fluorescent markers, and hybridized to the chip. After washing away unbound DNA, fluorescent signals at each probe spot indicate the presence of target alleles.
Q3: What is the difference between allele-specific PCR and TaqMan PCR assays?
Allele-specific PCR uses primers designed to hybridize only to perfectly complementary SNP-containing sequences, with detection by fluorescent tags. TaqMan PCR uses SNP-specific probes containing both a fluorescent marker and a quencher molecule. During PCR, the polymerase's 5' exonuclease activity degrades only specifically bound probes, separating the fluorescent tag from the quencher and generating a detectable signal.
Q4: How do restriction fragment length polymorphism and primer extension assays detect SNPs?
Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis exploits restriction endonucleases' specificity, where one allele is cleaved and the other is not, creating different fragment sizes. Primer extension assay uses primers binding one nucleotide short of the target SNP, then variably extends based on the allele present. Both methods generate fragments differentiated by gel electrophoresis, capillary electrophoresis, or mass spectrometry.
Q5: What are haplotypes and how do they simplify genome-wide association studies?
Haplotypes are groups of SNPs in linkage disequilibrium, meaning their variant combinations occur together more frequently than expected by chance, usually due to physical proximity on a chromosome. This allows researchers to differentiate haplotypes by genotyping only a small number of individual SNPs rather than testing all variants, making genome-wide association studies significantly less cost- and labor-intensive.
Q6: How can SNP genotyping distinguish between species varieties with similar appearances?
Genomic DNA is isolated and amplified using PCR primers designed to bind sequences with known SNPs or genetic variants specific to each variety. These primers only amplify DNA containing the specific polymorphism, allowing researchers to distinguish between look-alike varieties. This approach is also used to identify pathogenic bacteria harboring drug-resistance mutations in clinical settings.
Q7: Why is sequencing becoming increasingly important for SNP genotyping?
Sequencing can detect SNPs with high specificity and identify novel SNPs with unknown sequences, capabilities that other methods lack. As sequencing technologies become cheaper and more accessible, researchers increasingly use sequencing for genotyping. However, extra care and additional experimental replicates are necessary to distinguish actual SNPs from sequencing read errors during analysis.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
0:44
Principles of SNP Genotyping
2:35
Genotyping Techniques
5:47
Applications
7:52
Summary