Name: BrUTP iplikli özgü Transkripsiyon Run-on (TRO) Yaklaşımı ile Transkripsiyon Feshi Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Öğrenin, BrUTP ve iplikli özgü TRO yaklaşımı kullanarak mayada RNA polimeraz II transkripsiyon feshini in vivo analiz etme yöntemini. Bu teknik, gen düzenlemesinde faktör rollerini anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ansari laboratuvarındaki araştırma, araştırma hibesi tarafından desteklenmiştir (No. Ulusal Bilim Vakfı'ndan MCB 1020911).

Not: Bu yöntem Medler, S ve Ansari, A. 2&#39;de bildirilen araştırma makalesinde kullanılmıştır. 1. Kültürleme ve Hasat Hücreler <ol><li> Yeni boyanmış bir Saccharomyces cerevisiae plakadan YPD ortamında (10 g / L maya ekstresi, 20 g / L pepton,% 2 dekstroz) hücre 5 ml&#39;lik bir kültürden başlatın. </li><li> 30 ° C ve 250 rpm&#39;de bir orbital çalkalayıcı içinde gece boyunca hücrelerin büyütün. </li><li> 250 mL&#39;lik bölmeli bir şişe içerisinde gece boyunca büyütülmüş kültürden YPD ortamı içinde 100 ml&#39;lik bir nihai hacme 100 kez seyreltilir. Not: kültür, 100 mL toplam TRO reaksiyon başına gerekli olan; Birden reaksiyonlar gerektiği takdirde, kültür daha büyük bir hacim kullanılmalıdır. </li><li> 0.8 bir optik yoğunluğa kadar hücreler büyümek - 1.0, 600 nm (600 ~ 0,8-1,0). </li><li> Bir steril 50 ml konik bir tüp içinde, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 820 x g&#39;de santrifüj ile hücreler hasat edilir. </li><li> buz TMN met 10 mL hücrelerin yeniden süspanseffer (10 mM Tris-HCI pH 7.5, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCI) ve 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 820 x g&#39;de santrifüj pelet hücreleri. Yavaşça aspirasyon ile süpernatantı kaldırmak. </li></ol> Deney çalışma üzerinde 2. permeabilizing ve hazırlanması Hücreler <ol><li> Yukarı ve aşağı pipetleme hafifçe kesilmiş bir P 1000 ucunu kullanarak% 0.6 sarkosil solüsyonu 1 ml hücrelerin tekrar. soğutulmuş bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> bir çalkalama platformunda 25 dakika boyunca 4 ° C &#39;de yavaşça hücreler çalkalayın. Not: mikrosantrifüj tüpleri bu aşamada promoteri meydana gelen yeni bir başlatma olaylarına olma olasılığı önlenmiş olur, soğuk sıcaklık korumak için buz ile 50 ml konik bir tüp içine paketlenmiş olmalıdır. </li><li> Bir masa soğutmalı santrifüj kullanılarak 4 ° C&#39;de 6 dakika boyunca 1200 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. </li><li> Yavaşça per fazla suyu çıkarmak için süpernatant aspiremeabilized hücre topağı. </li></ol> 3. Transkripsiyon Run-on Tepki <ol><li> Transkripsiyon 150 mcL çalışma tampon çözelti (50 mM Tris-HCI pH 7.5, 100 mM KCI, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT (ditiyotreitol), 0.75 mM ATP, CTP, GTP ve BrUTP, 200 U RNaz her permeabilize hücre pelletine inhibitörü). </li><li> Yukarı pipetleme ve kesik P 200 ucunu kullanarak aşağı yavaşça karıştırın. NOT: Birden fazla numune işleme, tüm numuneler hazır olana kadar buz üzerinde her şeyi tutmak ve sonra bir sonraki adıma geçin. </li><li> Bir su banyosu içinde 30 ° C&#39;de 5 dakika süreyle inkübe edilir. Not: olgunlaşmamış RNA&#39;ya BrUTP optimum dahil edilmesini sağlamak için 1 ila 5 dak arasında fırınlama süresi ayarlayın. </li><li> Soğuk hazır kullanım RNA izolasyon reaktif 500 uL ilave ederek reaksiyonu durdurun. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. </li></ol> 4. RNA Ekstraksiyon <ol><li> Hücre suspensi için asitle yıkanmış cam boncuklar 200 uL ekleyin(3.4 adım a) ve vorteks karıştırıcıda 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır ilgili. </li><li> Sıcak 22 G iğne kullanılarak mikrosantrifüj tüpü alt delme ve 15 ml steril konik tüp üzerine yerleştirin. </li><li> 4 ° C&#39;de 1 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücre lizatı toplamak. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne hücre lizat aktarın. </li><li> Soğuk RNA izolasyon reaktif 500 ul hücre lisatı kloroform 200 uL ekleyin. 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 16.168 x g&#39;de vorteksli bir mikserde ve santrifüj içeriğini karıştırın. </li><li> Yeni bir mikrosantrifüj tüpü, üst sulu faz transfer. </li><li> pH 4-5 izoamil alkol / (: 24: 1 125), soğuk fenol / kloroform eşit hacim. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 16.168 x g&#39;de vorteksli bir mikserde ve santrifüj ile kuvvetli bir şekilde çalkalanır. </li><li> Yeni bir mikrosantrifüj tüpü, üst sulu faz ihtiva eden RNA aktarın. Adımı yineleyin 4.6 iki kez daha. </li><li> Nihai RNA içeren sulu faz için, 5 M NaCI stoc ekleme0.3 M bir son konsantrasyon RNA çökeltilmesi için 3 kez soğuk etanol hacim kazandırmak için k. <ol><li> 1 saat veya gece -20 ° C&#39;de inkübe edin. NOT: - anti-BrdU boncuklar (adım 5.3) engelleme inkübe edilirken 4.11 adımları 4.9 gerçekleştirin. </li></ol></li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 16.168 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı ve DEPC (diethylpyrocarbonate) su 100 ul RNA pelletini. </li><li> unincorporated BrUTP nükleotidlerden RNA ayırmak için bir RNA izolasyonu, mini kiti kullanın. RNaz içermeyen su, 100 uL ile kolondan RNA Zehir. </li><li> 5 dakika için 65 ° C su banyosu içinde RNA inkübe ve daha sonra en az 2 dakika süreyle buza transfer. </li></ol> BrUTP etiketli RNA 5. Affinity Arıtma <ol><li> 25 mcL anti-BrdU ekleyin, boncuk yerleşti 500 0.25X SSPE (Sodyum Salin Fosfat EDTA) bağlayıcı tampon (20x SSPE uL: 3 M NaCl, 0.2 M NaH 2 PO 4 </sub&gt;, 0.02 M EDTA, pH 7.4, 1 mM EDTA,% 0.05 Tween, 37.5 mM NaCI). 4 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca 200 xg&#39;de santrifüj ve supernatant çıkarın. </li><li> Adımı yineleyin 5.1 üç kez. </li><li> tanelerine (1 mg ultra saf sığır serum albümini (BSA) tampon,% 0.1 polivinilpirolidon, 1 x bağlama) blokaj tamponu içinde 500 ul ilave edin ve yavaşça 1 çalkalayın - bir çalkalama platformunda 4 ° C&#39;de, 2 saat. </li><li> Adım 5.1&#39;de tarif edildiği gibi, bağlama tamponu, 500 uL boncuk iki kez daha yıkanır. </li><li> tanelere bağlayıcı tampon 400 ul ekle. </li><li> boncuk doğrudan (adım 4.11 itibaren) RNA 100 uL aktarın. bir çalkalama platformunda 4 ° C&#39;de 2 saat - yumuşak 1 çalkalayarak kuluçkalayın. </li><li> bağlama tamponu, 500 uL, düşük tuz tamponu 500 uL (0.2x SSPE, 1 mM EDTA,% 0.05 Tween), yüksek tuz tamponu 500 uL (0.25X SSPE, 1 mM EDTA,% 0.05 Tween ile boncuk birbiri ardına yıkandı, 100 mM NaCI) ve iki kez TET tampon 500 uL (1X TE,% 0.05 Tween), sıkma ileHer yıkama arasında 4 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca 200 x g. </li><li> 150 ul iki kez sıralı boncuklardan BrUTP etiketli RNA Zehir ve bir kez yıkama tamponu (20 mM DTT, 150 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 7.5, 1 mM EDTA,% 0.1 SDS), 200 ul, inkübe edilerek süpernatandan boncuk ayırmak için kısa bir sıkma ve ardından bir su banyosu içinde 42 ° C &#39;de 4 dakika karıştırıldı. </li></ol> BrUTP Etiketli RNA 6. Yağış <ol><li> izoamil alkol / soğuk fenol / kloroform, 500 uL ekleyin (: 24: 125 1), pH 4 - 5 BrUTP saflaştınldı afinite RNA etiketli. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 16.168 x g&#39;de vorteksli bir mikserde ve santrifüj ile karıştırın. </li><li> Yeni bir mikrosantrifüj tüpü, üst sulu faz transfer. </li><li> RNA çökeltilmesi için soğuk etanol, 0.3 M 3 kez hacimli bir son konsantrasyon elde etmek için 5 M NaCI stok ekleyin. </li><li> -20 ° C sıcaklıkta gece boyunca inkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 16.168 x g&#39;de santrifüje edilerek çöktürüldü RNA toplayın. &lt;/ Li&gt; <li> Süpernatantı ve 10 dakika boyunca havada kurumaya pelet izin verir. </li><li> DEPC su 26 uL RNA pelletini. </li><li> bir spektrofotometre kullanılarak 260 nm&#39;de absorbans ölçülerek son RNA konsantrasyonunun belirlenmesi. Ayrıca, 260/280 oranını belirlemek. A oranı yaklaşık 2 saf RNA numunesinin bir göstergesidir. </li><li> cDNA sentezi için gerekli olana kadar -80 ° C &#39;de parçalar halinde RNA örnekleri saklayın. </li></ol> BrUTP etiketli RNA 7. Arka Transkripsiyon <ol><li> 100 ng RNA konsantrasyonu ayarlama / uL DEPC su ile. Her cDNA sentez reaksiyonu için RNA, 0.5 ug kullanın. Not: RNA şablonu konsantrasyonunun uygun cDNA sentezi elde etmek için 0.5 ile 1.0 ug değişebilir. </li><li> Şekil 3A&#39;da gösterildiği gibi, aşağı doğru poli (A) alanı (sonlanma) tasarlanmış çok sayıda ters primerleri kullanılarak RNA nın ters transkripsiyonunu. </li><li> Her bir ters transkripsiyon reaksiyonu için RNA templat ul 5 eklemeE (0.5 ug), 1 pL dNTP karışımı (her biri 10 mM), revers primer C, D, E, F ya da G&#39;nin 2 uL (50 uM her biri) ve nükleaz serbest su (Şekil 3A). Her bir tüp içinde son reaksiyon hacmi 13 ml. Not: Ters transkripsiyon reaksiyonları sayısı cDNA sentezi için kullanılan ters primer sayısına bağlıdır. Örneğin, ASC1 beş ters primerler kullanılmıştır ve bu nedenle, beş, ters transkripsiyon reaksiyonları kurulmuştur. cDNA sentezi için kullanılan ters primer temelinde C, D, E, F ve G gibi bir tüp etiketleyin. </li><li> Herhangi bir ikincil yapısal yapıyı çıkarmak için 5 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir PCR RNA şablonu, dNTP karışımı ve primerler ihtiva eden tüpler inkübe ve en az 2 dakika süreyle 4 ° C&#39;ye kadar soğutulur. </li><li> 1 pL transkriptazı (200 U / ml) ters ekleme, 4 ul tampon ve RNA şablon ve primer ihtiva eden her tüpe 0.1 M DTT 2 uL (7.4 adım). yukarı ve aşağı hafifçe pipetleme karıştırın. </li><li> 60 dakika boyunca 42 ° C &#39;de bir PCR reaksiyon karışımı inkübe edilerek ters transkripsiyon gerçekleştirin. </li><li> 20 dakika boyunca, 65 ° C&#39;de ters transkriptaz inaktive. </li><li> -20 ° C&#39;de cDNA Mağaza ya da bir sonraki adıma geçin. </li></ol> cDNA 8. amplifikasyonu <ol><li> Aşama 7.8, 1.0 uL ileri primer B (10 uM), 1.0 ul den 3.0 uL cDNA şablonu aşağıdaki gibidir: Aşama 7.8 (ASC1 C, D, E, F ve G etiketli) Her cDNA hazırlanması amplifikasyonu için PCR reaksiyonunu gerçekleştirmek ters primer C veya D veya E veya F veya G (10 uM), 2.5 uL 10x polimeraz PCR tamponu, 0.5 uL dNTP karışımı (10 mM), 1.0 uL MgCl2 (2.5 mM), 15.5 pL PCR dereceli su ve 0.5 uL termostabil polimeraz enzimi. Not: 5 ila 1: 1 arasında değişen bir cDNA şablonu değişik seyreltileri 100 PCR ürünü verimini optimize etmek için test edilmelidir. Tek bir promotör-yakın ileri primer cDNA yı çoğaltmak için kullanılırFarklı geri primerler kullanılarak elde edilmiştir. Örneğin, promotör yakınındaki tek ileri primer B ASC1 G C beş ters primerler ile birlikte kullanılmıştır. BC, BD, Şekil 3A&#39;da gösterildiği gibi, BF ve BG, sırasıyla C, D, E, F ve G olarak işaretlenmiş tüplere kullanılmıştır, BE. </li><li> Aşağıdaki termal döngü parametreleri kullanılarak PCR çalışması: 1 döngü 2 dakika süreyle, 95 ° C (polimeraz aktivasyonu için sıcak başlangıç), 30-40 döngü 30 saniye (cinsini değiştirme), 15 saniye için 54 ° C, 95 ° C (tavlama) 1 dakika (uzatma) ve 1 devir 5 dakika için 68 ° C (son uzatma) için 68 ° C&#39;dir. Not: bağlanma sıcaklığı kullanılan özel primerler bağlı olarak değişir ve uzatma süresi Beklenen ürün boyutuna bağlı olarak değişir. </li><li> % 0.8,% 1.5 ya da ürünün beklenen boyutuna bağlı olarak% 2 agaroz jelleri üzerinde elektroforez ile PCR ürünü ayırın. </li><li> El kaderi ve diğerleri de tarif edildiği gibi bir PCR ürünü ölçmek. 2012 11. NOT: Alternatif olarak, doğmakta olan transkript miktarını ölçmek için gerçek zamanlı RT-qPCR stratejisini kullanın. </li></ol>

<ol><li>Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+termination+of+transcription+to+messenger+RNA+maturation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast.</a> Science. 280 (5361), 298-301 (1998).</li>
<li>Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+looping+facilitates+TFIIH+kinase-mediated+termination+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription.</a> Sci Rep. 5, 12586(2015).</li>
<li>Richard, P., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+termination+by+nuclear+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription termination by nuclear RNA polymerases.</a> Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).</li>
<li>Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disengaging+polymerase%3A+terminating+RNA+polymerase+II+transcription+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast.</a> Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).</li>
<li>Porrua, O., Libri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+termination+and+the+control+of+the+transcriptome%3A+why%2C+where+and+how+to+stop%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).</li>
<li>Jacquier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+eukaryotic+transcriptome%3A+unexpected+pervasive+transcription+and+novel+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs.</a> Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+promoters+generate+pervasive+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).</li>
<li>Neil, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+bidirectional+promoters+are+the+major+source+of+cryptic+transcripts+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).</li>
<li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reality+of+pervasive+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The reality of pervasive transcription.</a> PLoS Biol. 9 (7), e1000625(2011).</li>
<li>Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+antisense+transcription+is+evolutionarily+conserved+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast.</a> Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).</li>
<li>El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+between+genomic+loci+through+Chromosome+Conformation+Capture+%283C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C).</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15(2012).</li>
<li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada kullanılan iplikçik özgü TRO protokolü memeli hücrelerinde 12 Gro-Sek (Global Run On-Sıralama) analiz için kullanılan protokol uyarlanmıştır. Biz başarıyla maya tomurcuklanan doğmakta olan transkripsiyonu incelemek için protokol güncellenmiştir. Özellikle transkripsiyon sonlandırma kusur analiz etmek, biz RNA hidroliz adımı kurtularak daha protokolü ayarlanır. Bu bize özellikle promotör bölgenin yakınında transkripsiyon başlangıç ​​sitesinden başlatılan tam uzunlukta oluşmakta olan transkr...

Ökaryotik transkripsiyon döngüsü üç ana adımdan oluşur; başlatma, uzama ve sonlanma. RNA polimeraz II transkripsiyonun sonlandırılması, iki farklı, birbirine Adım 3 oluşur. İlk adım, şablondan ayrılması, poliadenilasyonu ve mRNA&#39;nm salınmasını içerir ve hemen şablondan polimerazın ayrılma ile işaretlenmiş, ikinci aşama takip eder. Uygun sonlandırma ve RNA 4, 5 kodlayıcı olmayan yaygın transkripsiyonunu sınırlayarak kontrol anormal transkripsiyonu tutmak için aşağı genlerin transkripsiyonu müdahaleyi önlemek için, transkripsiyon başlama / yeniden başlatılması sırasında polimeraz geri dönüşümü için hayati önem taşımaktadır. Son gelişmelere rağmen, fesih RNA polimeraz II transkripsiyon döngüsü çok az anlaşılan adım olduğunu. Güvenilir bir sonlandırma tahlil mekanizmasını underlyin eğitim için gerekli olanin vivo RNA polimeraz II tarafından transkripsiyon g sonlandırma. Deneysel bir kısım yaklaşımlar, fizyolojik koşullar altında, bir aktif transkripsiyonu gen sonlandırma kusuru tespit etmek için kullanılır. Bunlar, Kuzey benek, fesih faktörü ChIP (Kromatin Immunoprecipitation) ve geleneksel TRO deneyini içerirler. Bu tekniklerin her biri bazı avantajları ve dezavantajları vardır. Kullanılan geleneksel TRO deney in vivo 1 bir transkripsiyon sonlandırma kusur tespiti için en güvenilir ve hassas bir yaklaşım olarak. Bu tahlil hücre içinde bir genin farklı bölgelerde transkripsiyonel olarak aktif polimeraz molekülleri lokalize. Normal koşullar altında, deney katı geni (Şekil 1A) promoter ve terminatör bölgesi arasında dağıtıldı transkripsiyonel kavranan polimeraz molekülleri gösterir. kusurlu sona ermesi üzerine, ancak, polimeraz sonlandırma sinyali okuyamıyorve gen (Şekil 1B) 3 &#39;ucunun alt baş bölgesinde saptanır. Bir transkripsiyon sonlandırma kusur promotör yakın bölgeden başlatılan duyu-transkripsiyon polimeraz mevcudiyetinde ortaya ve sonlandırma sinyali Okuyamamak olup, Şekil &#39;de gösterildiği gibi, bir genin 3&#39; ucunun alt baş bölgesi transkripsiyonu devam Şekil 2A. Genom ve bir genin 6, 7, 8, 9, 10 civarında ezici yaygın anlamda transkripsiyonu yanı sıra anti-sens yön gösteren gerçekleştirilmesi, yakında geleneksel TRO tahlil algılayamaz belli oldu polimeraz sinyali ise bir genin bir teşvikçinin akış aşağısına başlatılan transkript (Şekil 2A) ya da som başlatılan anormal RNA temsilbir gen ya da terminatör elemanı (Şekil 2B) ya da genin (Şekil 2C) 3 &#39;anti-sens yönünde polimeraz transkripsiyonu alt baş ortasına ewhere. gözlenen okuma domeyni polimeraz sinyal yükseltici tarafından başlatılan uzun sens mRNA veya inceleme konusu genin alt başlatılan bir anti-sens transkripti temsil ediyorsa kullanılarak BrUTP burada açıklanan şerit spesifik TRO deney ayırt edebilir. Biz başarıyla maya 2 tomurcuklanan transkripsiyon sonlandırılmasında Kin28 kinaz rolünü göstermek için bu yaklaşımı kullandık. Burada bir yaklaşımı uygulamak suretiyle Biz Rna14 maya tomurcuklanmasına ASC1 transkripsiyon sonlandırma için gerekli olduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Fenol-kloroform-izoamil alkol karışımı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td>pH 4-5</td></tr><tr><td>TRIzol reaktifi</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>RNaz İnhibitörü, insan plasentası</td><td>New England Biolabs</td><td>M0307S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU boncukları</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-32323AC</td><td></td></tr><tr><td>Protoscript II</td><td>New England Biolabs</td><td>M03368L</td><td>veya eşdeğer bir enzim</td></tr><tr><td>Avantaj 2 polimeraz Karışımı</td><td>Clontech</td><td>639201</td><td>veya eşdeğer bir enzim</td></tr><tr><td>5-Bromouridin 5' trifosfat sodyum tuzu</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-214314A</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kiti</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0451AA</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td></td><td>N0454AA</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td></td><td>N0452AA</td><td></td></tr><tr><td>Ultra saf sığır serum albümini (BSA)</td><td>MC Labs</td><td>UBSA-100</td><td></td></tr><tr><td>Asc1 B</td><td></td><td></td><td>AGATTCGTCGGTCACAAGTCC</td></tr><tr><td>Asc1 C</td><td></td><td></td><td>GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC</td></tr><tr><td>Asc1 D</td><td></td><td></td><td>TGTACATATGTATTCGCAGCA</td></tr><tr><td>Asc1 E</td><td></td><td></td><td>GCCAAGGAGACTGAATTTAATG</td></tr><tr><td>Asc1 F</td><td></td><td></td><td>CTATGGAATGGGGGTTTTAAG</td></tr><tr><td>Asc1 G</td><td></td><td></td><td>GGTTATGGCAGACATGCCAC</td></tr><tr><td>5s cDNA</td><td></td><td></td><td>AGATTGCAGCACCTGAGT</td></tr><tr><td>5' 5s ters</td><td></td><td></td><td>GGTTGCGGCCATATCTAC</td></tr><tr><td>3' 5s ters</td><td></td><td></td><td>TGAGTTTCGCGTATGGTC</td></tr></tbody></table>

brutp iplikli özgü transkripsiyon run-on (tro) yaklaşımı ile transkripsiyon feshi analizi

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Bu el yazması in vivo transkripsiyon sonlandırma kusuru tespit etmek için bir protokol tanımlamaktadır. kullanarak BrUTP Burada anlatılan iplikçik özgü TRO protokolü fizyolojik koşullar altında transkripsiyon sonlandırma kusuru analiz etmek için güçlü bir deneysel yaklaşımdır. Geleneksel TRO tahlilinde olduğu gibi, bir transkripsiyon sonlandırma kusuru 1 bir göstergesi olarak genin 3 &#39;ucunun ötesine, transkripsiyonal olarak aktif polimeraz varlığına dayanır. Geleneksel TRO testi ile karşılaştı iki büyük sorunlar üstesinden gelir. Birincisi, bu sonlandırma sinyalleri aracılığıyla okuma polimeraz promotör-proksimal bölgeden transkripsiyonu başlatılan biridir olmadığını algılamak, ya da basitçe bir yerde vücutta gelen non-spesifik olarak başlatılan yaygın bir transkripsiyonu polimeraz ya da 3 &#39;temsil eğer genin sonu. İkinci olarak, ayırt eğer ötesinde transkripsiyonel olarak aktif polimeraz sinyalisonlandırıcı bölge gerçek okuma domeyni sens mRNA transkripsiyonu polimeraz ya da bir terminatör başlatılan kodlayıcı olmayan anti-sens RNA sinyalidir. Kısaca, protokol, katlanarak büyüyen maya hücrelerini geçirimli afinite yaklaşımla BrUTP etiketli RNA saflaştırılması, BrUTP nükleotid mevcudiyetinde ince uzun in vivo olarak başlatılan transkript izin içerir saflaştırılmış Yeni oluşan RNA transkripsiyonu ve cDNA amplifiye kullanılarak ters promoteri ve gen 2&#39;nin sonlandırıcı bölgeleri çevreleyen tel-spesifik primerler.

Bir transkripsiyon sonlandırma kusur tespit BrUTP iplikli spesifik TRO prosedürü uygulanabilirliğini göstermek için, RNA14 bir sonlandırma arızalı, sıcaklığa duyarlı bir mutant rna14-1 adı kullanılır. RNA polimeraz II, transkripsiyon sona erdirilmesi Rna14 rolü seçilen gen 1 terminatör-proksimal bölgesinde RNA tespit geleneksel TRO tahlili kullanılarak ortaya çıkartılmıştır. Permisif olmayan sıcaklıkta rna14-1 mutant terminatör bölge öte...

Tomurcuklanan mayada ipliğe özgü transkripsiyon run-on (TRO) yaklaşımı ile BrUTP kullanarak in vivo RNA polimeraz II tarafından transkripsiyonun sonlandırılmasının analizi için temel bir deneysel yaklaşımı açıklıyoruz. Bu protokol, hem mayada hem de daha yüksek ökaryotlarda diğer RNA polimerazlar tarafından transkripsiyon sonlandırmasını incelemek için genişletilebilir.

BrUTP iplikli özgü Transkripsiyon Run-on (TRO) Yaklaşımı ile Transkripsiyon Feshi Analizi

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Bu prosedürün genel amacı, RNA polimeraz tarafından tomurcuklanan mayaya transkripsiyonun sonlandırılmasını in vivo koşullar altında, ipliğe özgü transkripsiyon yaklaşımı ile incelemektir. Bu yöntem, genin üç ana ucunun ötesinde tespit edilen transkripsiyonel olarak aktif polimerazın, promotör bölgeden başlatılan polimer olup olmadığı sorusunu yanıtlamaya yardımcı olur. Bu yöntemin ana avantajı, bir MRNA transkripsiyon polimerazı, transkripsiyonları başlatan ve genin üç ana ucunda olacak olan yaygın olarak transkribe eden bir polimerazdan ayırt edebilmesidir.Bu teknik, farklı polimerazlar tarafından sonlandırmanın koruyucu doğası nedeniyle diğer RNA polimerazlar ve maya tarafından transkripsiyonun sonlandırılmasını incelemek için genişletilebilir. Bu yöntem, maya transkripsiyon döngüsündeki sonlandırma faktörlerinin kesin rolü hakkında fikir verebilse de, daha yüksek ökaryotlarda sonlandırmayı incelemek için de genişletilebilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, dikkatli bir uygulama gerektirdiğinden, hücre geçirgenliği ve duraklarda çalıştırılan transkripsiyon ile mücadele edeceklerdir ve yeni ortaya çıkan transkriptlerin saflaştırılması da zor olabilir.Bu yöntem için ilk olarak, transkripsiyonel olarak aktif polimerazların konumunun ipliğe özgü bir şekilde genom çapında bir anlık görüntüsünü veren GRO arama yaklaşımından elde ettik. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü yeni ortaya çıkan transkriptlerin düşük miktarı ve kararsız doğası nedeniyle transkripsiyon çalışması ve RNA saflaştırmasının gerçekleştirilmesi zordur. Transkripsiyona başlamadan önce, geçirgen bir hücre paleti elde etmek için reaksiyon üzerinde çalıştırın, büyütün, hasat edin ve katlanarak büyüyen maya hücrelerini geçirgen hale getirin.Reaksiyonu başlatmak için, geçirgen hücre paletine tampon üzerinde çalıştırılan 150 mikrolitre transkripsiyon ekleyin. Kesik bir P-200 ucu kullanarak, yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın. Numuneyi buzun üzerine yerleştirin.Tüm numuneler tampon üzerinde çalıştırılan transkripsiyonda yeniden askıya alındıktan sonra, numuneleri bir su banyosunda 30 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Her numuneye 500 mikrolitre soğuk kullanıma hazır RNA izolasyon reaktifi ekleyerek reaksiyonu durdurun. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.RNA ekstraksiyon prosedürüne, her hücre süspansiyonuna 200 mikrolitre asitle yıkanmış cam boncuk ekleyerek ve dört santigrat derecede 20 dakika boyunca bir girdap karıştırıcıda kuvvetlice çalkalayarak başlayın. 20 dakika sonra, her bir mikrosantrifüj tüpünün altını delmek için sıcak 22 gauge iğne kullanın ve tüpü 15 mililitrelik steril konik bir tüpün üstüne yerleştirin. Dört santigrat derecede bir dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin ve hücre lizatını 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Hücre lizatına 500 mikrolitre soğuk RNA izolasyon reaktifi ve 200 mikrolitre kloroform ekleyin. İçeriği vorteks karıştırıcıda karıştırın ve ardından dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 16, 168 kez G'de santrifüjleyin. Üst sulu fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Eşit hacimde soğuk fenol kloroform izoamil alkol ekleyin. Vorteks karıştırıcı üzerinde kuvvetlice çalkalayın ve ardından dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 16, 168 kez G'de santrifüjleyin. RNA içeren üst sulu fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Eşit hacimde soğuk fenol kloroform izoamil alkol ekleyin, girdap yapın ve tekrar santrifüjleyin. Sulu faz içeren son RNA'ya, 0.3 molar'lık bir nihai konsantrasyon elde etmek için uygun bir hacimde beş molar sodyum klorür stoğu ekleyin. RNA'yı çökeltmek için hacminin üç katı soğuk etanol ekleyin.20 santigrat derecede bir saat veya gece boyunca inkübe edin. RNA çökeltmesi tamamlandığında, dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 16, 168 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve RNA paletini 100 mikrolitre DEPC suyunda yeniden süspanse edin.RNA'yı dahil edilmemiş bromouridin trifosfat nükleotidlerinden ayırmak için bir RNA izolasyon kiti kullanın ve RNA'yı 100 mikrolitre RNAz içermeyen su ile kolondan elüte edin. RNA'yı 65 santigrat derece su banyosunda beş dakika inkübe edin. Ve sonra en az iki dakika buza aktarın.RNA çökeltilirken anti bromo DU boncuklarını hazırlayarak bu işleme başlayın. Her numune için, 25 mikrolitre çökelmiş boncuklara 500 mikrolitre 0.25 X sodyum salin fosfat EDTA bağlayıcı tampon ekleyin. Dört santigrat derecede 30 saniye boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.Boncukları bağlama tamponu ile üç kez yıkayın. Süpernatanı üçüncü yıkamadan çıkardıktan sonra, boncuklara 500 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin ve bir platform çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede bir ila iki saat hafifçe çalkalayın. Boncukları 500 mikrolitre bağlayıcı tampon ile iki kez daha yıkayın.Süpernatanı ikinci yıkamadan çıkarın ve boncuklara 400 mikrolitre bağlayıcı tampon ekleyin. 100 mikrolitre RNA'yı doğrudan boncuklara aktarın. Bir platform çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede bir ila iki saat hafifçe çalkalayarak inkübe edin.Dört santigrat derecede 30 saniye boyunca 200 kez G'de döndürün ve ardından süpernatanı çıkarın. Ardından, boncuklara 500 mikrolitre bağlayıcı tampon ekleyin. Dört santigrat derecede 30 saniye boyunca 200 kez G'de döndürün ve süpernatanı çıkarın.Bu şekilde, boncukları sırayla bağlama tamponu, düşük tuz tamponu, yüksek tuz tamponu ve iki kez TET tamponu ile yıkayın. Boncuklardan bromuridin trifosfat etiketli RNA'yı çıkarmak için 150 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve bir su banyosunda 42 santigrat derecede dört dakika inkübe edin. Kısa bir süre aşağı dönün ve süpernatanı toplayın.Bu şekilde, 150 mikrolitre ile iki kez ve 200 mikrolitre elüsyon tamponu ile bir kez sırayla elüte edin. Her numuneden yaklaşık 500 mikrolitre afinite saflaştırılmış bromouridin trifosfat etiketli RNA elde edilmelidir. RNA etiketli afiniteye saflaştırılmış bromouridin trifosfatı çökeltmek için, her numuneye 500 mikrolitre soğuk fenol kloroform izoamil alkol ekleyin.Dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 16, 168 kez G'de girdap ve santrifüjleyin. Üst sulu fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 0.3 molar'lık bir nihai konsantrasyon elde etmek için beş molar sodyum klorür stoğunun uygun hacmini ekleyin.Sonra hacminin üç katı soğuk etanol ekleyin. RNA'yı çökeltmek için gece boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, çökeltilmiş RNA'yı dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 16, 168 kez G'de santrifüjleme ile toplayın.Süpernatanı çıkarın ve paletin 10 dakika kurumasını bekleyin. RNA paletini 26 mikrolitre DEPC suyunda yeniden süspanse edin. Bir spektrofotometre kullanarak 260 nanometrede absorbansı ölçerek nihai RNA konsantrasyonunu belirleyin.RNA örneklerini ve alikotları, cDNA sentezi için gerekli olana kadar 80 santigrat derecede saklayın. Tomurcuklanan mayada ASC1 geninin transkripsiyonunun sonlandırılması için RNA 14'ün gerekliliğini test etmek için yaklaşımda çalıştırılan bromouridin trifosfat zincirine özgü transkripsiyon kullanıldı. RNA 14-1 mutantından ve izojenik vahşi tip hücrelerinden bromoreidin trifosfat etiketli RNA saflaştırıldı ve C, D, E, F ve G primerleri ile ters kopyalandı.Mutantta B ve E, B ve F ve B ve G primer çiftlerinden PCR amplifiye edilmiş ürünlerin varlığı, bir sonlandırma okuma fenotipini yansıtır. Bununla birlikte, vahşi tip hücrelerde, sinyal üzerinde çalışan transkripsiyon, sonlandırıcı elemana kadar sınırlıydı ve sonlandırıcı bölgenin ötesinde sinyal üzerinde algılanabilir bir transkripsiyon çalıştırılmadı. Bu grafik, normalizasyon kontrolü olarak beş S RNA ile jellerin miktar tayinini göstermektedir.Mutantta sonlandırma sinyalini okuyan, ancak vahşi tip hücrelerde okumayan, promotör tarafından başlatılan yeni ortaya çıkan transkriptlerin tespiti, RNA 14'ün bir sonlandırma faktörü olduğunu doğrular. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik üç gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, reaksiyon üzerinde çalıştırılan transkripsiyonun başarılı bir sonuç elde etmek için kritik olduğunu hatırlamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, bir faktörün genom çapında sonlandırmadaki rolü gibi ek soruları yanıtlamak için GRO araması gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, transkripsiyon alanındaki araştırmacıların, maya ve daha yüksek ökaryotik sistemlerdeki diğer RNA polimerazlar tarafından sonlandırılmayı keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, transkripsiyonun nasıl gerçekleştirileceğini, reaksiyonlar üzerinde nasıl çalıştırılacağını ve yeni ortaya çıkan etiketli transkriptlerin nasıl saflaştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.RNA'nın son derece kararsız olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven giymek, sıcaklığı dört santigrat derece civarında tutmak ve RNAse içermeyen ajanlar kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

analysis-termination-transcription-using-brutp-strand-specific

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Telomerler kromozom istikrar için çok önemlidir ve telomer G-çıkıntı yapısı, telomeraz aracılı telomer bakımı için önemlidir. Biz son zamanlarda telomer G-çıkıntı yapı tespit etmek için iki yöntem...

Telomer G-çıkıntı Yapısı incelenmesi Trypanosoma brucei</em

RNA polimeraz II olgun mRNA'nın 3 'ucunun ötesine uzanan bir ön-madde RNA sentezler. Olgun RNA uç yarılma kompleksinin endonükleaz etkinliği ile, RNA dizileri tarafından dikte bir bölgede, cotranscriptionally oluşturulur. Burada, detay in vitro bölünme reaksiyonları çalışma yöntemi biz.

Pre-mRNA Substratlarm 3 &#39;End Bölünme: Hücre Ücretsiz Sistemlerini Kullanma RNA İşleme Reaksiyonları Analizi<em&gt; In vitro</em

Burada, bakteri transkriptlerinden transkripsiyonel başlangıç noktalarını belirlemek ve otomatik bir jel dizileyici kullanarak in vivo RNA işlemeyi belirlemek için floresan bazlı bir primer uzatma yöntemini açıklıyoruz.

Floresan Bazlı Astar Uzatma Tekniği Transkripsiyonal Başlangıç ​​Noktalarını ve RNases yarılması Siteleri belirleme In Vivo

Bu protokol, in silico bulunan sonlandırıcıların gücünü hızlı bir şekilde ölçmek için Golden Gate Assembly ve plazmid pGR-blue'yu kullanır.

PGR-Mavi Plasmitlerinin ve Golden Gate Meclis kullanma Terminatör Hızlı Doğrulama

Bu iletişim kuralı ChIP-seq, 4sU seq, toplam RNA-seq ve hücre satırları ve Primer hücre için profil oluşturma ribozom Kombinatorik kullanımını açıklar. Transkripsiyon faktörü de novo transkripsiyon, RNA işlenmesi, ciro ve çeviri zamanla, bağlama ve olayların genel gidişatı harekete geçirmek ve/veya hızla değişen hücrelerde görüntüleme izleme değişiklikleri sağlar.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Vitro becerisini ölçmek için Toeprinting amaçları için formu çeviri başlatma kompleksleri ile ribozomlara koşulları çeşitli altında RNA transkripsiyonu. Bu iletişim kuralı toeprinting memeli RNA için bir yöntem açıklanır ve kap-bağımlı ve IRES uygulamalı çeviri çalışma için kullanılabilir.

Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi

Dairesel RT-PCR, nicel RT-PCR, RNA 5 ' polyphosphatase-Treatment ve Kuzey Blot 'u birleştirerek döngüsel bir RT-PCR tabanlı strateji sunuyoruz. Bu protokol dengesiz 5 ' trifosfat etkisini en aza indirmek için bir normalleştirme adım içerir, ve ayrımcılık ve, Mısır mitochondrion dengeli birikmiş birincil ve işlenmiş transkriptler haritalama için uygundur.

Dairesel bir RT-PCR tabanlı strateji kullanarak Maize mitochondrion 'da primer ve Işlenmiş transkriptlerin ayrımcılık ve haritalama

Onkojenik füzyon transkripsiyon faktörü fonksiyonu için özünde düzensiz alan adları önemlidir. Bu proteinleri terapötik olarak hedeflemek için, bu alanlar tarafından kullanılan düzenleyici mekanizmaların daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılması gerekir. Burada, Ewing sarkomunda özünde düzensiz olan EWS alanının önemli yapısal özelliklerini haritalamak için transkriptomik kullanıyoruz.

Transcriptomik Analiz Kullanarak Düzensiz Onkojenik Transkripsiyon Faktörlerinin Yapı-fonksiyon İlişkilerinin Eşlenmesini

Bu protokol, biyoinformatiğe yeni başlayanlara, kullanıcıların CUT &amp; RUN sıralama verilerinin ilk analizini ve doğrulamasını tamamlamalarını sağlayan giriş niteliğinde bir CUT &amp; RUN analiz hattı aracılığıyla rehberlik eder. Burada açıklanan analiz adımlarının tamamlanması, aşağı akış tepe açıklaması ile birlikte, kullanıcıların kromatin regülasyonu hakkında mekanik içgörüler elde etmesine olanak tanır.

CUT&#38;RUN Sıralama Verilerinin Giriş Analizi ve Doğrulanması

Bu yazıda, transkripsiyonu ve bakteriyel transkripsiyonu hedefleyen antibakteriyel ajanların inhibitör aktivitesini işlevsel olarak incelemek için bir protokol açıklıyoruz.

İn Vitro Transkripsiyon Tahliller ve İlaç Keşfi Onların Uygulama

Öğrenin, BrUTP ve iplikli özgü TRO yaklaşımı kullanarak mayada RNA polimeraz II transkripsiyon feshini in vivo analiz etme yöntemini. Bu teknik, gen düzenlemesinde faktör rollerini anlamak için değerlidir.

BrUTP iplikli özgü Transkripsiyon Run-on (TRO) Yaklaşımı ile Transkripsiyon Feshi Analizi

Daha fazla video keşfet