BrUTP iplikli özgü Transkripsiyon Run-on (TRO) Yaklaşımı ile Transkripsiyon Feshi Analizi
March 12th, 2017
Tomurcuklanan mayada ipliğe özgü transkripsiyon run-on (TRO) yaklaşımı ile BrUTP kullanarak in vivo RNA polimeraz II tarafından transkripsiyonun sonlandırılmasının analizi için temel bir deneysel yaklaşımı açıklıyoruz. Bu protokol, hem mayada hem de daha yüksek ökaryotlarda diğer RNA polimerazlar tarafından transkripsiyon sonlandırmasını incelemek için genişletilebilir.
Bu prosedürün genel amacı, RNA polimeraz tarafından tomurcuklanan mayaya transkripsiyonun sonlandırılmasını in vivo koşullar altında, ipliğe özgü transkripsiyon yaklaşımı ile incelemektir. Bu yöntem, genin üç ana ucunun ötesinde tespit edilen transkripsiyonel olarak aktif polimerazın, promotör bölgeden başlatılan polimer olup olmadığı sorusunu yanıtlamaya yardımcı olur. Bu yöntemin ana avantajı, bir MRNA transkripsiyon polimerazı, transkripsiyonları başlatan ve genin üç ana ucunda olacak olan yaygın olarak transkribe eden bir polimerazdan ayırt edebilmesidir.
Bu teknik, farklı polimerazlar tarafından sonlandırmanın koruyucu doğası nedeniyle diğer RNA polimerazlar ve maya tarafından transkripsiyonun sonlandırılmasını incelemek için genişletilebilir. Bu yöntem, maya transkripsiyon döngüsündeki sonlandırma faktörlerinin kesin rolü hakkında fikir verebilse de, daha yüksek ökaryotlarda sonlandırmayı incelemek için de genişletilebilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, dikkatli bir uygulama gerektirdiğinden, hücre geçirgenliği ve duraklarda çalıştırılan transkripsiyon ile mücadele edeceklerdir ve yeni ortaya çıkan transkriptlerin saflaştırılması da zor olabilir.
Bu yöntem için ilk olarak, transkripsiyonel olarak aktif polimerazların konumunun ipliğe özgü bir şekilde genom çapında bir anlık görüntüsünü veren GRO arama yaklaşımından elde ettik. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü yeni ortaya çıkan transkriptlerin düşük miktarı ve kararsız doğası nedeniyle transkripsiyon çalışması ve RNA saflaştırmasının gerçekleştirilmesi zordur. Transkripsiyona başlamadan önce, geçirgen bir hücre paleti elde etmek için reaksiyon üzerinde çalıştırın, büyütün, hasat edin ve katlanarak büyüyen maya hücrelerini geçirgen hale getirin.
Reaksiyonu başlatmak için, geçirgen hücre paletine tampon üzerinde çalıştırılan 150 mikrolitre transkripsiyon ekleyin. Kesik bir P-200 ucu kullanarak, yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın. Numuneyi buzun üzerine yerleştirin.
Tüm numuneler tampon üzerinde çalıştırılan transkripsiyonda yeniden askıya alındıktan sonra, numuneleri bir su banyosunda 30 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Her numuneye 500 mikrolitre soğuk kullanıma hazır RNA izolasyon reaktifi ekleyerek reaksiyonu durdurun. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.
RNA ekstraksiyon prosedürüne, her hücre süspansiyonuna 200 mikrolitre asitle yıkanmış cam boncuk ekleyerek ve dört santigrat derecede 20 dakika boyunca bir girdap karıştırıcıda kuvvetlice çalkalayarak başlayın. 20 dakika sonra, her bir mikrosantrifüj tüpünün altını delmek için sıcak 22 gauge iğne kullanın ve tüpü 15 mililitrelik steril konik bir tüpün üstüne yerleştirin. Dört santigrat derecede bir dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin ve hücre lizatını 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Hücre lizatına 500 mikrolitre soğuk RNA izolasyon reaktifi ve 200 mikrolitre kloroform ekleyin. İçeriği vorteks karıştırıcıda karıştırın ve ardından dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 16, 168 kez G'de santrifüjleyin. Üst sulu fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Eşit hacimde soğuk fenol kloroform izoamil alkol ekleyin. Vorteks karıştırıcı üzerinde kuvvetlice çalkalayın ve ardından dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 16, 168 kez G'de santrifüjleyin. RNA içeren üst sulu fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Eşit hacimde soğuk fenol kloroform izoamil alkol ekleyin, girdap yapın ve tekrar santrifüjleyin. Sulu faz içeren son RNA'ya, 0.3 molar'lık bir nihai konsantrasyon elde etmek için uygun bir hacimde beş molar sodyum klorür stoğu ekleyin. RNA'yı çökeltmek için hacminin üç katı soğuk etanol ekleyin.
20 santigrat derecede bir saat veya gece boyunca inkübe edin. RNA çökeltmesi tamamlandığında, dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 16, 168 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve RNA paletini 100 mikrolitre DEPC suyunda yeniden süspanse edin.
RNA'yı dahil edilmemiş bromouridin trifosfat nükleotidlerinden ayırmak için bir RNA izolasyon kiti kullanın ve RNA'yı 100 mikrolitre RNAz içermeyen su ile kolondan elüte edin. RNA'yı 65 santigrat derece su banyosunda beş dakika inkübe edin. Ve sonra en az iki dakika buza aktarın.
RNA çökeltilirken anti bromo DU boncuklarını hazırlayarak bu işleme başlayın. Her numune için, 25 mikrolitre çökelmiş boncuklara 500 mikrolitre 0.25 X sodyum salin fosfat EDTA bağlayıcı tampon ekleyin. Dört santigrat derecede 30 saniye boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
Boncukları bağlama tamponu ile üç kez yıkayın. Süpernatanı üçüncü yıkamadan çıkardıktan sonra, boncuklara 500 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin ve bir platform çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede bir ila iki saat hafifçe çalkalayın. Boncukları 500 mikrolitre bağlayıcı tampon ile iki kez daha yıkayın.
Süpernatanı ikinci yıkamadan çıkarın ve boncuklara 400 mikrolitre bağlayıcı tampon ekleyin. 100 mikrolitre RNA'yı doğrudan boncuklara aktarın. Bir platform çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede bir ila iki saat hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
Dört santigrat derecede 30 saniye boyunca 200 kez G'de döndürün ve ardından süpernatanı çıkarın. Ardından, boncuklara 500 mikrolitre bağlayıcı tampon ekleyin. Dört santigrat derecede 30 saniye boyunca 200 kez G'de döndürün ve süpernatanı çıkarın.
Bu şekilde, boncukları sırayla bağlama tamponu, düşük tuz tamponu, yüksek tuz tamponu ve iki kez TET tamponu ile yıkayın. Boncuklardan bromuridin trifosfat etiketli RNA'yı çıkarmak için 150 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve bir su banyosunda 42 santigrat derecede dört dakika inkübe edin. Kısa bir süre aşağı dönün ve süpernatanı toplayın.
Bu şekilde, 150 mikrolitre ile iki kez ve 200 mikrolitre elüsyon tamponu ile bir kez sırayla elüte edin. Her numuneden yaklaşık 500 mikrolitre afinite saflaştırılmış bromouridin trifosfat etiketli RNA elde edilmelidir. RNA etiketli afiniteye saflaştırılmış bromouridin trifosfatı çökeltmek için, her numuneye 500 mikrolitre soğuk fenol kloroform izoamil alkol ekleyin.
Dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 16, 168 kez G'de girdap ve santrifüjleyin. Üst sulu fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 0.3 molar'lık bir nihai konsantrasyon elde etmek için beş molar sodyum klorür stoğunun uygun hacmini ekleyin.
Sonra hacminin üç katı soğuk etanol ekleyin. RNA'yı çökeltmek için gece boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, çökeltilmiş RNA'yı dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 16, 168 kez G'de santrifüjleme ile toplayın.
Süpernatanı çıkarın ve paletin 10 dakika kurumasını bekleyin. RNA paletini 26 mikrolitre DEPC suyunda yeniden süspanse edin. Bir spektrofotometre kullanarak 260 nanometrede absorbansı ölçerek nihai RNA konsantrasyonunu belirleyin.
RNA örneklerini ve alikotları, cDNA sentezi için gerekli olana kadar 80 santigrat derecede saklayın. Tomurcuklanan mayada ASC1 geninin transkripsiyonunun sonlandırılması için RNA 14'ün gerekliliğini test etmek için yaklaşımda çalıştırılan bromouridin trifosfat zincirine özgü transkripsiyon kullanıldı. RNA 14-1 mutantından ve izojenik vahşi tip hücrelerinden bromoreidin trifosfat etiketli RNA saflaştırıldı ve C, D, E, F ve G primerleri ile ters kopyalandı.
Mutantta B ve E, B ve F ve B ve G primer çiftlerinden PCR amplifiye edilmiş ürünlerin varlığı, bir sonlandırma okuma fenotipini yansıtır. Bununla birlikte, vahşi tip hücrelerde, sinyal üzerinde çalışan transkripsiyon, sonlandırıcı elemana kadar sınırlıydı ve sonlandırıcı bölgenin ötesinde sinyal üzerinde algılanabilir bir transkripsiyon çalıştırılmadı. Bu grafik, normalizasyon kontrolü olarak beş S RNA ile jellerin miktar tayinini göstermektedir.
Mutantta sonlandırma sinyalini okuyan, ancak vahşi tip hücrelerde okumayan, promotör tarafından başlatılan yeni ortaya çıkan transkriptlerin tespiti, RNA 14'ün bir sonlandırma faktörü olduğunu doğrular. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik üç gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, reaksiyon üzerinde çalıştırılan transkripsiyonun başarılı bir sonuç elde etmek için kritik olduğunu hatırlamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, bir faktörün genom çapında sonlandırmadaki rolü gibi ek soruları yanıtlamak için GRO araması gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, transkripsiyon alanındaki araştırmacıların, maya ve daha yüksek ökaryotik sistemlerdeki diğer RNA polimerazlar tarafından sonlandırılmayı keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, transkripsiyonun nasıl gerçekleştirileceğini, reaksiyonlar üzerinde nasıl çalıştırılacağını ve yeni ortaya çıkan etiketli transkriptlerin nasıl saflaştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.
RNA'nın son derece kararsız olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven giymek, sıcaklığı dört santigrat derece civarında tutmak ve RNAse içermeyen ajanlar kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, BrUTP ve çiçeklenen mayada zincir özgü transkripsiyon devam eden (TRO) yaklaşımını kullanarak RNA polimeraz II tarafından yapılan transkripsiyonun sonlandırılmasını in vivo analiz etmek için bir yöntemi açıklamaktadır. Protokol ayrıca maya ve daha yüksek ökaryotlarda diğer RNA polimerazlarının transkripsiyon sonlandırmasını incelemek için de uyarlanabilir.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Transkripsiyonel düzenleme
- RNA polimeraz aktivitesi
- Maya moleküler biyolojisi
Arka Plan
- Transkripsiyon sonlandırma, gen ekspresyonunda kritik bir süreçtir.
- Zincir özgü transkripsiyon devam eden yaklaşım, transkripsiyon dinamiklerinin analizini sağlar.
- Bu yöntem çeşitli RNA polimeraz türlerini ayırt edebilir.
- Transkripsiyon faktörlerini anlamak, mayada transkripsiyon döngüsünü açıklamak için esastır.
Çalışmanın Amacı
- RNA polimeraz II tarafından yapılan transkripsiyonun sonlandırılmasını in vivo incelemek.
- Transkripsiyonel olarak aktif polimerazların promotör bölgesinden başlayıp başlamadığını belirlemek.
- Bulguların farklı organizmalardaki diğer RNA polimerazlarına uyarlanması.
Kullanılan Yöntemler
- Zincir özgü transkripsiyon devam eden (TRO) yaklaşımı.
- Yeni oluşan RNA transkriptlerini etiketlemek için BrUTP kullanımı.
- Etkili transkripsiyon analizi için hücre geçirgenlik teknikleri.
- Yeni oluşan transkriptlerin saflaştırma yöntemleri.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, mRNA transkripsiyonu yapan polimerazları ve yaygın olarak transkripsiyon yapan polimerazları başarılı bir şekilde ayırt eder.
- Transkripsiyon döngüsünde sonlandırma faktörlerinin rolü hakkında bilgiler elde edildi.
- Yaklaşım, daha yüksek ökaryotlarda kullanılmak üzere uyarlanabilir.
- Yeni kullanıcılar için hücre geçirgenliği gibi uygulamadaki zorluklar belirlendi.
Sonuçlar
- Zincir özgü TRO yaklaşımı, transkripsiyon sonlandırmasını incelemek için etkilidir.
- Transkripsiyon sonlandırmayı anlamak, gen düzenlemesi hakkında bilgiler sağlayabilir.
- Bu yöntemin farklı türlerde geniş uygulamaları vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables precise detection of transcription termination defects in vivo, addressing a key challenge in target validation where distinguishing true promoter-initiated readthrough from pervasive transcription is essential for mechanistic de-risking. By providing strand-specific, quantitative readouts of polymerase activity beyond terminator regions, it supports predictive confidence in early discovery stages focused on RNA polymerase II and termination factor biology. The approach offers translational continuity from yeast models to higher eukaryotes, facilitating cross-species target validation and preclinical pathway analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by determining whether observed transcription readthrough stems from promoter-initiated polymerase activity rather than non-specific initiation.
- Operational Value: Enables functional validation of termination factors as drug targets by isolating their specific role in the transcription cycle.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing mechanistic evidence that reduces ambiguity in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces strand-specific nascent RNA signals that serve as quantitative readouts for screening compounds or genetic perturbations affecting termination.
- Operational Value: Generates reproducible, affinity-purified BrUTP-labeled RNA suitable for downstream qPCR or sequencing applications in assay development pipelines.
- Scalability: The protocol’s reliance on standardized permeabilization and purification steps enables adaptation to multi-well formats for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects termination mechanism studies in yeast to conserved pathways in higher eukaryotes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by validating target function across model systems before moving to mammalian validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes are due to specific termination factor loss versus pervasive transcriptional noise, improving target confidence.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification, particularly when termination mechanisms are under investigation, and supports handoff to preclinical teams via standardized, quantifiable outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by distinguishing promoter-driven transcription from background noise, aiding in pathway clarification and target de-risking.
- Screening: Delivers assay-ready, strand-specific nascent RNA that enables reliable comparison of genetic or pharmacological conditions affecting termination efficiency.
- Analytics: Provides amplifiable cDNA from purified BrUTP-labeled RNA, enabling quantitative PCR or sequencing readouts that help teams compare termination proficiency across conditions.
- Translational Research: Connects yeast-based termination findings to higher eukaryotes through conserved polymerase mechanisms, supporting preclinical continuity only when cross-species conservation is demonstrated.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for termination analysis that can be applied across multiple targets and projects within nucleic acid-targeted discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in transcription termination studies through strand-specific discrimination.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via defined permeabilization, labeling, and purification steps that minimize user-dependent variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering target-specific mechanistic data, reducing late-stage biological risk in RNA-focused therapeutic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of termination factor targets based on validated, quantitative evidence of functional relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular biology, RNA handling, and nucleic acid purification techniques to manage unstable nascent transcripts.
- Dependent on access to BrUTP, RNA isolation reagents, phenol-chloroform workflows, and specialized beads for affinity purification of bromouridine-labeled RNA.
- Necessitates cross-team standardization between discovery biology and analytics groups to ensure consistent RNA yield, labeling efficiency, and cDNA synthesis quality.
- Adaptation to mammalian or higher eukaryotic systems may require optimization of permeabilization conditions and validation of BrUTP incorporation efficiency.
- Practical limitations include low yield of nascent transcripts and technical difficulty in RNA purification, which may affect scalability for high-throughput applications without automation support.
