Name: SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Öğrenin, SPHIRE yazılımı ile kriyojenik elektron mikroskobu görüntülerinden tek parçacık analizi yaparak makromoleküler komplekslerin yüksek çözünürlüklü yapılarını belirleme yöntemini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bize TcdA1 mikrografları sağladığı için D. Roderer&#39;a teşekkür ediyoruz. Steven Ludtke&#39;ye EMAN2 altyapısının devam eden desteği için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Max Planck Topluluğu&#39;ndan (SR&#39;ye) ve Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7 / 2007-2013) (615984 no&#39;lu hibeye kadar) Avrupa Konseyi&#39;ne (SR&#39;ye) ve Ulusal Enstitülerden Sağlık R01 GM60635 ila PAP).

<ol><li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li>
<li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li>
<li>Bai, X. -C., Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atomic+structure+of+human+%CE%B3-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atomic structure of human γ-secretase.</a> Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).</li>
<li>Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+a+human+cytoplasmic+actomyosin+complex+at+near-atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution.</a> Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).</li>
<li>von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+F-actin-tropomyosin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the F-actin-tropomyosin complex.</a> Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).</li>
<li>Tang, G., Peng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li>
<li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FREALIGN%3A+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li>
<li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Shaikh, T. R., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li>
<li>Hohn, M., Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPARX%2C+a+new+environment+for+Cryo-EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).</li>
<li>Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appion%3A+an+integrated%2C+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li>
<li>de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scipion%3A+A+software+framework+toward+integration%2C+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li>
<li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+%C3%85+reconstruction+of+rotavirus+VP6%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980(2015).</li>
<li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera%3FA+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTER-rapid+estimation+of+CTF+parameters+with+error+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment.</a> Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrank%2C+J+%22Three-Dimensional+Electron+Microscopy+of+Macromolecular+Assemblies%22">Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies</a>. , Oxford University Press. (2006).</li>
<li>Woolford, D., Ericksson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SwarmPS%3A+rapid%2C+semi-automated+single+particle+selection+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).</li>
<li>Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+Stable+Alignment+and+Clustering+of+2D+Transmission+Electron+Microscope+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%2FFolding+and+Design%22%5BJournal%5D)">Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images.</a> Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).</li>
<li>Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+insertion+of+a+Tc+toxin+in+near-atomic+detail%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail.</a> Nature Publishing Group. , (2016).</li>
<li>Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+syringe-like+injection+mechanism+in+Photorhabdus+luminescens+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins.</a> Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).</li>
<li>Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Tc+toxin+action+revealed+in+molecular+detail%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail.</a> Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).</li>
<li>Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+focused+classification%2C+based+on+the+bootstrap+3D+variance+analysis%2C+and+its+application+to+EF-G-dependent+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation.</a> Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).</li>
<li>Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+revolution+will+not+be+crystallized%3A+a+new+method+sweeps+through+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology.</a> Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Tek parçacıklı cryo-EM, son yıllarda hızlı bir gelişme göstermiş ve büyük biyolojik önemi olan makromoleküler komplekslerin sayısız atomik çözünürlük yapıları üretmiştir25. Şu anda sahaya giren çok sayıda acemi kullanıcısını desteklemek için tek parçacıklı görüntü analiz platformu SPHIRE&#39;yi geliştirdik ve burada film hizalama, parçacık toplama, CTF tahmini, başlangıç ​​modeli dahil olmak üzere tüm iş akışları için bir walk-through protokolü sunduk Hesaplama, 2D ve 3D heterojenite analizi, yüksek çözünürlüklü 3D iyileştirme ve yerel çözünürlük tahmini ve filtreleme. Burada açıklanan protokol, ilgilenilen proteinin cryo-EM mikrograflarını kullanarak ve SPHIRE&#39;nin tek başına GUI tarafından sağlanan hesaplama araçlarının yardımıyla, 3B yapı tayini için kısa bir rehber olarak tasarlanmıştır. İş akışının en önemli özelliği,Prosedürlerin tekrarlanabilirlik 19 ile geçerlilik kavramına dayandığı ve parametre ayarlamasına ihtiyaç duymadığı için yalnızca bir kez çalıştırılması gerekir. Bu otomatik validasyon mekanizması, SPHERE&#39;nin diğer yazılım paketlerine kıyasla önemli bir avantajıdır; çünkü sonuçlar, nesnel olabilmeleri ve çoğaltılabilir olmaları ve daha da önemlisi, kabul edilebilir bir hesaplama maliyetiyle elde edilebilir olma eğilimindedirler. Boru hattı ayrıca deneyimli kullanıcılar için kendi yöntemleriyle bağımsız bağımsız doğrulama ve değerlendirme yapmak için zengin bir teşhis bilgisi sağlar. Yine de, yapısal biyoloji ve elektron mikroskobunda en azından temel teorik altyapıya sahip olan bir acemi kullanıcı, kendi verileri ve otomatik validasyon prosedürleri kullanarak atom-altı çözünürlük yapıları elde edebilmelidir. Bununla birlikte, atom-altı bir çözünürlük yapısının elde edilmesi her zaman açık değildir ve sonuç, numunenin kalitesine ve giriş verilerine bağlıdıra. Burada sunulan prosedürler için, yeterli sayıda homojen ve rastgele yönlendirilmiş tek parçacıklar gösteren ortalama yüksek kaliteli, hizalanmamış ham EM filmleri bulunduğunu varsaymaktadır. Genel olarak, simetri, boyut veya molekülün genel şekli ile ilgili herhangi bir kısıtlama yoktur, ancak düşük moleküler ağırlık, özellikle protein şekilsiz küresel şekle sahip olduğunda, sınırlayıcı bir faktör olabilir. Genellikle, yüksek nokta grubu simetrisi ile daha büyük, iyi düzenlenmiş parçacıkların analizi daha az talep gerektirir. Bu nedenle acemi kullanıcıların mevcut protokolü önce iyi karakterize edilmiş bir cryo-EM veri setiyle çalıştırmaları kesinlikle önerilir. Ya SPHIRE öğretici veriler (http: /sphire.mpg.de) veya ham filmlerle EMPIAR tarafından sunulan veri kümelerinden (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) biri iyi bir başlangıç ​​noktasıdır . Kendi verilerinizi işlerken, bazı veri kümelerinin veya bazı resimlerin bazı quali&#39;yi karşılamayacağı muhtemeldirKriterleri. Bu bağlamda, iş akışının büyük adımları için program tarafından gerçekleştirilen otomatik kararlılık ve tekrarlanabilirlik kontrollerine ek olarak, kullanıcıların protokolün belirli &quot;kontrol noktalarında&quot; sonuçlarını görsel olarak incelemesi önerilir, özellikle de son yeniden yapılanma Tatmin edici değil. İlk görsel muayene, film hizalamasından ( Protokol adımı 2 ) ve CTF tahmini sonrasında ( protokol adım 3 ) mikrograf düzleminde yapılabilir. Ortaya çıkan hareket düzeltilmiş ortalamalar açıkça ayırt edilebilir ve iyi ayrılmış tek parçacıklar göstermeli ve güç tayfları açıkça görülebilir, izotropik Thon halkaları göstermelidir. Görünür oldukları mekansal frekans, çoğu durumda, yapının ilke olarak nihai olarak belirleyebileceği en yüksek çözünürlüğü tanımlar. Hareket düzeltilmiş yeterli kalitede ve güç tayfı ortalamasına örnekler,34; Temsilcilik Sonuçları &quot;Son sonuca olumsuz etkisi olabilecek outlier görüntüler, SPHIRE&#39;nin Drift ve CTF değerlendirme GUI araçlarıyla (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php) kaldırılabilir. Parçacık taramasıyla ilgili olarak, SPHIRE boru hattındaki önemli adım, ISAC&#39;yi kullanarak 2D sınıflandırmadır ( Protokol Adımı 5.2) . Burada, kullanıcı, program tarafından otomatik olarak tanımlanan yeniden üretilebilir 2D sınıf ortalamalarının, açısal alanı tamamen eşit şekilde örtmek için yeterli bir oryantasyon aralığını benimsemesini kontrol etmelidir. Sınıf ortalamaları kalitesi tatmin edici değilse (gürültülü ve / veya bulanık görüntüler) ve / veya tekrarlanabilir sınıf ortalamaları çok düşükse, otomatik toplama kalitesini iyileştirmeyi, veri kümesi görüntülemeyi veya örnek hazırlamayı optimize etmeyi düşünün. Çoğu durumda, iyi bir 2D sınıf ortalamaları sağlamayan bir veri kümesinden güvenilir bir yeniden yapılandırma hesaplamak mümkün değildir. Yüksek kaliteli 2D sınıf ave örnekleri&quot;Temsilci Sonuçlar&quot; bölümünde gösterilmektedir. RVIPER kullanarak otomatik bir şekilde güvenilir bir başlangıç ​​3D modeli elde etmek için en az 100 sınıf ortalaması gereklidir ( Protokol Adımı 6.1 ). Bu adım için, kullanıcı en yüksek kalitede ortalamaları seçmeli ve parçacığın mümkün olduğunca çok yönünü içermelidir. İlk modelin kalitesi, sonraki yüksek çözünürlüklü 3D iyileştirmenin başarısı için kritik önem taşıyor. Diğer yazılım paketlerinde, &quot;kötü&quot; parçacıkları 8 , 9 kaldırmak için bazen 3D sınıflandırma yapılır. Bununla birlikte, SPHIRE&#39;de bu parçacıkların çoğu, ISAC kullanılarak 2D sınıflandırma sırasında otomatik olarak elimine edilir. Bu nedenle, 3D sıralama işleminin yoğun bir adımını gerçekleştirmek için yeniden yapılandırma ve 3D değişkenlik analizi, veri kümesinin heterojenliğini gösteriyorsa önerilir. En önemlisi, kullanıcı her zaman ortaya çıkan 3B birimlerini dikkatli bir şekilde dikkatlice kontrol etmeli ( Protokol adımı 9.3 ) ve ilgili yoğunluğun özelliklerinin nominal çözünürlük ile iyi uyduğunu onaylamalıdır. &lt;9Å çözünürlüğünde, α-helislere karşılık gelen çubuk benzeri yoğunluklar görülebilir hale gelir. &lt;4.5 Å çözünürlükte, β-tabakalarındaki ipliklere karşılık gelen yoğunluklar normalde iyi ayrılır ve hacimli amino asitler görünür hale gelir. Yüksek çözünürlüklü bir harita (&lt;3 Å) açıkça görülebilir yan zincirler göstermeli ve böylece doğru bir atom modelinin oluşturulmasına izin verilmelidir. Bugüne kadar elde edilen sonuçlar, SPHERE&#39;nin otomatik tekrarlanabilirlik testleri ve minimal görsel incelemelerin yardımıyla, mevcut protokolün her türden tek parçacıklı cryo-EM projesine uygulanabileceğini göstermektedir. Her işleme adımının temsili sonuçları, TcdA1 toksininin yeniden yapılandırılması için gösterilir.Photorhabdus luminescens 21 , atomik çözünürlük yakınında çözülmüştür. Benzer nitelikteki yoğunluk haritaları, de novo omurga izlemenin yanı sıra karşılıklı veya gerçek uzay arıtma yöntemiyle güvenilir atom modelleri oluşturmak ve böylece karmaşık moleküler mekanizmaların anlaşılması için sağlam bir yapısal çerçeve sağlamak için kullanılabilir. ACCESION KODLARI: EM yapısının ve işlenmemiş filmlerin koordinatları sırasıyla EMD-3645 ve EMPIAR-10089 erişim numaraları altında Elektron Mikroskopisi Veri Bankası&#39;na ve Elektron Mikroskopisi Pilot Görüntü Arşivi&#39;ne yatırıldı.

Doğrudan elektron dedektörü teknolojisinin gelişmesinden sonra, tek parçacık kriyo-EM&#39;deki dikkate değer ilerleme şu anda yapısal biyolojiyi yeniden şekillendirmektedir 1 . X-ışını kristalografisi ile karşılaştırıldığında, bu teknik, kristalizasyona gerek duymadan az miktarda protein materyali gerektirirken, aynı zamanda numunenin saflığı konusunda daha az kısıtlama getirmekte ve yine atomik çözünürlük yakınında yapıların belirlenmesine izin vermektedir. Önemlisi, şimdi farklı kompozisyonlar veya durumlar hesaplanabilir bir şekilde ayrılabilir ve farklı konformasyonların yapı belirlenmesi eşi benzeri görülmemiş detay seviyesinde yapılabilir. Son zamanlarda, zorlayıcı moleküllerin yoğunluk haritaları, de novo model yapımına izin veren çözünürlüklerde üretilebilir ve bu nedenle bunların hareket tarzlarının derin bir şekilde anlaşılması 2 , 3 , 4 , 5. 3DEM (3D Elektron Mikroskopisi) topluluğunda (https://tr.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) çok çeşitli görüntü işleme yazılım paketleri mevcuttur ve bunların çoğu sürekli geliştirilmektedir. EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 ve SPARX 11 gibi çeşitli yazılım paketleri ile çeşitli molekül ağırlığı ve simetrileri sergileyen proteinler için yaklaşık atom özünürlüğü elde edilmiştir. Her pakette kullanıcı uzmanlığının farklı bir seviyesi gerekiyor ve farklı düzeylerde kullanıcı kılavuzu, otomasyon ve genişletilebilirlik sağlıyor. Ayrıca, bazı programlar görüntü analizinin tüm adımlarını kolaylaştırmak için eksiksiz ortamlar sağlarken, bazıları bilinen r&#39;den başlayarak hizalama parametrelerinin arıtılması gibi belirli görevleri optimize etmek üzere tasarlanmıştır.Eferans yapısı. Daha yakın tarihte, yukarıda listelenen farklı yazılım paketlerinden gelen yaklaşımları ve protokolleri birleştiren tek bir işleme hattı sağlayan APPION 12 ve SCIPION 13 dahil olmak üzere çeşitli platformlar geliştirildi. Mevcut cryo-EM gelişimine katkıda bulunmak için SPARX, SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) adı verilen tek parçacık analizi için yeni ve bağımsız bir platform haline getirildi. Teknolojinin bu alandaki yeni araştırmacılar için erişilebilirliğini arttırmak ve modern tümüyle otomatikleştirilmiş üst düzey elektron mikroskopları tarafından üretilen büyük miktardaki verilere uyum sağlamak için, işleme hattı, kullanımı kolay bir tanıtılarak yeniden tasarlandı ve basitleştirildi Grafik Kullanıcı Arayüzü (GUI) ve iş akışının ana adımlarını otomatikleştirmek. Ayrıca, cr&#39;den hızlı, tekrarlanabilir ve otomatik yapının belirlenmesine izin vermek için yeni algoritmalar eklenmiştir.Yo-EM görüntüleri. Ayrıca, arıtılma ve heterojenite analizi sırasında üretilen ortak eserlerden kaçınmak için tekrarlanabilirlik ile geçerlilik kazandırılmıştır. Program kapsamlı bir şekilde değiştirilmesine rağmen, takdir edilen çekirdek özellikleri korunmuştur: basit açık kaynak kod, modern nesne yönelimli tasarım ve tüm temel fonksiyonlar için Python arayüzleri. Böylece, kullanıcıların Python kodunu inceleyip kolayca değiştirebilmelerini, ek uygulamalar yaratmalarını veya genel iş akışını değiştirmelerini sağlayan bir kara kutu programı olarak değiştirilmedi. Bu, standart olmayan cryo-EM projeleri için özellikle yararlıdır. Burada, SPHIRE&#39;nin GUI&#39;sini kullanarak cryo-EM görüntülerinden atom-altı bir çözünürlük yoğunluğu haritası elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Çiğ cryo-EM direkt dedektör filmlerinden yoğunluk haritası oluşturmak için gereken tüm aşamaları ayrıntılı olarak açıklar ve herhangi bir makromolekül tipi ile sınırlı değildir. Bu protokol esas olarak newc&#39;yiIş akışıyla sahaya çıkıyor ve işlemenin önemli adımlarının yanı sıra olası tuzaklar ve engeller hakkında önemli bilgiler sağlıyor. Daha gelişmiş özellikler ve SPHIRE&#39;nin arkasındaki teorik arka plan başka yerlerde açıklanacaktır.

<table><tbody><tr><td>SPHIRE</td><td>Max Planck Moleküler Fizyoloji Enstitüsü - Dortmund ve Houston Tıp Okulu, Houston, Teksas;</td><td></td><td>http://sphire.mpg.de</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>California Üniversitesi, San Francisco</td><td></td><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td></tr> <tr><td>Unblur</td><td>Janelia Çiftliği Araştırma Kampüsü, Ashburn</td><td></td><td>http://grigoriefflab.janelia.org/unblur</td></tr><tr><td>Coot</td><td>MRC Moleküler Biyoloji Laboratuvarı,&nbsp; Cambridge</td><td></td><td>http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td></tr> <tr><td>EMAN2</td><td>Baylor Tıp Fakültesi, Houston</td><td></td><td>http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td></tr><tr><td>1824 çekirdekli Bilgi İşlem Kümesi</td><td>Max Planck Moleküler Fizyoloji</td><td></td> Enstitüsü <td>76&nbsp; düğümlü Linux Kümesi, her biri 2 İşlemcili Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz ve 128 Gb RAM</td></tr><tr><td>TITAN KRIOS elektron mikroskobu&nbsp;</td><td>FEI</td><td></td><td>300 kV, Cs düzeltme, XFEG</td></tr><tr><td>Falcon II direkt elektron dedektörü</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPU (otomatik veri toplama yazılımı)</td><td>FEI</td><td></td><td>https://www.fei.com/software/epu/</td></tr></tbody></table>

sphire kullanılarak elektron kriyo-mikroskopi görüntülerinden yüksek Çözünürlüklü tek parçacık analizi

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE (Yüksek Çözünürlüklü Elektron Mikroskopisi için SPARX), tek parçacıklı elektron cryo-mikroskopi (cryo-EM) verilerinin yarı otomatik olarak işlenmesi için yeni ve açık kaynaklı, kullanıcı dostu bir yazılım paketidir. Burada sunulan protokol, kullanıcıları tek parçacıklı yapı tayini boru hattının tüm adımları boyunca yönlendirerek, cryo-EM mikrograf filmlerinden başlayarak atom-altı bir çözünürlük yapısının nasıl elde edilebileceğini ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu adımlar, yeni SPHIRE grafik kullanıcı arayüzünden kontrol edilir ve minimum kullanıcı müdahalesi gerektirir. Bu protokolü kullanarak, Photorhabdus luminescens&#39;den bir Tc toksin kompleksi olan 3.5Å yapıdaki TcdA1 , yalnızca 9500 tek parçacıktan türetilmiştir. Bu aerodinamik yaklaşım, acil makromoleküler komplekslerinin doğal hallerinde gürültülü ve tarafsız atomik modeller elde etmeleri için, kapsamlı bir işleme deneyimi olmayan acemi kullanıcılara ve önceden yapılmış bir yapısal bilgiye yardımcı olacaktır.

<html> Yukarıda açıklanan protokol, Photorhabdus luminescens Tc kompleksinin (TcdA1) 20 , 21 , 22 A bileşeninin 112 direkt dedektör filminden başlayarak gerçekleştirildi . Bu veri seti, 300 kV&#39;lik bir ivme voltajında ​​çalıştırılan, parlaklık dereceli bir alan emisyon tabancasına (XFEG) sahip bir Cs-düzeltilmiş elektron kriyo-mikroskopta kaydedildi. Görüntüler, numune ölçeğinde 1,14 Å&#39;luk bir piksel boyutunda otomatik olarak toplam 60 e - / Â -2 dozuyla edinildi. Film çerçevelerinin hizalanmasından sonra ( Protokol Adım 2 ), elde edilen hareket düzeltilmiş ortalamalara yüksek çözünürlüklü izotropik Thon halkaları vardı ( Şekil 2a ). Bireysel parçacıklar kolayca görülebilir ve iyi ayrılmıştır ( Şekil 2b ). Parçacıklar daha sonra e2boxer&#39;ın toplayıcı aracı kullanılarak toplandıLass = &quot;xref&quot;&gt; 18 ( Protokol Adım 4.1 ). Bu durumda, daha seçici seçeneği kullanarak uygun bir eşik ayarlandı ( Şekil 2c ). 112 sayısal mikrografından 9,652 parçacık elde edildi. Çıkarılan görüntülerin çoğunluğu ( Protokol Adımı 4.2 ) iyi tanımlanmış parçacıklar içeriyordu ve kutu boyutu, önerilen şekilde partikül boyutunun ~ 1.5 kat daha büyüktü ( Şekil 2d ). Daha sonra, ISAC kullanarak, 2D heterojenite analizi yapıldı ( Protokol Adım 5 ). 98 sınıf ortalamasına ulaştı ( Şekil 3a ). Bu 2D sınıf ortalamalarını kullanarak, orta çözünürlükte VIPER ( Protokol Adımı 6 ) kullanılarak bir ab initio modeli hesaplandı ( Şekil 3b ). Bu model 3.9 Å çözünürlük 22 ( Şekil 3c ) daha önce çözülmüş TcdA1 kristal yapısı ile mükemmel bir uyum göstermektedir. Bu ab initio modeli ilk tem olarak kullanılmıştır<html> Sadece 40.000 asimetrik birimden 3,5 A (0.143 kriter) yeniden yapılandırma ( Protokol Adımı 7 ) veren 3 boyutlu iyileştirme için (MERIDIEN) plakadır ( Şekil 4 ). Bu atom altı çözünürlük haritası, çoklu çekirdekten yararlanan iş akışının basamakları için 96 CPU&#39;yu kullanarak 24 saat içinde elde edildi. 3B değişkenlik analizi için (Protokol adımı 8), adım 8.3.3&#39;te ( yani başlangıçta 5 başlangıç ​​3D grupla başlar ) grup başına yalnızca 2.000 parçacık görüntüsü kullanılmış ve adım 8.3.4&#39;teki en küçük grup boyutu için 200 görüntü elde edilmiştir. Az sayıda parçacık (~ 10.000). Analiz esas olarak, saflaştırmada kullanılan His etiketini içeren kompleksin N-terminal bölgesinde lokalize esneklik ortaya koydu ( Şekil 5a ). Aslında, oniki N-terminal kalıntısı ve His etiketi, daha önce yayınlanan TcdA1 kristal yapısında çözülmedi&quot;22 ve bu muhtemelen düzensiz bölge muhtemelen esnekliği nedeniyle mevcut kriyo-EM yoğunluğunda çözülemedi ve reseptör bağlama alanlarında ve BC-bağlama alanlarında ilave değişkenlik tespit edildi ( Şekil 5a ). Yapının tatmin edici çözünürlüğü ve veri kümesinin oldukça küçük boyutu ile bu heterojenliğin tolere edilebilir olduğu kararlaştırıldı ve bu nedenle odaklanmış bir 3D sınıflandırma 23 gerçekleştirilmedi Son olarak, nihai yoğunluk haritasının yerel çözünürlüğü hesaplandı ( Protokol adımı 9.1, Şekil 5b ) ve keskinleştirilmiş 3D harita yerel olarak filtrelendi ( Protokol adımı 9.2) . Bu kalitede bir kalite, Coot 24 veya başka bir arıtma aracı kullanarak de novo model oluşturma için kullanılabilir ( Şekil 6 ). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig1.jpg" /> &lt;Strong&gt; Şekil 1: SPHIRE kullanan görüntü işleme. ( A ) SPHIRE yazılım paketinin GUI&#39;si. İş akışının belirli bir adımı, GUI&#39;nin solundaki ilgili piktogramı seçerek etkinleştirilebilir (&quot;iş akışı basamağı&quot;). İş akışının bu adımı ile ilişkili komutlar ve yardımcı programlar GUI&#39;nin merkezi alanında görünecektir. Komutlardan birini seçtikten sonra ilgili parametreler GUI&#39;nin sağında gösterilir. Gelişmiş parametreler genellikle varsayılan varsayılan değerlerin değiştirilmesini gerektirmez. ( B ) SPHIRE GUI&#39;yi kullanarak tek parçacık görüntü işlemenin iş akışındaki aşamalar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig2.jpg" /> Şekil 2: Hareket Düzeltmesi ve PartikülLe Çıkarma. ( A , b ) 1.7 μm&#39;lik bir odaksızlıkta kaydedilen, tipik, yüksek kalitede, düşük dozda, sürüklenerek düzeltilmiş dijital mikrograf. Güç tayfında (a) 2.7 A çözünürlüğüne uzanan izotropik Thon halkaları ve 2D görüntüde ( b ) görülebilen parçacıklara dikkat edin. ( C ) E2boks kullanarak tanecik seçimi. Yeşil daireler seçilen parçacıkları gösterir. ( D ) Doz ağırlıklı mikrografından çıkarılan tipik ham parçacıklar. Ölçek çubukları = 20 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig3.jpg" /> Şekil 3: 2D Kümeleme ve İlk Model Üretimi. ( A ) 2D sınıf ortalamalarının galerisi, çoğunluk, yan görüşleri temsil etmektedir o<html> Parçacık. Ölçek çubuğu = 20 nm. ( B ) Referanssız sınıf ortalamalarından RVIPER kullanılarak elde edilen TcdA1&#39;in Ab initio 3D haritası. ( C ) TcdA1 kristal yapısının (kurdele) (pdb-id 1VW1) ilk cryo-EM yoğunluğuna (şeffaf gri) rijit gövde uydurma. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig4.jpg" /> Şekil 4: TcdA1&#39;in Cryo-EM 3D Yapısı. ( A , b ) ~ 9,500 parçacık görüntüleri kullanılarak hesaplanan TcdA1&#39;in son 3.5 Â yoğunluk haritası: ( a ) yan ve ( b ) üstten görünüş. ( C ) Bir α-helezon ve bir β-tabakası için kriyo-EM yoğunluğunun temsili alanları.Arge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig5.jpg" /> Şekil 5: Değişkenlik Analizi ve Yerel Çözünürlük. ( A ) Bıçaklanmış TcdA1 cryo-EM haritasının (gri) yüzeyi ve değişkenlik haritası (yeşil). Daha iyi netlik için değişkenlik haritası, 30A&#39;ya düşük geçirimli filtrelendi. ( B ) TcdA1 bilenmiş cryo-EM haritasının yerel çözünürlüğüne (Å) göre renklendirilmesi. Değişkenliği yüksek alanlar ve düşük yerel çözünürlük arasındaki topolojik anlaşmayı not edin. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig6.jpg" /> Şekil 6: 3D ModCoot kullanarak TcdA1&#39;in el Yapımı. Cryo-EM yoğunluğunun temsil ettiği bölgeler ve atomik model, bir α-heliks için gösterilir. Atom modeli Coot&#39;u kullanarak yeni inşa edildi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Bu makale SPHIRE yazılım paketini kullanarak cryo-EM görüntüleri işlemek için bir protokol sunmaktadır. Mevcut protokol, neredeyse atomik çözünürlüğü hedefleyen hemen hemen tüm tek parçacılı EM projeleri için uygulanabilir.

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Bu prosedürün genel amacı, SPHIRE görüntü işleme yazılımını kullanarak elektron kriyo-mikroskobu verilerinin tek parçacık analizi ile makromoleküler komplekslerin yapısını belirlemektir. Tek parçacık kriyo-EM, makromolekül yapılarını atomik çözünürlüğe yakın seviyelerde incelemek için ana akım bir teknoloji haline gelmektedir. SPHIRE, kriyo-EM verilerinin kullanıcı dostu bir şekilde yarı otomatik olarak işlenmesini sağlayan yeni bir yazılım paketidir.SPHIRE'ın temel avantajı otomatik doğrulama mekanizmasıdır. Prosedürlerin çoğunun yalnızca bir kez çalıştırılması gerekir; sonuçlar objektif ve tekrarlanabilirdir. Yüksek çözünürlüklü kriyojenik elektron mikroskobisi (cryo-EM), bireysel kalıntıların konumlandırılması için kullanılabilir ve böylece karmaşık mikro moleküler makinelerin organizasyonu ve işleyişine dair kritik bilgiler sağlar.Bu yöntemi ilk kez kullanacak kişilerin, yüksek çözünürlüklü bir yapı elde etmenin büyük ölçüde numune kalitesine ve giriş verilerine bağlı olduğunu unutmamaları gerekir. SPHIRE uygulamasını kullanmaya başlamak için terminalden GUI'yi açın. e2display ile bir kriyomikroskopi görüntüsünü görüntülemek için UTILITIES sekmesini açın.Angstrom başına piksel cinsinden en uzun parçacık eksenini ölçmek için yerleşik ölçüm aracını kullanın. Project Settings'i açın. CTF pencere boyutunu, en az parçacık kutu boyutu olacak şekilde ayarlayın.Parçacık kutu boyutunu, parçacık çapının en az 1 1/2 katı olacak şekilde çift bir sayıya ayarlayın. Parçacık yarıçapını, ölçülen uzunluğun en az yarısına ayarlayın. Biliniyorsa nokta grup simetrisini ve yaklaşık moleküler kütleyi girin.Ayarları kaydedin. Ardından, MOVIE menüsünden Micrograph movie alignment seçeneğini açın. unblur ve summovie yürütülebilir dosya yollarını ayarlayın.Hizalanmamış ham bir mikrograf filmi seçin ve giriş mikrograf yolu desenini belirlemek için dosya adı değişkenini bir joker karakterle değiştirin. Çıktı dizinine bir isim verin. Film kare sayısını, mikroskop voltajını ve kare başına pozlama süresini doldurun.Doz ağırlıklı ve doz ağırlıksız hareket düzeltmeli ortalama mikrograflar oluşturmak için işlemi çalıştırın. Ardından, CTER menüsünü açın ve CTF Estimation seçeneğini belirleyin. Giriş olarak doz ağırlıksız mikrografları ayarlayın.Çıktı dizinine isim verin ve veri toplama parametrelerini doldurun. En düşük frekansı 0,285 inverse angstrom ve en yüksek frekansı 0,285 inverse angstrom olarak ayarlayın. CTF parametreleri listesini oluşturmak için işlemi çalıştırın.Ardından, WINDOW menüsünü açın ve Particle Picking seçeneğini seçin. Girdi olarak doz ağırlıklı mikrografları ayarlayın ve e2boxer aracını başlatın. Parçacık seçme işlemini manuel veya otomatik olarak gerçekleştirin.Seçilen partikülleri görüntü yığınlarına çıkarın ve bu yığınları bir BDB veritabanında tek bir sanal görüntü yığını şeklinde birleştirin. Partiküller seçilip yığınlandığında, ISAC menüsünü açın ve ISAC 2D Kümeleme seçeneğini belirleyin. BDB veritabanındaki sanal görüntü yığınını girdi olarak ayarlayın.Sınıf başına düşen görüntü sayısını tahmin edin. Kalan parametreleri doldurun ve 2D sınıf ortalamalarını oluşturun. 2D sınıflandırma tamamlandığında, doğrulanmış tekrarlanabilir sınıf ortalamalarını görüntülemek için Verileri Görüntüle (Display Data) aracını kullanın.Birden fazla partikül oryantasyonunun temsil edildiğini ve sınıf ortalamalarının tatmin edici kalitede olduğunu doğrulayın. Yalnızca doğrulanmış sınıf ortalamalarına ait partikülleri içeren yeni bir sanal görüntü yığını oluşturun. Ardından, VIPER menüsünü açın ve sınıf ortalamalarını görüntülemek için Verileri Görüntüle (Display Data) aracını kullanın.Kötü kaliteli olan veya partikülün aynı görünümlerini sergileyen sınıf ortalamalarını silin. Kalan sınıf ortalamalarını yeni bir dosyaya kaydedin. Ardından, Initial 3D Model RVIPER'ı seçin ve girdi olarak bu küçük sınıf ortalamaları seçimini kullanın.Proteinin başlangıç düzeyinde tekrarlanabilir bir 3D modelini oluşturmak için komutu çalıştırın. Modeli, Chimera moleküler grafik programında inceleyin. Modeli, ilgilenilen proteinin homolog bir proteininin veya domaininin bilinen bir yapısıyla karşılaştırın.SPHIRE'daki VIPER menüsüne dönün ve 3D Referans Oluştur'u seçin. Doğru piksel boyutuna ve 3D maskeye sahip başlangıç bir 3D referans modeli oluşturun. MERIDIEN menüsünü açın ve 3D İyileştirme'yi seçin.Girdi görüntü yığını ve başlangıç 3D referans dosyası yollarını doldurun. Çıktı dizinini adlandırın ve referans modelin maskesini 3D maske olarak ayarlayın. Sert 2D maskeyi uygula (Apply hard 2D mask) seçeneğini belirleyin.Başlangıç çözünürlüğünü 20 ile 25 angstrom arasında ayarlayın ve filtrelenmemiş yarı hacimleri üretmek için 3D rafinasyonu çalıştırın. Ardından, filtrelenmemiş yarı hacmi Chimera'da görüntüleyin. Tüm protein yoğunluklarının birbirine bağlı olduğu ancak gürültü artefaktlarının olmadığı bir ikilileştirme eşiği belirleyin.SPHIRE'ın MERIDIEN menüsüne dönün ve Adaptive 3D Mask'ı açın. Filtrelenmemiş yarı hacim girişini ve binarizasyon eşiğini girin. Çıktı maskesini adlandırın ve yumuşak kenarlı bir 3D maske oluşturmak için işlemi başlatın.Ardından, Sharpening sekmesini açın ve her iki filtrelenmemiş yarım hacmi (half-volume) seçin. Yumuşak kenarlı yarım hacim 3D maskesini, kullanıcı tarafından sağlanan maske (user-provided mask) olarak ayarlayın. Yarım hacimleri birleştiren, ardından birleştirilmiş hacmi filtreleyen ve keskinleştiren işlemi çalıştırın.Nihai çözünürlük tahminini görüntülemek için günlük dosyasını açın. 3B iyileştirme sırasında oluşturulan giriş görüntü yığınındaki partikül açısal dağılımının 3B haritasını oluşturun. Keskinleştirilmiş ve filtrelenmiş 3B modeli Chimera'da açın.Yoğunluk haritasını ve yüksek çözünürlüklü özelliklerini inceleyin. Açısal dağılımı Chimera'da açın ve Euler açılarının izotropik olarak dağıldığını doğrulayın. SORT3D menüsünü açın ve 3D Değişkenlik Tahmini'ni seçin.Doğrulanmış sınıf ortalamalarına ait partikül görüntülerinden oluşan sanal yığından bir 3D değişkenlik haritası oluşturun. Ardından gelen odaklanmış 3D kümeleme için bu değişkenlik haritasından ikili bir 3D maske oluşturun. Daha sonra 3D Clustering RSORT3D'yi açın ve giriş olarak önceki 3D iyileştirme dizinini seçin.Çıktı dizinine isim verin, genel ve odaklanmış 3D maskeleri ayarlayın. Büyük veri setleri için grup başına en az 5.000 ila 10.000 görüntü kullanın. Her bir homojen 3D grubun hacimlerini oluşturmak için sınıflandırma işlemini çalıştırın.En yüksek görünür çözünürlüğe sahip yapıyı belirlemek için Chimera'yı kullanın. SPHIRE'daki SORT3D menüsüne dönün ve Yerel Alt Küme İyileştirmesi'ni (Local Subset Refinement) açın. Alt küme metin dosyası yolunu, en yüksek çözünürlüklü yapıya karşılık gelen partikül kimliği küme dosyasına ayarlayın.3D iyileştirme dizinini, filtrelenmemiş yarı hacimlerin bulunduğu dizin olarak ayarlayın ve yeniden başlatma iterasyonunu, önceki 3D iyileştirmedeki en yüksek çözünürlüklü iterasyon olarak belirleyin. Yerel filtrelenmemiş yarı hacimleri oluşturmak için komutu çalıştırın. Ardından, yerel yarı hacimlerden birinden yumuşak kenarlı bir 3D maske oluşturun.Yerel yarı hacimleri birleştirin ve düşük geçiren filtre uygulamadan birleştirilmiş hacmi keskinleştirin. Ardından, LOCALRES menüsünü açın ve Local Resolution seçeneğine tıklayın. Yerel yarı hacimleri seçin.Ardından, yerel yumuşak kenarlı maskeyi seçin. Genel çözünürlüğü, birleştirilmiş yerel hacim netleştirilirken tahmin edilen mutlak çözünürlüğe ayarlayın. Hacmin yerel çözünürlüğünü hesaplayın.Ardından, 3D Local Filter'ı açın. Girdi olarak keskinleştirilmiş filtresiz lokal hacmi belirleyin. Lokal çözünürlük haritasını ve yumuşak kenarlı 3D maskeyi seçin.Nihai 3D modeli oluşturmak için keskinleştirilmiş hacme yerel çözünürlük filtresini uygulayın. Ortaya çıkan hacmi ve yerel çözünürlük haritasını Chimera'da açın. Yüzey Renklendirme (Surface Color) aracını başlatın, menüden hacmi seçin ve yüzeyi yerel çözünürlüğe göre renklendirme seçeneğini belirleyin.TcdA1 toksin kompleksi kriyomikroskopi ile görüntülenmiştir. Tüm görüntüler, net bir şekilde ayırt edilebilen tekil partiküller ve güç spektrumunda dört angstromdan daha iyi bir çözünürlüğe ulaşan Thon halkaları göstermiştir. Partiküller e2boxer kullanılarak seçilmiş ve ardından bir görüntü yığınına çıkarılmıştır.İteratif stabil hizalama ve kümeleme (ISAC) yöntemiyle iki boyutlu sınıf ortalamaları oluşturulmuştur. Bu sınıf ortalamaları, RVIPER kullanılarak tekrarlanabilir bir 3D model hesaplamak için kullanılmıştır. Bu model, TcdA1'in önceden çözülmüş kristal yapısıyla iyi bir uyum göstermiştir.Bu modelin MERIDIEN kullanılarak gerçekleştirilen otomatik 3D iyileştirmesi, atomik çözünürlüğe yakın bir harita oluşturmuştur. 3D değişkenlik analizi, histidin etiketli N terminal bölgesinin, reseptör bağlama bölgelerinin ve TcB bağlama bölgesinin yerel esnekliğine işaret etmiştir. Yerel çözünürlük hesaplamaları gerçekleştirilmiştir.Keskinleştirilmiş model yerel olarak filtrelendi ve yerel çözünürlüğe karşılık gelen bir renk ölçeği uygulandı; bu durum, yüksek değişkenlik gösteren alanlar ile düşük çözünürlüklü alanlar arasındaki topolojik uyumu ortaya koydu. TcdA1'in nihai 3,5-angstrom çözünürlüklü cryo-EM yapısı, çoğu yan zincir için net yoğunluklar gösterdi. Bu ayrıntı düzeyine sahip bir yoğunluk haritası, de novo atomik model oluşturma için daha sonra kullanılabilir.Bu yaklaşım kullanılarak, önceden yapısal bilgiye ihtiyaç duyulmadan, birkaç saat veya birkaç gün içinde atomik çözünürlüğe yakın bir yapı elde edilebilir. Bu prosedürü uygularken yalnızca yüksek kaliteli veriler kullanın ve ara sonuçları kontrol edin. Kriyo-EM örneğinin bileşimsel ve yapısal heterojenliği, atomik çözünürlüğe yakın bir seviyeye ulaşmada sınırlayıcı bir faktör olabilir.Bu videoyu izledikten sonra, cryo-EM yapı tayini için SPHIRE'ın nasıl kullanılacağı konusunda artık iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Gördüğünüz gibi, SPHIRE içerisinde yer alan kümeleme rutinleri, yalnızca ilgilenilen proteinin yapısını çözmenize değil, aynı zamanda konformasyonel dinamikleri incelemenize ve karmaşık moleküler mekanizmalar hakkında kritik mekanistik içgörüler elde etmenize de olanak tanıyacaktır.

high-resolution-single-particle-analysis-from-electron-cryo

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Kriyo-elektron mikroskopisinde tek parçacık analizi, biyolojik toplulukların yapısını yüksek çözünürlükte belirlemek için kullanılan ana tekniklerden biridir. Scipion, mikroskop tarafından elde edilen bilgileri işlemek ve biyolojik numunenin 3D yeniden yapılandırılmasını sağlamak için tüm boru hattını oluşturmak için araçlar sağlar.

Scipion ile Kriyo-EM ve Tek Parçacık Analizi

CryoEM kullanılarak makromoleküler komplekslerin yapı tespiti, belirli protein ve kompleks sınıfları için rutin hale gelmiştir. Burada, bu işlem hattı özetlenmiştir (numune hazırlama, tarama, veri toplama ve işleme) ve okuyucular daha zorlu numuneler durumunda değiştirilebilecek daha ayrıntılı kaynaklara ve değişkenlere yönlendirilir.

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopisi, yüksek verimli otomatik veri toplama için uygun bir yazılım paketi ve kullanıcı dostu bir işlem hattı gerektirir. Burada, düşük doz koşullarında vitrifiye biyomoleküllerin veri toplanması için tam otomatik görüntü alma yazılım paketi, Latitude-S ve pratik bir boru hattı uygulamasını sunuyoruz.

Tek parçacıklı Cryo-elektron Mikroskopisi için Kullanıcı Dostu, Yüksek Verimli ve Tam Otomatik Veri Toplama Yazılımı

Bu makalede, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için çeşitli tek parçacıklı veri kümelerine uygulanabilir tek ve sağlam bir iş akışı oluşturmak için üç kriyo-EM işleme platformunun, yani cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'ün etkili bir şekilde nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Destek katmanlarının kriyojenik elektron mikroskobu (cryoEM) ızgaralarına uygulanması, parçacık yoğunluğunu artırabilir, hava-su arayüzü ile etkileşimleri sınırlayabilir, ışın kaynaklı hareketi azaltabilir ve parçacık yönelimlerinin dağılımını iyileştirebilir. Bu belge, gelişmiş kriyo numunesi hazırlama için cryoEM ızgaralarını tek katmanlı bir grafen ile kaplamak için sağlam bir protokolü açıklamaktadır.

Yüksek Çözünürlüklü Yapı Belirleme için Tek Katmanlı Grafenin Kriyo-Elektron Mikroskobu Izgaralarına Uygulanması

Cryo-EM için gelişmiş bir parçacık seçim yöntemi olan CryoSieve, gerçek dünyadaki bir veri seti üzerindeki uygulamasıyla gösterildiği gibi, nihai yığınlardaki parçacıkların çoğunu kaldırarak yoğunluk haritası çözünürlüğünü iyileştirir.

Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskobu Son Yığınlarındaki Parçacıkların Çoğunu Kaldırarak Yoğunluk Haritalarının Geliştirilmesi

Biopanning bakteriyel görüntü kitaplıkları peptid benzeşme reaktifler, antikorlar için güçlü bir alternatif keşfi için kanıtlanmış bir tekniktir. Yarı Otomatik sıralama yöntemini burada yanlış pozitif oluşumunu azaltmak için biopanning aerodinamik. Burada düşünce süreci ve adayların değerlendirilmesi ve aşağı akım analizi en aza indirerek uygulanan teknikler gösterilmektedir.

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Burada sunulan tek tek veya birlikte fibrin pıhtısı yapısı üzerinde beta-amiloid etkisini analiz için kullanılan iki yöntem vardır. Vitro fibrin pıhtısı oluşturma takip için pıhtı bulanıklık ve Tarama elektron mikroskobu ile yöntemleri dahil bir protokoldür.

β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Yüksek çözünürlüklü complexome profilleme için mikrotom kullanan çok yönlü bir kriyoliking BN-MS protokolü sunulur.

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Öğrenin, SPHIRE yazılımı ile kriyojenik elektron mikroskobu görüntülerinden tek parçacık analizi yaparak makromoleküler komplekslerin yüksek çözünürlüklü yapılarını belirleme yöntemini.

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

Daha fazla video keşfet