SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

Bu prosedürün genel amacı, görüntü işleme yazılımı SPHIRE kullanılarak elektron kriyo-mikroskopi verilerinin tek parçacık analizi ile makromoleküler komplekslerin yapısını belirlemektir. Tek parçacıklı cryo-EM, makromolekül yapılarını atomik çözünürlüğe yakın bir şekilde incelemek için ana akım bir teknoloji haline geliyor. PHIRE, cryo-EM verilerinin kullanıcı dostu bir şekilde yarı otomatik olarak işlenmesini sağlayan yeni bir yazılım paketidir.

SPHIRE ile en büyük avantaj otomatik doğrulama mekanizmasıdır. Prosedürlerin çoğunun yalnızca bir kez çalıştırılması gerekir ve sonuçlar objektif ve tekrarlanabilirdir. Yüksek çözünürlüklü kriyo-EM, bireysel kalıntıları yerleştirmek için kullanılabilir, böylece karmaşık mikromoleküler makinelerin organizasyonu ve işlevi hakkında önemli bilgiler sağlar.

Bu yönteme yeni olan kişiler, yüksek çözünürlüklü bir yapı elde etmenin büyük ölçüde numunenin kalitesine ve girdi verilerine bağlı olduğunu unutmamalıdır. SPHIRE uygulamasını kullanmaya başlamak için terminalden GUI'yi açın. E2display ile bir kriyo-mikroskopi görüntüsü görüntülemek için YARDIMCI PROGRAMLARI açın.

Piksel başına angstrom cinsinden en uzun parçacık eksenini ölçmek için yerleşik ölçüm aracını kullanın. Proje Ayarları'nı açın. CTF pencere boyutunu en azından parçacık kutusu boyutuna ayarlayın.

Parçacık kutusu boyutunu, parçacık çapının en az 1 1/2 katı olan çift bir sayıya ayarlayın. Parçacık yarıçapını ölçülen uzunluğun en az yarısına ayarlayın. Biliniyorsa nokta grubu simetrisini ve yaklaşık moleküler kütleyi girin.

Ayarları kaydedin. Ardından, FİLM menüsünde Mikrograf film hizalamasını açın. Unblur ve summovie yürütülebilir dosya yollarını ayarlayın.

Ham hizalanmamış bir mikrograf filmi seçin ve giriş mikrograf yolu desenini ayarlamak için dosya adı değişkenini bir joker karakterle değiştirin. Çıkış dizinine bir ad verin. Film karelerinin sayısını, mikroskop voltajını ve kare başına pozlamayı doldurun.

Doz ağırlıklı ve doz ağırlıksız hareket düzeltmeli ortalama mikrograflar oluşturmak için işlemi çalıştırın. Ardından, CTER menüsünü açın ve CTF Tahmini'ni seçin. Doz ağırlıksız mikrografları giriş olarak ayarlayın.

Çıkış dizinine bir ad verin ve veri toplama parametrelerini doldurun. En düşük frekansı 0285 ters angstrom ve en yüksek frekansı 0,285 ters angstrom olarak ayarlayın. CTF parametrelerinin bir listesini oluşturmak için işlemi çalıştırın.

Ardından, PENCERE menüsünü açın ve Parçacık Toplama'yı seçin. Doz ağırlıklı mikrografları giriş olarak ayarlayın ve e2boxer yardımcı programını başlatın. Parçacık toplama işlemini manuel veya otomatik olarak gerçekleştirin.

Toplanan parçacıkları görüntü yığınlarına çıkarın ve yığınları bir BDB veritabanında tek bir sanal görüntü yığınında birleştirin. Parçacıklar toplandıktan ve istiflendikten sonra, ISAC menüsünü açın ve ISAC 2D Kümeleme'yi seçin. BDB veritabanındaki sanal görüntü yığınını giriş olarak ayarlayın.

Sınıf başına görüntü sayısını tahmin edin. Kalan parametreleri doldurun ve 2B sınıf ortalamalarını oluşturun. 2B sınıflandırma tamamlandıktan sonra, doğrulanmış yeniden üretilebilir sınıf ortalamalarını görüntülemek için Verileri Görüntüle yardımcı programını kullanın.

Birden fazla parçacık oryantasyonunun temsil edildiğini ve sınıf ortalamalarının tatmin edici kalitede olduğunu doğrulayın. Yalnızca doğrulanmış sınıf ortalamalarına ait parçacıkları içeren yeni bir sanal görüntü yığını oluşturun. Ardından, VIPER menüsünü açın ve sınıf ortalamalarını görüntülemek için Verileri Görüntüle yardımcı programını kullanın.

Düşük kaliteli veya parçacığın aynı görünümlerini gösteren sınıf ortalamalarını silin. Kalan sınıf ortalamalarını yeni bir dosyaya kaydedin. Ardından, İlk 3B Model RVIPER'ı seçin ve girdi olarak küçük sınıf ortalamaları seçimini kullanın.

Proteinin ilk tekrarlanabilir 3B modelini oluşturmak için komutu çalıştırın. Modeli moleküler grafik programı Chimera'da inceleyin. Modeli, ilgilenilen proteinden homolog bir proteinin veya alanın bilinen bir yapısıyla karşılaştırın.

SPHIRE'daki VIPER menüsüne dönün ve 3D Referansı Oluştur'u seçin. Doğru piksel boyutuna ve 3B maskeye sahip bir ilk 3B referans modeli oluşturun. MERIDIEN menüsünü açın ve 3D İyileştirme'yi seçin.

Giriş görüntüsü yığınını ve ilk 3B referans dosyası yollarını doldurun. Çıktı dizinini adlandırın ve referans modelin maskesini 3B maske olarak ayarlayın. Sert 2D maske uygula'yı seçin.

Başlangıç çözünürlüğünü 20 ile 25 angstrom arasında bir değere ayarlayın ve filtrelenmemiş yarım hacimleri oluşturmak için 3D iyileştirmeyi çalıştırın. Ardından, Chimera'da filtrelenmemiş yarım hacimde görüntüleyin. Tüm protein yoğunluklarının bağlı olduğu, ancak gürültü artefaktlarının bağlı olmadığı bir ikilileşme eşiği belirleyin.

SPHIRE'ın MERIDIEN menüsüne dönün ve Uyarlanabilir 3D Maske'yi açın. Filtrelenmemiş yarım hacim girişini ve ikili oluşturma eşiğini girin. Çıkış maskesini adlandırın ve yumuşak kenarlı bir 3B maske oluşturmak için işlemi çalıştırın.

Ardından, Keskinleştirme'yi açın ve filtrelenmemiş her iki yarım hacmi de seçin. Yumuşak kenarlı yarım hacimli 3D maskeyi kullanıcı tarafından sağlanan maske olarak ayarlayın. Yarım birimleri birleştiren ve ardından birleştirilmiş birimi filtreleyen ve keskinleştiren işlemi çalıştırın.

Son çözünürlük tahminini görüntülemek için günlük dosyasını açın. 3B iyileştirme sırasında oluşturulan giriş görüntü yığınının parçacık açısal dağılımının bir 3B haritasını oluşturun. Keskinleştirilmiş ve filtrelenmiş 3D modeli Chimera'da açın.

Yoğunluk haritasını ve yüksek çözünürlüklü özelliklerini inceleyin. Chimera'da açısal dağılımı açın ve Euler açılarının izotropik olarak dağıldığını doğrulayın. SORT3D menüsünü açın ve 3D Değişkenlik Tahmini'ni seçin.

Doğrulanmış sınıf ortalamalarına ait sanal parçacık görüntüleri yığınından bir 3B değişkenlik haritası oluşturun. Sonraki odaklanmış 3B kümeleme için bu değişkenlik haritasından ikili bir 3B maske oluşturun. Ardından, 3B Kümeleme RSORT3D'ni açın ve giriş olarak önceki 3B iyileştirmenin dizinini seçin.

Çıktı dizinine bir ad verin ve genel ve odaklanmış 3B maskeleri ayarlayın. Büyük veri kümeleri için grup başına en az 5.000 ila 10.000 görüntü kullanın. Her homojen 3B grubun hacimlerini oluşturmak için sıralama işlemini çalıştırın.

En yüksek görünür çözünürlüğe sahip yapıyı belirlemek için Chimera'yı kullanın. SPHIRE'daki SORT3D menüsüne dönün ve Yerel Alt Küme İyileştirme'yi açın. Alt küme metin dosyası yolunu, en yüksek çözünürlüklü yapıya karşılık gelen parçacık kimliği küme dosyasına ayarlayın.

3B iyileştirme dizinini, filtrelenmemiş yarım birimleri içeren dizine ve yeniden başlatma yinelemesini, önceki 3B iyileştirmeden en yüksek çözünürlüklü yinelemeye ayarlayın. Yerel filtrelenmemiş yarım birimler oluşturmak için komutu çalıştırın. Ardından, yerel yarım birimlerden birinden yumuşak kenarlı bir 3B maske oluşturun.

Yerel yarım birimleri birleştirin ve düşük geçiren filtre uygulamadan birleştirilmiş birimi keskinleştirin. Ardından, LOCALRES menüsünü açın ve Yerel Çözünürlük'e tıklayın. Yerel yarım birimleri seçin.

Ardından, yerel yumuşak kenarlı maskeyi seçin. Genel çözünürlüğü, birleştirilmiş yerel birim keskinleştirilirken tahmin edilen mutlak çözünürlüğe ayarlayın. Birimin yerel çözünürlüğünü hesaplayın.

Ardından, 3B Yerel Filtre'yi açın. Keskinleştirilmiş, filtrelenmemiş yerel ses seviyesini giriş olarak ayarlayın. Yerel çözünürlük haritasını ve yumuşak kenarlı 3B maskeyi seçin.

Son 3D modeli oluşturmak için keskinleştirilmiş hacme yerel çözünürlük filtresini uygulayın. Ortaya çıkan hacim ve yerel çözünürlük haritasını Chimera'da açın. Yüzey Rengi aracını başlatın ve menüden ses seviyesini ve yüzeyi yerel çözünürlüğe göre renklendirme seçeneğini seçin.

Toksin kompleksi TcdA1 kriyomikroskopi ile görüntülendi. Tüm görüntüler, güç spektrumunda dört angstromdan daha iyi bir çözünürlüğe kadar uzanan net bir şekilde ayırt edilebilen tek parçacıklar ve Thon halkaları gösterdi. Parçacıklar e2boxer kullanılarak seçildi ve daha sonra bir görüntü yığınına çıkarıldı.

İki boyutlu sınıf ortalamaları, yinelemeli kararlı hizalama ve kümeleme veya ISAC tarafından oluşturulmuştur. Bu sınıf ortalamaları, RVIPER ile tekrarlanabilir bir 3D modeli hesaplamak için kullanıldı. Bu model, TcdA1'in daha önce çözülmüş kristal yapısıyla iyi bir uyum içindeydi.

Bu modelin MERIDIEN kullanılarak otomatik olarak 3D rafine edilmesi, atomik bir çözünürlük oluşturdu map. 3D değişkenlik analizi, histidin etiketli N terminal bölgesinin, reseptör bağlama alanlarının ve TcB bağlama alanının lokalize esnekliğini gösterdi. Yerel çözünürlük hesaplamaları yapıldı.

Keskinleştirilmiş model yerel olarak filtrelendi ve yüksek değişkenlik alanları ile düşük çözünürlüklü alanlar arasındaki topolojik uyumu gösteren yerel çözünürlüğe karşılık gelen bir renk ölçeği uygulandı. TcdA1'in son 3.5 angstrom çözünürlüklü kriyo-EM yapısı, çoğu yan zincir için net yoğunluklar gösterdi. Bu ayrıntı düzeyine sahip bir yoğunluk haritası, de novo atomik model oluşturma için daha fazla kullanılabilir.

Bu yaklaşımı kullanarak, atoma yakın bir çözünürlük yapısı, a priori yapısal bilgi olmadan saatler veya birkaç gün içinde elde edilebilir. Bu yordamı denerken, yalnızca yüksek kaliteli verileri kullanın ve ara sonuçları kontrol edin. Kriyo-EM numunesinin bileşimsel ve yapısal heterojenliği, atomik çözünürlüğe yakın çözünürlüğe ulaşmak için sınırlayıcı bir faktör olabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, cryo-EM yapısal belirleme için SPHIRE nasıl kullanılacağını artık iyi anlamış olmalısınız. Gördüğünüz gibi, PHIRE'de yer alan kümeleme rutinleri, yalnızca ilgilenilen proteinin yapısını çözmenize değil, aynı zamanda konformasyonel dinamikleri incelemenize ve karmaşık moleküler mekanizmalar hakkında önemli mekanik bilgiler sağlamanıza da olanak sağlayacaktır.