Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi

Bu yüksek içerikli mikroskopi tabanlı yöntemin genel amacı, farklı deneysel perturbasyonlara maruz kalan hücre hatları için sağlam bir redoks parmak izi oluşturmak amacıyla, mitokondriyal morfo-fonksiyonu ve hücre içi reaktif oksijen türleri seviyelerini eş zamanlı olarak nicelleştirmektir. Bu yöntem, patojenik durumların veya bileşik tedavilerinin oksidatif stres oluşturup oluşturmadığı ve mitokondriyal form ile fonksiyonun ne ölçüde etkilendiği gibi redoks biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tüm parametrelerin aynı hücre içinde ve aynı anda ölçülebilmesidir.

prosedüre başlamak için, ince sürekli polistiren veya cam tabanlı siyah bir 96 kuyucuklu plakadaki 60 iç kuyucuğa 8 ila 10.000 insan dermal fibroblasti ekleyin. Farklı koşullar, tedaviler veya hücre hatları kullanıldığında, plaka etkilerini en aza indirmek için ekim konumlarını plaka üzerine homojen olarak dağıtın. Ardından, odak ayarı için kullanılmak üzere B01 kuyucuğuna 8 ila 10.000 hücre daha ekleyin.

Ardından, kuyucuklar ile ortam arasındaki gradyanları en aza indirmek için boş dış kuyucukları besiyeri ile doldurun. Hücrelerin yamalı şekilde büyümesini önlemek için plakayı inkübatöre geri yerleştirmeden önce üç kez hafifçe vurun. Hücreleri 24 saat boyunca veya %70 konfluens düzeyine ulaşana kadar kültüre edin.

Ardından, deneyle ilgili işlem bilgilerini setup adlı bir hesap tablosuna kaydedin. Mikroskobu kurmak için öncelikle yazılımı kullanarak XY tablasını kalibre edin. Sonrasında, görüntüleme yazılımını kullanarak çok kuyucuklu bir plaka için görüntüleme protokolü oluşturun.

Bu protokol, 96 kuyucuklu bir plakanın belirlenen konumlarının ve seçili kuyucuklarının otomatik olarak elde edilmesini sağlar. Şimdi, yazılımda sunulan mevcut plakalar listesinden uygun çok kuyucuklu plaka tipini seçin. Alternatif olarak, plaka ve kuyucuk boyutlarını kullanarak çok kuyucuklu plaka formatını tanımlayın.

Ardından, dıştaki dört köşe kuyucuğundan ikisini tanımlayarak kuyucuk plakasını hizalayın. Bunu takiben, görüntülenmesi gereken kuyucukları seçin ve ardışık dalga boyu alımından oluşan bir alım protokolü tanımlayın. GFP kanalının ilk olarak ayarlandığından emin olun.

Ardından, tanımlanan görüntüleme protokolünü kullanarak seçilen her kuyucuğun merkezinin etrafında konumlandırılmış, düzenli aralıklı ve birbiriyle örtüşmeyen dört görüntü elde etmek için bir kuyucuk plakası döngüsü tanımlayın. Bu adımda, HBSS HEPES tamponuna CM-H2DCFDA ve TMRM stok çözeltisi ekleyerek 60 kuyucuk için boyama çözeltisini hazırlayın. Daha sonra, plakayı tek bir akıcı hareketle ters çevirerek hücrelerdeki kültür ortamını uzaklaştırın.

Hücreleri HH tamponu ile nazikçe iki kez yıkayın. Odak ayarı için kullanılan hücrelerin bulunduğu A01 kuyusunu unutmayın. Yıkama adımları arasında HH tamponunu atın.

Ardından, her kuyucuğa 100 microliters boyama çözeltisi ekleyerek hücreleri CM-H2DCFDA ve TMRM ile yükleyin. A01 kuyucuğunu unutmayın. Hücreleri oda sıcaklığında, karanlıkta 25 dakika boyunca inkübe edin.

25 dakika sonra, hücreleri 100 µL HH tamponu ile iki kez yıkayın ve 60 iç kuyucuğun tamamına 100 µL HH tamponu ekleyin. Asıl ölçümü gerçekleştirmek için plakayı mikroskoba yerleştirin. Ardından, donanım tabanlı otomatik odaklama sistemini açın ve net bir görüntü elde edene kadar B01 kuyucuğunu ve TMRM kanalını kullanarak otomatik odaklama ofsetini ayarlayın.

Ardından, görüntüleme protokolünü çalıştırın. Elde edilen görüntü veri seti; bazal ROS seviyeleri, mitokondriyal membran potansiyeli ve mitokondriyal morfoloji hakkında bilgi sağlayacaktır. Daha sonra, indüklenen ROS seviyelerini ölçmek için 96 kuyucuklu plakayı mikroskoptan dikkatlice çıkarın.

Her bir kuyucuğa 40 micromolar konsantrasyonunda 100 microliters TBHP çözeltisi ekleyin ve TBHP'nin CM-H2DCFDA ile tamamen reaksiyona girmesi için en az üç dakika bekleyin. Bu süre zarfında, A01 kuyucuğuna 100 microliters antikor çalışma çözeltisi ekleyin. Şimdi plakayı mikroskoba tekrar yerleştirin ve B01 kuyucuğunu kullanarak odağı yeniden kontrol edin.

Ardından, aynı görüntüleme protokolünü kullanarak ilk görüntüleme turundakiyle aynı konumları edinin. Elde edilen görüntü veri seti, indüklenen ROS seviyeleri hakkında bilgi sağlayacaktır. Sonrasında, A01 kuyucuğunda flat field görüntüleri edinin.

Sinyallerin dinamik aralık içerisinde olduğundan emin olun. Bunun için kazanım ayarlarını düzenleyin. Ardından, elde edilen veri setlerini standart isimlendirme kullanarak tek bir klasörde ayrı TIFF dosyaları olarak dışa aktarın.

Buna; plak, TBHP işlemi öncesi veya sonrası, kuyucuk, alan ve kanal bilgilerinin alt çizgilerle ayrıldığı referanslar dahildir. Ayrıca, düz alan görüntülerini standartlaştırılmış isimlendirmeyi kullanarak aynı klasöre ayrı TIFF dosyaları olarak kaydedin. Bu adımda, görüntü işleme yazılımını açın ve redoks metrikleri makro setini yükleyin.

Ardından, S düğmesine tıklayarak analiz ayarlarını yapılandırmak için kurulum arayüzünü açın. Görüntü tipini, kanal sayısını ve düz alan görüntülerinin alınması için kullanılan kuyucuğu seçin. Bundan sonra, hangi kanalın hücreleri veya mitokondrileri içerdiğini belirtin.

Arka plan çıkarma ve sırasıyla kontrast sınırlı adaptif histogram eşitleme işlemlerini gerçekleştirmek için "background" ve "enhance" onay kutularını işaretleyin. Ardından, hücrelerin gausyen bulanıklaştırması ve mitokondrilerin laplasyen iyileştirmesi için bir sigma değeri tanımlayın. Bir otomatik eşikleme algoritması seçin ve boyut hariç tutma sınırlarını doldurun.

Ardından, edinilen veri setlerinden seçilen birkaç görüntüyü açıp menüdeki C veya M düğmelerine sırasıyla hücre veya mitokondri segmentasyonu için tıklayarak segmentasyon ayarlarını test edin. Bunu takiben, kare düğmesine tıklayıp görüntülerin bulunduğu klasörü seçerek ilgili klasör üzerinde toplu analiz işlemini gerçekleştirin. Ayarları doğrulayın ve tamam'a basın.

Toplu analizden sonra, V butonuna tıklayıp görüntülerin bulunduğu klasörü seçerek bir doğrulama yığını üzerinde segmentasyon performansını görsel olarak doğrulayın. Segmentasyonun başarılı olup olmadığını onaylamak için doğrulama yığını üzerinden ilerleyin. Çıkarılan verilerin başlangıç analizi, ücretsiz bir Shiny uygulaması ile otomatik olarak gerçekleştirilir.

Bu, sonuçların hızlı bir şekilde yorumlanmasını sağlar. Başlamak için uygulamayı R Studio'da açın. Uygulamanın harici bir tarayıcıda çalıştırılmasını seçin.

Giriş sayfasında, sonuç dosyalarının bulunduğu dizini seçin. Kurulum dosyasının da bu dizinde olduğundan emin olun. Sonuç dosyaları ve kurulum bilgileri otomatik olarak içe aktarılır, derlenir ve görselleştirilir.

Deneysel kurulum sayfası, deneyin düzenini göstermektedir. Bir sonraki sayfa, her bir plaka için ayrı ayrı ROS seviyelerinin yanı sıra çeşitli mitokondriyal parametreleri görüntüler. Açılır menüyü kullanarak görselleştirmek istediğiniz plakayı seçin.

Veriler, çok kuyucuklu plaka formatının yanı sıra, aykırı değerlerin kuyucuk ve görüntü numarasıyla işaretlendiği kutu grafikleri şeklinde gösterilmektedir. Tüm deney sonuçları sayfası, tüm plakalardan elde edilen birleştirilmiş normalize sonuçları ve temel bir istatistiksel analizi sunar. Giriş sayfası üzerinden bir hariç tutma dosyası sağlanırsa, belirtilen veri noktaları kapsam dışı bırakılır.

Kümeleme analizi sayfasında, beş parametreden elde edilen veriler üzerinde yapılan temel bileşenler analizi kullanılarak hassas bir redoks profili oluşturulur. Son olarak, veri indirme sayfası, işlenmiş ve yeniden düzenlenmiş verilerin daha sonra kullanılmak üzere kaydedilmesine olanak tanır. Burada, insan dermal fibroblastlarının HIV proteaz inhibitörü Saquinavir ile tedavi edildiği bir deneyden elde edilen sonuçlar gösterilmektedir.

Açıklanan protokol kullanılarak, hem bazal hem de indüklenmiş ROS seviyelerinde önemli bir artış tespit edilmiştir. DMSO ile işlem görmüş kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında, Saquinavir mitochondrial morfofonksiyonu da önemli ölçüde etkilemiştir.

Mitokondriyal piksel başına ortalama TMRM sinyali olarak ölçülen mitokondriyal membran potansiyeli önemli ölçüde artmıştır. Ayrıca, mitokondriler, bireysel mitokondrilerin daha yüksek daireselliği ve daha küçük ortalama boyutuyla niceliksel olarak belirtilen, oldukça fragmante bir yapı kazanmıştır. Söz konusu parametreler temel bileşen analizi kullanılarak birleştirildiğinde, hem kontrol hem de Saquinavir koşulları, redoks parmak izleri aracılığıyla birbirinden net bir şekilde ayrıştırılabilmiştir.

Bu prosedür uygulanırken, aydınlatmanın kendisinin oksidatif strese neden olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, maruz kalma koşulları minimize edilmeli ve deney boyunca sabit tutulmalıdır. Yöntemde uzmanlaşıldığında, bir günde 20 adede kadar 96 kuyucuklu plaka boyanabilir ve görüntüleri alınabilir.

İkinci görüntüleme turunun ardından, hücreler fikse edilebilir ve ardışık bir immünofloresan boyama için kullanılabilir. Bu işlem, tam olarak aynı hücreler üzerinde ölçülen parametre sayısını artırır ve ek soruların yanıtlanmasına olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, yüksek içerikli mikroskopi kullanarak adherent hücre kültürlerinde ROS ve mitokondriyal morfo-fonksiyonun kombine ölçümlerini gerçekleştirebiliyor olmalısınız.