Name: Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Öğrenin, yüksek içerikli mikroskopi ile canlı adezyon hücrelerinde ROS düzeyleri ve mitokondriyal morfofonksiyonun eşzamanlı ölçümünü. Bu yöntem, redoks biyolojisi araştırmalarında oksidatif stres ve mitokondriyal sağlık arasındaki ilişkiyi aydınlatır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma, Antwerp Üniversitesi (TTBOF/29267, TTBOF/30112), Ghent Üniversitesi Özel Araştırma Fonu (BOF/11267/09 projesi), NB-Photonics (Proje kodu 01-MR0110) ve Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü'nün (NWO; Hayır: CSBR09/013V). Bu el yazmasının bazı bölümleri, Springer'in izniyle başka bir yayından 1'den uyarlanmıştır. Yazarlar, geniş alan mikroskobu konusundaki yardımı için Geert Meesen'e teşekkür eder.

<ol><li>Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+High-Content+Quantification+of+Intracellular+ROS+Levels+and+Mitochondrial+Morphofunction%5BTitle%5D)+AND+%22AAEC%22%5BJournal%5D)">Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction.</a> AAEC. 219, 149-177 (2016).</li>
<li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-ros+crosstalk+in+the+control+of+cell+death+and+aging%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Signal+Transduct%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging).</a> J Signal Transduct. 2012, article ID 329635 1-17 (2012).</li>
<li>Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+protonic+potential+actuates+a+mechanism+of+production+of+reactive+oxygen+species+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+lett%22%5BJournal%5D)">High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria.</a> FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).</li>
<li>Miwa, S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+matrix+reactive+oxygen+species+production+is+very+sensitive+to+mild+uncoupling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling.</a> Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).</li>
<li>Verkaart, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+production+is+inversely+related+to+complex+I+activity+in+inherited+complex+I+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-GEN+SUBJECTS%22%5BJournal%5D)">Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency.</a> BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).</li>
<li>Lebiedzinska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress-dependent+p66Shc+phosphorylation+in+skin+fibroblasts+of+children+with+mitochondrial+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-GEN+SUBJECTS%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders.</a> BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).</li>
<li>Forkink, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+hyperpolarization+during+chronic+complex+I+inhibition+is+sustained+by+low+activity+of+complex+II%2C+III%2C+IV+and+V%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-BIOENERGETICS%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V.</a> BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).</li>
<li>Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+Homeostasis+and+Mitochondrial+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics.</a> Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).</li>
<li>Koopman, W. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NADH%3Aubiquinone+oxidoreductase+deficiency%3A+radical+changes+in+mitochondrial+morphology%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).</li>
<li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics--mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li>
<li>Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubular+network+formation+protects+mitochondria+from+autophagosomal+degradation+during+nutrient+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).</li>
<li>Koopman, W. J. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17066472">Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 &#34;,7 -&#34;dichlorofluorescein.</a> Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).</li>
<li>Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+high-content+analysis+of+mitochondrial+morphofunction+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy.</a> Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).</li>
<li>Sieprath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+accumulation+of+prelamin+A+and+depletion+of+lamin+A%2FC+both+cause+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+but+induce+different+cell+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates.</a> Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).</li>
<li>Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZuiderveld%2C+K+%22Graphics+gems+IV%22">Graphics gems IV</a>. , Academic Press Professional, Inc. 474-485 (1994).</li>
<li>Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChang%2C+W+%22shiny%3A+Web+Application+Framework+for+R.+R+package+version+0.14.2%22">shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=shiny ">https://CRAN.R-project.org/package=shiny </a> (2017).</li>
<li>Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. <a target="_blank" href="https://www.jstatsoft.org/article/view/v064i09">nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals.</a> J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).</li>
<li>Estaquier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+antiretroviral+drugs+on+human+immunodeficiency+virus+type+1-induced+CD4%28%2B%29+T-cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death.</a> J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).</li>
<li>Matarrese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+hyperpolarization+hijacks+activated+T+lymphocytes+toward+the+apoptotic-prone+phenotype%3A+homeostatic+mechanisms+of+HIV+protease+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors.</a> J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).</li>
<li>Roumier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+protease+inhibitors+and+cytomegalovirus+vMIA+induce+mitochondrial+fragmentation+without+triggering+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis.</a> Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).</li>
<li>Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+protease+inhibitor+induced+oxidative+stress+suppresses+glucose+stimulated+insulin+release%3A+protection+with+thymoquinone%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone.</a> Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).</li>
<li>Touzet, O., Philips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+protects+against+protease+inhibitor-induced+reactive+oxygen+species+production%2C+reticulum+stress+and+lipid+raft+perturbation%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation.</a> AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).</li>
<li>Bociąga-Jasik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+effects+of+the+HIV+protease+inhibitor--saquinavir+in+differentiating+human+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes.</a> Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).</li>
<li>Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nelfinavir%2C+an+HIV+protease+inhibitor%2C+induces+apoptosis+and+cell+cycle+arrest+in+human+cervical+cancer+cells+via+the+ROS-dependent+mitochondrial+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway.</a> Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).</li>
<li>Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+small+molecule+phenotypic+effects+using+mitochondrial+morpho-functional+fingerprinting+and+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning.</a> Sci. Rep. 5, 8035(2015).</li>
<li>Invitrogen. Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents. , 
 <a target="_blank" href="https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf ">https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf </a> (2006).</li>
<li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).</li>
<li>Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Convenient+Technique+to+Fix+Suspension+Cells+on+a+Coverslip+for+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy.</a> Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).</li>
<li>Deutsch, M., Deutsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+miniature+cell+retainer+for+correlative+high-content+analysis+of+individual+untethered+non-adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells.</a> Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).</li>
<li>Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+new+method+for+immobilising+kinetoplastid+parasites+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging.</a> Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).</li>
<li>Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+changes+in+plasma+membrane+potential+via+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+at+individual+cell+resolution+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22JBO%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension.</a> JBO. 18 (12), (2013).</li>
<li>Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+cellular+oxygen+and+analysis+of+metabolic+responses+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells.</a> Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).</li>
<li>Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+spinning+disk+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Live cell spinning disk microscopy.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).</li>
<li>Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+live+fluorescence+imaging+of+cellular+dynamics+using+Bessel+beam+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy.</a> Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).</li>
<li>Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+plate+reader-based+methods+with+fluorescence+microscopy+for+measurements+of+intracellular+calcium+levels+for+the+assessment+of+in+vitro+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).</li>
<li>Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+standard+microtiter+plate+reading+versus+imaging+in+cellular+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+drug+development+technologies%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays.</a> Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).</li>
<li>Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Screening+Using+High-Throughput+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry.</a> Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar, yarışan finansal çıkarların veya başka çıkar çatışmasının olmadığını belirtiyorlar. İlgili yazar aynı zamanda tüm yazarlardan herhangi bir çıkar çatışmasını ifşa etmesini istemektedir.

Bu yazıda, NHDF&#39;de hücre içi ROS düzeyleri ve mitokondriyal morfofonksiyonun eşzamanlı olarak ölçülmesi için yüksek içerikli bir mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. SQV ile tedavi edilen NHDF üzerine bir vaka çalışmasıyla performansı gösterildi. Sonuçlar, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25</sup...

<html> Hücre içi ROS konsantrasyonu, ROS üreten ve ROS sıyırma sistemleri arasındaki dinamik bir etkileşim vasıtasıyla titizlikle düzenlenir. İkisi arasındaki dengesizlik, oksidatif stres durumunu kışkırtır. ROS&#39;un ana kaynakları arasında mitokondri 1 bulunur . Hücresel solunumda rolleri göz önüne alındığında, hücre içi süperoksit (O 2 • - ) moleküllerinden 2 sorumludurlar. Bu, çoğunlukla elektron nakil zincirinin 1 kompleksinde elektron kaçağından kuvvetli negatif iç mitokondriyal zar potansiyeli (Δψ m ) koşulları, yani mitokondriyal hiperpolarizasyon sonucu ortaya çıkar. Öte yandan, mitokondriyal depolarizasyon, artmış ROS üretimi ile birden fazla etki moduna işaret eden 3 , 4 , 5 ,&gt; 6 , 7 , 8 . Ayrıca, fizyon-füzyon mekanizmalarının proteinlerindeki redoks değişiklikleri ile ROS, mitokondriyal morfolojiyi birlikte düzenlemektedir 9.Farklı mitokondriyum, artmış ROS üretimi ve apoptoz ile korelasyon gösterirken, ipliksi mitokondri, besin yetersizliği ve korunma ile bağlantılıdır Mitofaji 12 . Hücresel ROS ile mitokondriyal morfofonksiyon arasındaki karmaşık ilişki göz önüne alındığında, ikisi de ideal olarak canlı hücrelerde nicelenmesi gerekir. Tam olarak bunu yapmak için, CM-H2 DCFDA (ROS) ve TMRM (mitokondriyal Δψ m ve morfoloji) floresan probları ile lekelenmiş yapışık hücre kültürlerinin otomatik geniş alan mikroskopisi ve görüntü analizine dayanılarak yüksek içerikli bir görüntüleme testi geliştirildi. Yüksek içerikli görüntüleme, sp&#39;ninÇoklu tamamlayıcı işaretleyiciler ve otomatikleştirilmiş görüntü analizi kullanan hücresel fenotipler hakkında atiotemporal bakımdan zengin ( yani çok sayıda açıklayıcı özellik) bilgi. Otomatik mikroskop ile kombine edildiğinde, birçok numune paralel olarak taranabilir ( yani yüksek verimlilik), böylece tahlilin istatistiksel gücünü artırabilir. Aslında, protokolün temel bir öğesi, aynı hücredeki birden çok parametrenin aynı anda sayısallaştırılmasına ve çok sayıdaki hücre ve koşullara göre ayarlanmasına olanak sağlamasıdır. Protokol 8 bölüme ayrılmıştır (aşağıdaki protokolde ayrıntılı olarak açıklanmıştır): 1) 96 oyuklu plakada hücrelerin tohumlanması; 2) Stok solüsyonlarının, çalışma solüsyonlarının ve görüntü tamponunun hazırlanması; 3) Mikroskop kurulumu; 4) CM-H 2 DCFDA ve TMRM ile hücrelerin yüklenmesi; 5) Bazal ROS düzeylerini ve mitokondriyal morfofonksiyonu ölçmek için ilk canlı görüntüleme yuvarlaklığı; 6) tert -butil ilavesinden sonra ikinci canlı görüntüleme turuIndüklenen ROS düzeylerini ölçmek için peroksit (TBHP); 7) Otomatik görüntü analizi; 8) Veri Analizi, Kalite Kontrolü ve Görselleştirme. Test orijinal olarak normal insan dermal fibroblastları (NHDF) için geliştirildi. Bu hücreler geniş ve düz olduğundan, 2B geniş alanlı görüntülerde 13 , 14 mitokondriyal morfolojiyi değerlendirmek için çok uygundurlar. Bununla birlikte, küçük değişikliklerle bu yöntem, diğer yapışık hücre tipleri için de geçerlidir. Üstelik, CM-H2 DCFDA ve TMRM&#39;nin kombinasyonunun yanında, iş akışı farklı moleküler özgüllükleri olan 1 , 15&#39;e sahip çeşitli floresan boya çiftlerine uygundur.

<table><tbody><tr><td><güçlü >Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tetrametilrodamin, Metil Ester, Perklorat (TMRM)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>CM-H2DCFDA (Genel Oksidatif Stres Göstergesi)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>C6827</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma) Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>MatriPlate 96 Kuyulu Cam Tabanlı MicroWell Plate 630 & L-Siyah 0,17 mm Düşük Cam Kapaklı</td><td>Brooks yaşam bilimleri sistemleri</td><td>MGB096-1-2-LG-L</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, Fenol Kırmızısı olmadan 500 mL</td><td>Lonza</td><td>BE10-527F</td><td></td></tr><tr><td>L-glutaminli DMEM yüksek glikoz</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Bufered Salin (PBS), Ca ve Mg olmadan</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M 500 mL</td><td>Lonza</td><td>17-737F</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-Versen (EDTA) Çözeltisi</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure F (ab ') 2 Parça Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L)</td> Jackson <td></td><td>711-166-152</td><td>Düz alan görüntüsü elde etmek için kullanılan antikor</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F (ab') 2 Parça Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L)</td><td></td> Jackson <td>711-546-152</td><td>Düz alan görüntüsü elde etmek için kullanılan antikor</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti tutulma geniş alan mikroskobu</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfect Focus System (PFS)</td><td>Nikon</td><td></td><td>donanım tabanlı otofokus sistemi</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo Lambda 20X objektif</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS JOBS modülü ile Elelements Advanced Research 4.5</td><td>Nikon</td><td></td><td>Bu yazılım, mikroskobu yönlendirmek ve otomatik görüntü elde etme prototokolünü programlamak/gerçekleştirmek için kullanılır</td></tr>. <tr><td>ImageJ (FIJI) Sürüm 2.0.0-rc-43/1.50g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RStudio Sürüm 1.0.44</td><td>Rstudio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R sürüm 3.3.2</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek İçerikli mikroskopi kullanılarak hücresel redoks profillemesi

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reaktif oksijen türleri (ROS) gen ekspresyonu, göç, farklılaşma ve proliferasyon da dahil olmak üzere gerekli hücresel süreçleri düzenler. Bununla birlikte, aşırı ROS seviyeleri, DNA&#39;ya, lipitlere ve proteinlere geri döndürülemez oksidatif hasar eşlik eden bir oksidatif stres oluşturur. Böylece, ROS&#39;un nicelendirilmesi, hücresel sağlık durumu için doğrudan bir vekil sağlar. Mitokondri, ROS&#39;un başlıca hücresel kaynakları ve hedefleri arasında yer aldığından, patofizyolojik koşullarda arabağlantıyı daha iyi anlamak için aynı hücrelerde mitokondriyal fonksiyon ve ROS üretiminin ortak analizi önemlidir. Bu nedenle, hücre içi ROS seviyelerinin, mitokondriyal membran potansiyelinin (ΔΨ m ) ve mitokondriyal morfolojinin eşzamanlı olarak nicelendirilmesi için yüksek içerikli mikroskopi tabanlı bir strateji geliştirildi. Çok yönlü plakalarda yetiştirilen, yaşayan adherent hücrelerin otomatik geniş alan floresan mikroskobu ve görüntü analizine dayanıyor ve staineD hücreye geçirgen flüoresan haberci molekülleri CM-H2 DCFDA (ROS) ve TMRM (ΔΨ m ve mitokondriyal morfoloji) ile karşılaştırıldı. Florimetri veya akış-sitometri aksine, bu strateji hem deneysel uyarı öncesi hem de sonrasında, yüksek spatiotemporal çözünürlük ile tek tek hücre seviyesinde subselüler parametrelerin miktarının belirlenmesine izin verir. Önemlisi, yöntemin görüntü temelli doğası, sinyal yoğunluğuna ek olarak morfolojik parametrelerin çıkarılmasına izin verir. Kombine özellik kümesi, alt popülasyonlar, hücre türleri ve / veya tedavileri arasındaki farkları saptamak için araştırma ve istatistiksel çok değişkenli veri analizi için kullanılır. Burada, kimyasal pertürbasyon sonrasında hücresel durumlar arasındaki belirgin ayrımcılık potansiyelini kanıtlayan bir deney deneyiyle birlikte, deneyin ayrıntılı bir tarifi verilmektedir.

Deney, çeşitli kontrol deneyleri kullanılarak kıyaslandı; bunların sonuçları Sieprath ve diğ. 1 . Kısacası, CM-H2 DCFDA ve TMRM&#39;nin , sırasıyla , hücre içi ROS ve Δψ m&#39;deki dışa bağımlı değişmelere karşı flüoresan yanıtı, dinamik aralığı belirlemek için nicelendirildi. CM-H 2 DCFDA için NHDF, 10 uM ila 160 uM aralığında artan TBHP konsantrasyonları ile tedavi edildiğinde flüoresans sinyalinde doğrusal bir artış gös...

Bu makale, hücreye nüfuz eden floresan muhabir molekülleri olan canlı yapışık hücrelerde, mitokondriyal membran potansiyeli ve morfolojisinin yanı sıra mitokondriyal morfofonksiyon olarak da adlandırılan, hücre içi ROS seviyelerinin aynı anda ölçülmesi için yüksek içerikli bir mikroskopi iş akışını sunuyor. 5- (ve- 6) -klorometil-2 &#39;, 7&#39;-diklorodihidrofloresan diasetat, asetil ester (CM-H2 DCFDA) ve tetrametilrhodamin metilester (TMRM).

Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Bu yüksek içerikli mikroskopi tabanlı yöntemin genel amacı, farklı deneysel perturbasyonlara maruz kalan hücre hatları için sağlam bir redoks parmak izi oluşturmak amacıyla, mitokondriyal morfo-fonksiyonu ve hücre içi reaktif oksijen türleri seviyelerini eş zamanlı olarak nicelleştirmektir. Bu yöntem, patojenik durumların veya bileşik tedavilerinin oksidatif stres oluşturup oluşturmadığı ve mitokondriyal form ile fonksiyonun ne ölçüde etkilendiği gibi redoks biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tüm parametrelerin aynı hücre içinde ve aynı anda ölçülebilmesidir. prosedüre başlamak için, ince sürekli polistiren veya cam tabanlı siyah bir 96 kuyucuklu plakadaki 60 iç kuyucuğa 8 ila 10.000 insan dermal fibroblasti ekleyin. Farklı koşullar, tedaviler veya hücre hatları kullanıldığında, plaka etkilerini en aza indirmek için ekim konumlarını plaka üzerine homojen olarak dağıtın. Ardından, odak ayarı için kullanılmak üzere B01 kuyucuğuna 8 ila 10.000 hücre daha ekleyin.Ardından, kuyucuklar ile ortam arasındaki gradyanları en aza indirmek için boş dış kuyucukları besiyeri ile doldurun. Hücrelerin yamalı şekilde büyümesini önlemek için

cellular-redox-profiling-using-high-content-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hücreleri stres koşullarına karşılaştığınızda Reaktif oksijen türlerinin seviyesi yükselir. Burada, 3'-3 'diaminobenzidin lekelenmesi örneğin yanı sıra redoks proteom profil cysTMT etiketleme ve kütle spektrometrisi...

İzotop Etiketleme kütle spektrometresi kullanarak Tiyol Redoks Proteom profil

Kaynak: Katsalifis, A., et al. Primer Nöronlarda Mitokondriyal Glutatyon Redoks Durumunun Ratiometrik İndikatör Kullanılarak Canlı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, bir oransal floresan indikatörü kullanılarak birincil nöronlarda mitokondriyal redoks durumunun görüntülenmesini göstermektedir. Bir floresan mikroskobu altında iki uyarma dalga boyu uygulanarak, mitokondriyal oksidasyonu değerlendirmek için floresan yoğunluk oranı ölçülür. Protokol, kalsiyum akışını ve reaktif oksijen...

Primer nöronlarda mitokondriyal redoks durumunun bir oransal gösterge kullanılarak görüntülenmesi

Bu el yazması oksidatif stres xenobiotic kaynaklı incelenmesi için genetik olarak kodlanmış fluorogenic gazetecilere canlı hücre görüntüleme bir uygulamada kullanımını açıklar. Bu deneysel yaklaşım eşsiz kronolojik zamanmekansal çözünürlük, duyarlılık ve özgüllük eksiklikleri toksikolojik oksidatif stres tespiti için kullanılan geleneksel yöntemlerden birçoğu kaçınırken sunmaktadır.

Genetik olarak kodlanmış Fluorogenic sensörleri kullanarak toksikolojik oksidatif stres ilişkin Değerlendirmeler yaklaşımlar görüntüleme

Burada, toplam hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diasetat (DCFH-DA) kullanarak tespit etmek için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, bir floresan mikroskobu ile yapışık hücrelerde hücresel ROS lokalizasyon görselleştirmek ve bir floresan plaka okuyucu ile ROS yoğunluğunu ölçmek. Bu protokol basit, verimli ve uygun maliyetlidir.

2',7'-Diklorodihidrolüorescein Diasetat Boyama ile Yapışık Hücrelerde Toplam Reaktif Oksijen Türlerinin Tespiti

Bu protokol hücre içinde hücre altı bölmesi özgü redoks durumunun değerlendirilmesi açıklanır. Redoksduyarlı floresan prob bozulmamış hücrelerde uygun oranmetrik analiz sağlar.

Hücre altı kompartmana özgü Redoksduyarlı Yeşil Floresan Protein kullanılarak Hücresel Oksidasyonun Değerlendirilmesi

Canlı hücrelerdeki bireysel makropinozomlarda pH, oksidatif olaylar ve protein sindirimi ölçümü için protokolleri açıklıyoruz. Çift florofor oranmetrik mikroskopiye ve nüfusa dayalı tekniklere göre sunduğu avantajlara vurgu yapılır.

Çift Florofor Oranımetrik Mikroskopi kullanılarak Makropinozomların pH, Redoks Kimyaları ve Bozunabilir Kapasitesinin Ölçülmesi

Bu makalede, konfokal canlı mikroskopi kullanılarak primer hipokampal ve kortikal nöronlarda bazal redoks durumundaki farklılıkları ve akut pertürbasyonlara redoks yanıtlarını belirlemek için bir protokol açıklanmaktadır. Protokol, diğer hücre tiplerine ve mikroskoplara minimum değişiklikle uygulanabilir.

Primer Nöronlarda Mitokondriyal Glutatyon Redoksu Durumunun Oranmetrik Gösterge Kullanılarak Canlı Görüntülenmesi

Bu protokol, endojen metabolik koenzimlerin, indirgenmiş nikotinamid adenin (fosfat) dinükleotid (NAD (P) H) ve oksitlenmiş flavin adenin dinükleotidin (FAD) floresan görüntülemesini ve analizini tanımlar. NAD(P)H ve FAD'ın otofloresan görüntülemesi, hücresel metabolizmayı değerlendirmek için etiketsiz, tahribatsız bir yöntem sağlar.

Hücresel Metabolizmayı Değerlendirmek için Otofloresan Görüntüleme

Burada, Müller glial hücrelerinde (MGC'ler) 2′,7′-diklorofloresein diasetat probu (DCFH-DA) kullanarak hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için sistematize, erişilebilir ve tekrarlanabilir bir protokol öneriyoruz. Bu yöntem, bir akış sitometresi ile toplam hücresel ROS seviyelerini ölçer. Bu protokolün kullanımı çok kolaydır, uygundur ve yeniden üretilebilir.

Müller Glial Hücrelerinde 2′,7′-Diklorofloresein Diasetat Probu ve Akış-Sitometri Kullanılarak Reaktif Oksijen Türlerinin Miktarının Belirlenmesi

Bu protokol, yüksek verimli bir tarama yaklaşımı kullanarak bir floresan boya probu olarak dihidroetidyum (DHE) kullanarak hücre içi reaktif oksijen türlerini (ROS) ölçmek için yeni bir yöntemi açıklar. Protokol, üç farklı hepatoselüler karsinom hücre hattında hücre içi reaktif oksijen türlerinin (ROS) kantitatif değerlendirme yöntemlerini açıklar.

Dihidroetidyum (DHE) Floresan Boya Kullanılarak Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Üretiminin Yüksek Verimli Tarama Değerlendirmesi

Etiketsiz optik görüntüleme modalitelerini birleştiren çok modlu bir platform kullanarak, hücresel dinamikleri ve metabolizmayı görselleştirmek ve ölçmek için bir protokol geliştirdik. Çoklu foton floresansı, ikinci harmonik üretimi ve uyarılmış Raman saçılma mikroskobu yoluyla görüntüleme yoluyla, hücresel ve moleküler çevreye bütünsel bir genel bakış oluşturabiliriz.

Hücresel metabolizmayı incelemek için multimodal optik görüntüleme platformu

Öğrenin, yüksek içerikli mikroskopi ile canlı adezyon hücrelerinde ROS düzeyleri ve mitokondriyal morfofonksiyonun eşzamanlı ölçümünü. Bu yöntem, redoks biyolojisi araştırmalarında oksidatif stres ve mitokondriyal sağlık arasındaki ilişkiyi aydınlatır.

Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi

Daha fazla video keşfet