Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi
May 14th, 2017
Bu makale, hücreye nüfuz eden floresan muhabir molekülleri olan canlı yapışık hücrelerde, mitokondriyal membran potansiyeli ve morfolojisinin yanı sıra mitokondriyal morfofonksiyon olarak da adlandırılan, hücre içi ROS seviyelerinin aynı anda ölçülmesi için yüksek içerikli bir mikroskopi iş akışını sunuyor. 5- (ve- 6) -klorometil-2 ', 7'-diklorodihidrofloresan diasetat, asetil ester (CM-H2 DCFDA) ve tetrametilrhodamin metilester (TMRM).
Bu yüksek içerikli mikroskopi tabanlı yöntemin genel amacı, farklı deneysel bozulmalara maruz kalan hücre hatları için sağlam bir redoks parmak izi oluşturmak için mitokondriyal morfofonksiyonu ve reaktif oksijen türlerinin hücresel seviyelerini aynı anda ölçmektir. Bu yöntem, redoks biyolojisindeki patojenik koşulların veya bileşik tedavilerin oksidatif strese neden olup olmadığı ve mitokondriyal form ve fonksiyonun ne ölçüde etkilendiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tüm parametrelerin aynı hücre içinde aynı anda ölçülebilmesidir.
Prosedürü başlatmak için, ince bir sürekli polistiren veya cam tabanlı siyah 96 oyuklu bir plakanın 60 iç kuyusunda sekiz ila 10.000 insan dermal fibroblastını tohumlayın. Farklı koşullar, işlemler veya hücre hatları kullanırken, plaka etkilerini en aza indirmek için tohumlama yerlerini plaka üzerine homojen bir şekilde dağıtın. Daha sonra, odak ayarlaması için kullanılmak üzere B01 kuyusuna sekiz ila 10.000 hücre daha tohumlayın.
Daha sonra, kuyular ve çevre arasındaki gradyanları en aza indirmek için boş dış kuyuları orta ile doldurun. Hücrelerin yamalar halinde büyümesini önlemek için inkübatöre geri yerleştirmeden önce plakaya üç kez hafifçe vurun. Hücreleri 24 saat boyunca veya% 70 birleşmeye ulaşana kadar kültürleyin.
Daha sonra, deney için tedavi bilgilerini kurulum adlı bir elektronik tabloya kaydedin. Mikroskobu kurmak için önce yazılımı kullanarak XY aşamasını kalibre edin. Ardından, edinme yazılımını kullanarak çok kuyulu bir plaka için bir görüntüleme protokolü oluşturun.
Bu protokol, 96 kuyulu bir plakanın ayarlanan pozisyonlarının ve seçilen kuyucuklarının otomatik olarak alınmasına izin verir. Şimdi, yazılım içinde sağlanan mevcut plakalar listesinden doğru çok kuyulu plaka tipini seçin. Alternatif olarak, plaka ve kuyu boyutlarını kullanarak çok kuyulu plaka formatını tanımlayın.
Ardından, dört dış köşe kuyusunun iki köşesini tanımlayarak kuyu plakasını hizalayın. Bunu takiben, edinilmesi gereken kuyuları seçin ve sıralı bir dalga boyu ediniminden oluşan bir edinme protokolü tanımlayın. Önce GFP kanalının ayarlandığından emin olun.
Ardından, tanımlanan edinim protokolünü kullanarak seçilen her kuyunun merkezi etrafında konumlandırılmış, düzenli aralıklarla örtüşmeyen dört görüntü elde etmek için bir kuyu plakası döngüsü tanımlayın. Bu adımda, HBSS HEPES tamponuna CM-H2DCFDA ve TMRM stok çözeltisi ekleyerek 60 kuyu için boyama çözeltisi hazırlanmalıdır. Daha sonra, plakayı tek bir sıvı hareketiyle ters çevirerek kültür ortamını hücrelerden atın.
Hücreleri HH tamponu ile iki kez nazikçe yıkayın. Odak ayarı için kullanılan hücrelerle A01'i iyi unutma. Yıkama adımları arasında HH tamponunu atın.
Ardından, her bir oyuğa 100 mikrolitre boyama solüsyonu ekleyerek hücreleri CM-H2DCFDA ve TMRM ile yükleyin. Yine, A01'i iyi unutma. Hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 25 dakika inkübe edin.
25 dakika sonra, hücreleri 100 mikrolitre HH tamponu ile iki kez yıkayın ve 60 iç kuyucuğun tümüne 100 mikrolitre HH tamponu ekleyin. Gerçek ölçümü gerçekleştirmek için plakayı mikroskobun üzerine takın. Ardından, donanım tabanlı otomatik odaklama sistemini açın ve net bir görüntü elde edene kadar B01 kuyusunu ve TMRM kanalını kullanarak otomatik odaklama ofsetini ayarlayın.
Ardından, görüntüleme protokolünü çalıştırın. Elde edilen görüntü veri seti, bazal ROS seviyeleri, mitokondriyal membran potansiyeli ve mitokondriyal morfoloji hakkında bilgi sağlayacaktır. Daha sonra, indüklenen ROS seviyelerini ölçmek için, 96 oyuklu plakayı mikroskoptan dikkatlice çıkarın.
Her bir oyuğa 40 mikromolar sıcaklıkta 100 mikrolitre TBHP çözeltisi ekleyin ve TBHP'nin CM-H2DCFDA ile tam reaksiyonuna izin vermek için en az üç dakika bekleyin. Bu süre zarfında, A01 kuyusuna 100 mikrolitre antikor çalışma çözeltisi ekleyin. Şimdi, plakayı tekrar mikroskoba monte edin ve B01 kuyusunu kullanarak odağı tekrar kontrol edin.
Ardından, aynı görüntüleme protokolünü kullanarak ilk görüntüleme turundakiyle aynı pozisyonları elde edin. Elde edilen görüntü veri seti, indüklenen ROS seviyeleri hakkında bilgi sağlayacaktır. Ardından, A01 kuyusunda düz alan görüntüleri elde edin.
Sinyallerin dinamik aralık içinde olduğundan emin olun. Edinme ayarlarını değiştirerek. Daha sonra, alınan veri kümelerini standartlaştırılmış terminoloji kullanarak tek bir klasörde ayrı TIFF dosyaları olarak dışa aktarın.
Bu, alt çizgilerle ayrılmış plakaya, TBHP tedavisi öncesi veya sonrasına, kuyuya, alana ve kanala referansı içerir. Ayrıca, standartlaştırılmış terminolojiyi kullanarak düz alan görüntülerini tek tek TIFF dosyalarıyla aynı klasöre kaydedin. Bu adımda, görüntü işleme yazılımını açın ve redoks metrikleri makro setini yükleyin.
Ardından, S düğmesine tıklayarak analiz ayarlarını yapmak için kurulum arayüzünü açın. Görüntü türünü, kanal sayısını ve düz alan görüntülerini almak için kullanılan kuyuyu seçin. Bundan sonra, hangi kanalın hücre veya mitokondri içerdiğini belirtin.
Sırasıyla arka plan çıkarma ve kontrast sınırlı uyarlanabilir histogram eşitlemesi gerçekleştirmek için arka planı işaretleyin ve onay kutularını geliştirin. Daha sonra, gauss ve hücrelerin bulanıklaşması ve mitokondrinin laplacian büyümesi için bir sigma tanımlayın. Otomatik bir eşikleme algoritması seçin ve boyut hariç tutma sınırlarını doldurun.
Ardından, elde edilen veri kümelerinin seçilen birkaç görüntüsü üzerinde segmentasyon ayarlarını, bunları açarak ve sırasıyla hücre veya mitokondri segmentasyonu için menüdeki C veya M düğmelerine tıklayarak test edin. Bunu takiben, hash düğmesine tıklayarak ve görüntülerin bulunduğu klasörü seçerek ilgilenilen klasördeki toplu analizden. Ayarları doğrulayın ve Tamam'a basın.
Toplu analizden sonra, V düğmesine tıklayarak ve görüntülerin bulunduğu klasörü seçerek bir doğrulama yığınındaki segmentasyon performansını görsel olarak doğrulayın. Segmentasyonun başarılı olup olmadığını doğrulamak için doğrulama yığınını gözden geçirin. Çıkarılan verilerin ilk analizi, ücretsiz bir Shiny uygulaması ile otomatik olarak yapılır.
Bu, sonuçların hızlı bir şekilde yorumlanmasını sağlar. Başlamak için uygulamayı R Studio'da açın. Harici bir tarayıcıda çalıştırmayı seçin.
Giriş sayfasında, sonuç dosyalarının bulunduğu dizini seçin. Kurulum dosyasının da bu dizinde bulunduğundan emin olun. Sonuç dosyaları ve kurulum bilgileri otomatik olarak içe aktarılır, derlenir ve görselleştirilir.
Deney kurulum sayfası, deneyin düzenini gösterir. Bir sonraki sayfa, her plaka için ayrı ayrı ROS seviyelerini ve birkaç mitokondriyal parametreyi gösterir. Açılır menüyü kullanarak görselleştirmek istediğiniz plakayı seçin.
Veriler, çok kuyulu plaka formatının yanı sıra, kuyu ve görüntü numarası ile etiketlenmiş aykırı değerlere sahip kutu çizimlerinde gösterilir. Sonuçlar deney sayfasının tamamı, temel bir istatistiksel analizle birlikte tüm plakalardan elde edilen normalleştirilmiş sonuçları gösterir. Giriş sayfası aracılığıyla bir bırakma dosyası sağlanırsa, belirtilen veri noktaları hariç tutulacaktır.
Küme analizi sayfasında, bir temel bileşen ve beş parametreden elde edilen veriler üzerinde analiz kullanılarak hassas bir redoks profili oluşturulur. Son olarak, veri indirme sayfası, işlenen ve yeniden düzenlenen verilerin daha sonra kullanılmak üzere kaydedilmesine izin verir. Burada, insan dermal fibroblastlarının HIV proteaz inhibitörü Saquinavir ile tedavi edildiği bir deneyin sonuçları gösterilmektedir.
Tarif edilen protokolü kullanarak, hem bazal hem de indüklenmiş ROS seviyeleri için önemli bir artış tespit edildi. Kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında, DMSO ile tedavi edilir. Saquinavir ayrıca mitokondriyal morfofonksiyonu da önemli ölçüde etkiledi.
Mitokondriyal piksel başına ortalama TMRM sinyali olarak ölçülen mitokondriyal membran potansiyeli önemli ölçüde artmıştır. Ek olarak, mitokondri, kantitatif olarak daha yüksek bir dairesellik ve daha küçük ortalama bireysel mitokondri boyutu ile gösterilen, oldukça parçalanmış bir model elde etti. Yukarıda belirtilen parametreleri temel bileşen analizi kullanarak birleştirirken, hem kontrol hem de Saquinavir koşulları, redoks parmak izleri ile birbirinden net bir şekilde ayrılabilir.
Bu prosedürü denerken, aydınlatmanın kendisinin oksitlenmiş strese neden olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, maruz kalma koşulları en aza indirilmeli ve deney boyunca sabit tutulmalıdır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bir günde 20.96'ya kadar oyuklu plaka boyanabilir ve elde edilebilir.
İkinci görüntüleme turunu takiben, hücreler sabitlenebilir ve aşağı akış immünofloresan boyama için kullanılabilir. Bu, aynı hücrelerde ölçülen parametrelerin sayısını artırır ve ek soruların yanıtlanmasına izin verir. Bu videoyu izledikten sonra, yüksek içerikli mikroskopi kullanarak yapışık hücre kültürlerinde ROS ve mitokondriyal morfofonksiyonun kombine ölçümlerini gerçekleştirebilmelisiniz.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, canlı yapışkan hücrelerde hücre içi ROS seviyelerinin ve mitokondriyal morfofonksiyonun eşzamanlı kantifikasyonu için yüksek içerikli mikroskopi iş akışını sunar. Bu yöntem, bunu başarmak için hücre geçirgen floresan raporör molekülleri kullanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Redoks Biyolojisi
Arka Plan
- Reaktif oksijen türleri (ROS), hücresel sinyalleşme ve homeostazda kritik bir rol oynar.
- Mitokondri fonksiyonu, oksidatif stres ve hücresel sağlıkla yakından bağlantılıdır.
- Mitokondri morfofonksiyonunu anlamak, çeşitli patolojik durumlar hakkında içgörüler sağlayabilir.
- Yüksek içerikli mikroskopi, hücresel parametrelerin gerçek zamanlı analizini sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Farklı deneysel koşullar altındaki hücre hatları için sağlam bir redoks parmak izi oluşturmak.
- Patojenik koşulların veya tedavilerin oksidatif stres üzerindeki etkilerini araştırmak.
- Aynı hücre içinde mitokondriyal formu ve fonksiyonu eşzamanlı olarak ölçmek.
Kullanılan Yöntemler
- ROS ve mitokondriyal parametreleri kantifiye etmek için yüksek içerikli mikroskopi iş akışı.
- CM-H2DCFDA ve TMRM floresan raporör moleküllerinin kullanımı.
- Analizler için 96 kuyulu plakada insan deri fibroblastlarının ekilmesi.
- Deneyde ayrı bir hücre popülasyonu kullanarak odak ayarlaması.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, ROS seviyeleri ve mitokondriyal fonksiyonun eşzamanlı ölçümüne izin verir.
- Farklı tedavilerin hücresel oksidatif stresi nasıl etkilediği hakkında içgörüler sağlar.
- Tüm parametreler aynı hücrede değerlendirilebilir, bu da veri güvenilirliğini artırır.
- Redoks biyolojisi üzerindeki gelecekteki çalışmalar için bir çerçeve kurar.
Sonuçlar
- Bu yüksek içerikli mikroskopi yöntemi, mitokondriyal morfofonksiyonu incelemek için etkilidir.
- Oksidatif stres ve mitokondriyal sağlık arasındaki ilişkiyi açıklamaya yardımcı olabilir.
- Yaklaşım, çeşitli bağlamlarda redoks biyolojisi araştıran araştırmacılar için değerlidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This high-content microscopy method enables simultaneous quantification of intracellular ROS levels and mitochondrial morphofunction, providing a robust redox fingerprint for cellular health assessment. By measuring multiple parameters within the same cell, it enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking during early discovery. The approach supports data-driven go/no-go decisions by linking oxidative stress responses to mitochondrial function in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by establishing redox fingerprints that differentiate cellular states after chemical perturbation.
- Operational Value: Enables functional target validation through correlated ROS and mitochondrial membrane potential measurements in live cells.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by detecting subpopulation heterogeneity via multivariate analysis of ROS, mitochondrial morphology, and membrane potential.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows using automated widefield fluorescence microscopy in multi-well plates.
- Quantitative Outputs: Delivers high spatiotemporal resolution data on basal and induced ROS levels, mitochondrial membrane potential, and morphology for compound screening.
- Platform Reuse: Enables scalable, reproducible screening campaigns with standardized image acquisition and analysis protocols across cell lines and treatments.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses human dermal fibroblasts to model oxidative stress responses, providing a translatable system for preclinical target validation.
- Mechanistic De-risking: Links compound-induced ROS elevation to mitochondrial fragmentation and membrane potential changes, clarifying pathophysiological interconnections.
- Translational Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by generating multivariate redox profiles that correlate with cellular health outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling mechanistic de-risking before preclinical investment by establishing causal links between redox state and mitochondrial function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how pathogenic conditions or treatments affect oxidative stress and mitochondrial form/function in the same cell.
- Screening: Delivers assay readiness through automated acquisition of ROS and mitochondrial parameters, ensuring reproducible quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of conditions via principal component analysis on five parameters, generating sensitive redox profiles for subpopulation discrimination.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by aligning redox fingerprints with mitochondrial morphofunction changes relevant to pathological conditions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for redox profiling across diverse adherent cell types, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through simultaneous ROS and mitochondrial measurement.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via automated microscopy and standardized image analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking oxidative stress biomarkers to mitochondrial health, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through multivariate redox profiling that detects treatment-induced cellular state changes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in high-content microscopy, fluorescent probe handling, and image-based data analysis.
- Needs widefield fluorescence microscopy with environmental control, autofocus, and multi-well plate compatibility.
- Demands cross-team standardization of staining protocols, acquisition settings, and analysis macros for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for non-adherent or primary cell types beyond human dermal fibroblasts.
- Includes practical limitations such as phototoxicity from illumination, necessitating minimized and constant exposure conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
10:38
Conclusion
9:35
Results: Effect of Saquinavir on Primary Human Fibroblasts
0:47
Seeding Cells in a 96-well Plate
1:48
Setting Up the Microscope and Acquisition Protocol
3:10
Loading of the Cells with CM-H2DCFDA and TMRM
4:18
First and Second Live Imaging Rounds
6:22
Image Processing and Analysis
