Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Bu protokolün genel amacı, Floresan Işık Sayfası Mikroskopisi ile lökositik kardiyak infiltrasyonun tüm organ görselleştirmesi için, indüklenmiş kardiyak aritmiye sahip bir fare kalbini kimyasal olarak şeffaflaştırmaktır. Bu yöntem, tüm organ araştırmaları alanında, protezler ve yapılar hakkında hücresel çözünürlük düzeyindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tüm organlardaki inflamasyonun hem miktarının belirlenmesine hem de lokalizasyonuna olanak tanımasıdır.

Nörolojik protezler hakkında ayrıntılı bilgiler sunuyoruz. Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, depleksiyona bağlı modülde kardiyak aritminin hücresel açıklamalarını belirlemek için bir görselleştirme aracına acil ihtiyaç duyduğumuzda ortaya çıktı. Sekiz ila 10 haftalık bir farenin kalbi açığa çıkarıldıktan sonra, 21 gauge bir kateter kullanarak sağ ventriküle giriniz.

Kanın boşalmasını sağlamak için aortu kesin ve ardından yavaş ve sabit bir basınçla beş mililitre PBS artı EDTA ile perfüzyon yapın. PBS EDTA'nın ardından beş mililitre %4 paraformaldehit uygulayın. Perfüzyonun sonunda, fiksasyon yapılmış kalbi nazikçe tutmak için tırtıklı pens kullanın ve tüm doku bağlantılarını kesmek için organı hafifçe yukarı doğru çekin.

Giriş ve çıkış arterleri ile venleri dahil edin. Ardından, kalbi daha ileri fiksasyon için taze %4 PFA içerisinde dört saat boyunca saklayın. Dokuyuyehidrate etmek için kalbi, hava kabarcığı oluşumunu önlemek amacıyla bir tüp rotatöründe sabit yavaş rotasyonla, karanlıkta, beş mililitrelik siyah polipropilen reaksiyon tüpleri içinde artan etanol serisinde inkübe edin.

Ardından, dokuyu sabit rotasyonla gece boyunca %98 dibenzil eter inkübasyonu ile şeffaflaştırın. Işık Sayfası Floresan Mikroskopisi gerçekleştirmek için, öncelikle örneği sabit tutmak amacıyla standart örnek tutucuyay dehidrate agaroz bloklar yerleştirin. Daha sonra örneği örnek tutucuya aktarın.

Ardından, numune tutucuyu uygun boyutlarda, dibenzil eterle doldurulmuş bir küvete aktarın. İlgilenilen floresan sinyallerini tespit etmek için uygun eksitasyon ve emisyon filtre ayarlarını kullanın. Dolayısıyla, görüntüleme sırasında gölgelenme etkilerini en aza indirmek için numunenin doğru konumlandırılması ve sabitlenmesi temel önem taşımaktadır.

Ayrıca, gevşek bir örnek, işlem sonrası aşamada aydınlatılması zor olan hareket artefaktlarına neden olabilir. Tüm görüntüler elde edildikten sonra, uygun 3D ve 4D görüntü işleme analiz yazılımını açın ve surpass'ı seçin. Dosya ve aç seçeneklerini belirleyerek, görüntü yığınlarını açmak için ilk elde edilen kanaldan gelen verileri içeren klasörü seçin.

Uygun şekilde elde edilmiş floresan kanal verilerini eklemek için düzenle ve kanalları ekle seçeneklerini belirleyin. Ardından, x, y ve z voksel boyutlarını düzeltmek için düzenle ve görüntü özellikleri seçeneklerine tıklayın. Yeni açılan penceredeki parametreleri ayarlayın.

Floresan sinyalleri ayarlamak için önce düzenleme menüsünü açın ve görüntü ayarlarını göster seçeneğini seçin. Açık olan tüm kanalları gösteren yeni bir pencere açılacaktır. Otofloresan kanalını gri tonlamalı hale getirmek için otofloresan kanalını seçin, beyaz görüntü stilini belirleyin ve tamam'a tıklayın.

Ardından, ızgarayı kaldırarak görünümü ayarlayın. Sonra, yakınlaştırın ve bir kanalı seçimden çıkarın. Daha sonra, örnek yapılarını temsil etmeyen istenmeyen arka plan sinyallerini hariç tutmak için siyah seviye değerini, sinyal yoğunluğunu ve kontrastı ayarlayın.

Antikor kanalını, revize edilmiş otofloresans kanalı sinyaline göre ayarlayın. Kanal modunu ayarlayarak, antikor sinyalinin görselleştirmesini bir ısı haritası renk bakma tablosuna getirin. Ardından, doku yapılarını ayrıntılı olarak görselleştirmek için harmanlama modunu seçin.

3B sahne dışa aktarımı öncesinde organı sanal olarak kesip açmak için, nesne listesindeki kırpma düzlemi simgesini seçin. Görüntü görünümünde sarı bir çerçeve ve beyaz bir mil manipülatörü belirecektir. Kırpma düzleminin yönünü değiştirmek için fareyi kullanarak milin ince ucunu döndürün ve istenen kırpma derinliğini seçmek için milin daha kalın olan orta kısmını hareket ettirin.

Ardından, çerçeveyi ve manipülatörü gizlemek için ilgili onay kutularının işaretini kaldırın ve istenen anlık görüntüleri oluşturun. İki floresan kanal sinyalinden oluşan tüm bir görüntü yığınının elde edilmesi, lökosit dağılımının bir ısı haritası görünümünde görüntülendiği yapay bir 3D oluşturma sağlar. Difteri toksini ile tedavi edilmiş bir hayvanın kalbindeki şiddetli iltihaplı bölgeler, kırmızımsı ve beyazımsı görünümlerinden fark edilebilir.

Özellikle atriyoventriküler demet ve Purkinje lifleri gibi kardiyak ileti sistemi bölgelerinde görülmektedir. Buna karşılık, kontrol grubu olarak PBS ile tedavi edilen hayvanların kalpleri bu inflamasyon paternini göstermez. Bu teknik bir kez uzmanlık düzeyinde öğrenildiğinde, hedef organın hasat edilmesinden bilgisayar destekli görüntülenmesine kadar olan sürecin dört ila beş gün içinde dijital analize hazır hale getirilmesine olanak tanır.

Bu teknik geliştirildikten sonra, emmenoloji alanındaki araştırmacıların tüm fare organlarındaki hücresel dağılım modellerini incelemelerinin önünü açmıştır. Bu durum, çeşitli patofizyolojik hastalık protezlerinin analizinde ve tedavisinde fayda sağlayabilir. Bu videoyu izledikten sonra, tüm fare organlarının Floresan Işık Sayfası Mikroskobisi (Fluorescence Light Sheet Microscopy) için nasıl hazırlanacağı ile 3D veri yığınlarının nasıl oluşturulacağı ve işleneceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.