Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi
31 Mayıs 2017
Burada, CD11c.DTR farelerinin intratrakeal difteri toksini tedavisi ile indüklenen, bir aseptik fulminan miyokardit modelinde kardiyak CD45 + lökosit infiltrasyonunu görselleştirmek için bir ışık-tabakalı mikroskopik yaklaşım anlatılmaktadır.
Bu protokolün genel amacı, Floresan Işık Tabakası Mikroskobu ile lökositik kardiyak infiltrasyonun tüm organ görselleştirmesi için indüklenmiş bir kardiyak aritmi ile bir farenin kalbini kimyasal olarak temizlemektir. Bu yöntem, hücresel çözünürlük düzeyinde protez ve yapılar hakkında tüm organ araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tüm organlardaki iltihabın hem ölçülmesine hem de lokalizasyonuna izin vermesidir.
Nörolojik protez içine detaylı iç kısımların verilmesi. Bu yöntem için ilk olarak, tükenme modülündeki kardiyak aritmi için hücresel açıklamaları tanımlamak için acil bir görselleştirme aracına ihtiyaç duyduğumuzda aklımıza geldi. Kalbin sekiz ila 10 haftalık bir fareden açığa çıkmasından sonra, 21 gauge kateter kullanın ve sağ ventriküle nüfuz edin.
Kan drenajına izin vermek için aortu kesin ve ardından yavaş bir sabit basınçla beş mililitre PBS artı EDTA ile perfüze edin. PBS EDTA'yı beş mililitre% 4 paraformaldehit ile takip edin. Perfüzyonun sonunda, sabit kalbi nazikçe kavramak için tırtıklı forseps kullanın ve tüm doku bağlantılarını kesmek için organı hafifçe yukarı doğru çekin.
Gelen ve giden arterler ve damarlar dahil. Ardından, daha fazla fiksasyon için kalbi dört saat boyunca taze% 4 PFA'da saklayın. Dokuyu kurutmak için, hava kabarcığı oluşumunu önlemek için kalbi artan bir etanol serisinde, karanlıkta siyah beş mililitre polipropilen reaksiyon tüplerinde, bir tüp döndürücü üzerinde sürekli yavaş dönüşle inkübe edin.
Ardından, dokuyu gece boyunca sabit rotasyonla %98 dibenzil eter inkübasyonu ile temizleyin. Işık Tabakası Floresan Mikroskobu yapmak için, numuneyi yerinde tutmak için önce susuz agaroz bloklarını standart numune tutucusuna yerleştirin. Ardından, numuneyi numune tutucuya aktarın.
Ardından, numune tutucuyu uygun boyutta dibenzil eter dolgulu bir küvete aktarın. İlgilenilen floresan sinyallerini algılamak için uygun uyarma ve emisyon filtresi ayarlarını kullanın. Bu nedenle, görüntüleme sırasında gölgeleme etkilerini en aza indirmek için numunenin doğru konumlandırılması ve sabitlenmesi esastır.
Ayrıca, gevşek bir numune, işlem sonrası aydınlatılması zor olan hareketli artefaktlara neden olabilir. Tüm görüntüleri gerektirdikten sonra, uygun 3B ve 4B görüntü işleme analiz yazılımını açın ve aş'ı seçin. Dosyayı seçin ve açın ve görüntü yığınlarını açmak için ilk alınan kanaldan verileri içeren klasörü seçin.
Alınan uygun floresan kanal verilerini eklemek için düzenle ve kanal ekle'yi seçin. Ardından, x, y ve z voksel boyutlarını düzeltmek için düzenle'ye tıklayın ve görüntü özelliklerini seçin. Yeni açılan penceredeki parametrelerin ayarlanması.
Floresan sinyalleri ayarlamak için önce düzenleme menüsünü açın ve ekran ayarını göster'i seçin. Yeni bir pencere, tüm açık kanalları çok gösterir. Otomatik floresan kanalını gri tonlamalı olarak değiştirmek için, otomatik floresan kanalını seçin, beyaz görüntü stilini seçin ve Tamam'ı tıklatın.
Ardından, ızgarayı kaldırarak görünümü ayarlayın. Ardından, bir kanalı yakınlaştırın ve seçimini kaldırın. Ardından, örnek yapıları, sinyal yoğunluğunu ve kontrastı temsil etmeyen istenmeyen arka plan sinyallerini hariç tutmak için siyah düzeyi değerini ayarlayın.
Antikor ayakta durma kanalını, revize edilmiş otofloresan kanal sinyaline göre ayarlayın. Kanal modunu ayarlama, antikor sinyalinin görselleştirilmesini bir ısı haritası renk arama tablosuna ayarlamak için ateşleyin. Ardından, doku yapılarını ayrıntılı olarak görselleştirmek için karışım modunu seçin.
Organı sanal olarak kesmek için, 3B sahne dışa aktarmadan önce, nesne listesinden kırpma düzlemi simgesini seçin. Görüntü görünümünde sarı bir çerçeve ve beyaz bir mil manipülatörü görünecektir. Kırpma düzleminin yönünü değiştirmek için mili daha ince uçta döndürmek, ve istenen kırpma derinliğini seçmek için milin daha kalın orta kısmını hareket ettirmek için fareyi kullanın.
Ardından, çerçeveyi ve manipülatörü gizlemek ve istenen anlık görüntüleri oluşturmak için ilgili onay kutularının işaretini kaldırın. İki floresan kanal sinyalinden oluşan tüm bir görüntü yığınının elde edilmesi, lökosit dağılımının bir ısı haritası görünümünde görüntülendiği yapay bir 3D oluşturma ortaya çıkarır. Difteri toksini ile tedavi edilen bir hayvanın güçlü iltihaplı kalp bölgeleri, kırmızımsı, beyazımsı görünümleriyle algılanabilir.
Özellikle atriyal ventriküler demet ve Purkinje lifleri gibi kardiyak iletim sistemi bölgelerinde. Buna karşılık, kontrollü PBS ile tedavi edilen hayvanların kalpleri, bu iltihaplanma modelini göstermez. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, bir hedef organın hasadından bilgisayar destekli rendifikasyonuna kadar dört ila beş gün içinde dijital olarak hazır analizine izin verir.
Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, emmenoloji alanındaki araştırmacıların, tüm fare organlarındaki hücresel dağılım modellerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu yaştaki çeşitli patofizyolojik hastalıkların analiz ve tedavisinde protez kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, Floresan Işık Levha Mikroskobu için tüm fare organlarının nasıl hazırlanacağını ve 3D veri yığınlarının nasıl oluşturulacağını ve işleneceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, aseptik fulminan miyokarditin murin modelinde kalp CD45 + lökosit infiltrasyonunu görselleştirmek için bir ışık sayfası mikroskopi yaklaşımını açıklar. Yöntem, hücresel çözünürlük seviyesinde enflamasyonun tüm organ görselleştirmesini ve kantifikasyonunu sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Kardiyoloji
- Immunoloji
Arka Plan
- Aseptik fulminan miyokardit, önemli lökosit infiltrasyonu ile karakterizedir.
- Kardiyak aritminin arkasındaki hücresel mekanizmaları anlamak çok önemlidir.
- Işık sayfası mikroskopi, tüm organlar için yeni bir görselleştirme tekniği sunar.
- Bu çalışma, bu mekanizmaları araştırmak için bir murin model kullanır.
Çalışmanın Amacı
- Lökositik infiltrasyonun görselleştirilmesi için kalbin kimyasal olarak temizlenmesi.
- Enflamasyon ve kardiyak aritmi arasındaki ilişkiyi araştırmak.
- Kardiyak durumlar için potansiyel tedavi yaklaşımları hakkında bilgiler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Diphteria toksini kullanarak CD11c.DTR farelerinde kardiyak aritminin indüksiyonu.
- Sağ ventriküle penetrasyon için 21 gauge kateter kullanımı.
- Görüntüleme için Floresan Işık Sayfası Mikroskopisini uygulama.
- Detaylı analiz için tüm organ görselleştirme teknikleri.
Ana Sonuçlar
- Kalpte CD45 + lökosit infiltrasyonunun başarılı görselleştirilmesi.
- Kardiyak dokularda enflamasyon lokalizasyonunun tanımlanması.
- Kardiyak aritminin hücresel temeline dair bilgiler.
- Tüm organ çalışmalarında ışık sayfası mikroskopinin etkinliğinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Işık sayfası mikroskopi yaklaşımı, kardiyak enflamasyonu incelemek için etkilidir.
- Bu yöntem, miyokardit içinde lökositlerin dinamiklerini anlamak için anlamayı artırır.
- Bulgular, kardiyak tedaviler hakkında gelecekteki araştırmalara bilgi verebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables whole-organ visualization and quantification of leukocyte infiltration in a murine myocarditis model, providing a scalable approach to de-risk inflammatory mechanisms in cardiac drug discovery. By combining light-sheet microscopy with chemical clearing, it supports target validation through spatial immune cell mapping in disease-relevant systems. The method enhances predictive confidence in early discovery by linking histological inflammation patterns to functional arrhythmia phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing CD45+ leukocyte localization in inflamed cardiac tissue.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative immune cell mapping in a validated fulminant myocarditis model.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by correlating leukocyte infiltration density with arrhythmia outcomes in Diphtheria toxin-treated animals.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares cleared whole-mouse hearts for standardized, reproducible imaging workflows compatible with automated image analysis.
- Quantitative Output: Generates 3D fluorescence datasets enabling measurement of leukocyte density and distribution as a pharmacodynamic readout.
- Scalability: The clearing and imaging pipeline allows batch processing of multiple organs for comparative compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses a transgenic model that recapitulates lethal arrhythmia-driven myocarditis, aligning with human pathophysiological mechanisms.
- Translational Continuity: Enables longitudinal tracking of immune infiltrate from discovery through preclinical efficacy studies.
- Mechanistic De-risking: Links spatial inflammation patterns to cardiac conduction system involvement, informing target selection for anti-inflammatory therapies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical assessment, offering a bridge between phenotypic screening and mechanistic follow-up in immunocardiology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing immune cell infiltration in whole organs without sectioning artifacts.
- Screening: Enables assay standardization through consistent tissue clearing, staining, and imaging parameters across experimental groups.
- Analytics: Provides quantitative 3D readouts of leukocyte distribution that facilitate cross-condition comparison and hit validation.
- Translational Research: Connects early immune phenotypes to preclinical outcomes by preserving anatomical context of inflammation in the cardiac conduction system.
- Enterprise Reuse: Represents a modular platform adaptable to other fluorescent targets and organs beyond cardiac immunology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in inflammatory mechanism attribution.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible whole-organ imaging with minimal user-dependent variability post-clearing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing spatially resolved inflammation data linked to functional cardiac endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on leukocyte infiltration profiles in disease-relevant tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue clearing, immunofluorescence staining, and light-sheet microscopy operation.
- Depends on access to LSFM systems, chemical clearing agents (e.g., dibenzyl ether), and 3D image analysis software.
- Necessitates standardization of perfusion, fixation, and staining protocols across laboratories for cross-team reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the clearing protocol to non-cardiac organs or different fluorescent labels.
- Limited by the need for transgenic models and perfusion-based tissue preparation, which may not suit high-throughput primary screening.
