Name: Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir Mycobacterium tuberculosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Keşfedin, 96 kuyucuklu plaka formatında makrofaj agregatları oluşturarak Mycobacterium tuberculosis'e karşı ilaç duyarlılık testi yapma yöntemini. Bu BSL-2 uyumlu, yüksek verimli tarama assay, tüberküloz ilaç geliştirme sürecini iyileştirir ve in vivo etkinliği daha iyi tahmin eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cytation 3 otomatik görüntüleme plakası okuyucusuna erişim için Dr. Frank Wolschendorf'a teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen NIH hibesi R01-AI104499 tarafından OK'ye finanse edildi. İşin bir kısmı UAB CFAR tesislerinde ve NIH/NIAID P30 AI027767 ve NIH 5P30 AR048311 tarafından finanse edilen UAB CFAR Akış Sitometrisi Çekirdeği/Ortak UAB Akış Sitometrisi Çekirdeği tarafından gerçekleştirildi.

NOT: 2 6206 bir avirulent suşu 17, 18 M. tuberculosis mc gibi, bu protokoldeki tüm çalışma Biyogüvenlik Seviye 2 tesis (BSL-2) yapılabilir. M. tuberculosis mc 2 ifade Yeşil Floresan Protein 1. Kültür koşulları 6206 (Mtb GFP) NOT: M. tuberculosis H37Rv auxotroph suşu 6206 mc 2 türetilmiş (Δ panCD, Δ leuCD) plazmid pMN437 ifade GFP bu protokol 16 boyunca kullanılır ile dönüştürdü. Olmayan GFP araştırmacılar için gerginlik daha kolay erişilebilirliği sağlamak için yabani tip gerginlik ifade ile Mtb GFP gerginlik yerine mümkündür. Bununla birlikte, GFP tanımı fagositozu ve Mtb / makrofaj agregaların oluşumunun görsel onay sağlamak için arzu edilir. long süreli depolama, Mtb GFP% 20 gliserol ile desteklenmiş (adım 1.1 tarif edilmiştir) eksiksiz 7H9 ortamında -80 ° C&#39;de dondurulmuştur. <ol><li> % 10 Middlebrook OADC,% 0.02 tiloksapol 24 ug / mL D-pantotenik asit, 50 ug / ml L-lösin ve 50 ug / ml Higromisin B ile 7H9 ortamında ilave tamamlandığını Mtb GFP ortamı (7H9-C) hazırlanması </li><li> Mtb GFP bir şişe çözülme ve 30 ml kare alt PETG şişede 7H9-C 10 mL ekle. </li><li> Döner bir çalkalayıcı (50 rpm) ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. Optik yoğunluk ölçümleri (OD 600) birkaç günde OD 600 1.0 (yaklaşık 5-8 gün) ulaşıncaya kadar atın. </li><li> Bir OD 0.2-1.0 arasında 600 korumak için gerektiği gibi sulandırmak ve geçit kültürü. </li><li> Enfeksiyon için, logaritmik büyüme fazı (OD 0.6-1 600) içinde Mtb GFP kurulmuş bir kültür kullanın. Clumpy kültürleri önlemek için, bir su banyosu içinde Mtb kültür şişesi sonikasyon (130 W; 3 x 5 s darbe) ONCE veya haftada iki kez </li></ol> 2. Kültür Koşulları THP-1 hücreleri <ol><li> % 10 ısı ile etkisiz hale getirilen fötal sığır serumu, 2 mM L-glutamin ve 10 mM HEPES ile RPMI 1640 ortamı ilave etmek suretiyle tamamlandı, THP-1 hücre ortamı (RPMI-C) hazırlayın. </li><li> % 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de bir T-75 balonuna hücreleri inkübe edin. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın veya gün aşırı akış sitometrisi ve 0.1 mL başına milyon 0.6 arasında bir yoğunlukta THP-1 hücreleri korumak. </li></ol> 3. Enfeksiyon Protokol Mtb / Makrofaj Agrega Yapıları oluşturmak için <ol><li> THP-1 hücre preparasyonu (96 oyuklu plaka başına) <ol><li> 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüjleyin 7 x 10 6 THP-1 hücreleri. 7 ml RPMI-C süspanse. </li></ol></li><li> Mtb GFP hazırlık <ol><li> Santrifüj 2.8 x 10 8 Mtb GFP sallanan kovası santrifüj 3200 xg 5 dakika süreyle uOD 600, 1.0 = 3 x 10 8 bakteri / ml arasında bir dönüşüm şarkı. </li><li> Adım 3.2.1 olarak RPMI-C ve santrifüj ile bir kez yıkayın. </li><li> 10 s 7 ml RPMI-C süspanse ve vorteks. </li></ol></li><li> enfeksiyon NOT: Şablon için Şekil 1&#39;e bakınız. <ol><li> kültür ortamının buharlaşmasını önlemek için bir su ağız için satırlar A ve H ve sütun 1 ve 12, steril su, 200 uL eklenmesiyle 96 oyuklu bir plaka hazırlanması. </li><li> Arka plan kontrolü (Boş) sütununda 2 (G2 B2) 200 ul RPMI-C ekleyin. </li><li> Bulaştırmak için, THP-1 hücre süspansiyonu (adım 3.1) Mtb GFP süspansiyon (adım 3.2) ekleyin ve pipetleme iyice karıştırın. Nihai THP-1 hücre yoğunluğu mL başına 5 x 10 5 ve enfeksiyonun gelen çokluğu 40. </li><li> 25 ml rezervuar içine THP-1 / Mtb GFP süspansiyon dökün. </li><li> (G11 yoluyla B3), THP-1 kalan 96 oyuklara / MTB GFP süspansiyonu 200 uL usin eklemega çok kanallı pipet. Not: birden çok 96 oyuklu plakalar çalışma durumunda, düzenli daha kanşım her bir göze ilave edilir sağlamak için rezervuar içinde kalan, THP-1 / MTB süspansiyon tekrar süspansiyon. </li><li> 7-10 gün süreyle% 5 CO2 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> yavaş yavaş 100 çıkararak her 2 günde bir ortam değiştirme uL 100 uL, çok kanallı bir pipet kullanılarak, RPMI-C önceden ısıtılmış eklenmesi de yavaşça her birinin en ortam geçirdi. Kuyu tekrar süspansiyon ve kuyu dibinde Mtb / makrofaj agrega rahatsız etmeyin. </li><li> Görme Mtb / makrofaj agrega büyüklüğü dikkate alınarak, günlük floresan mikroskobu (4-10X objektif) tarafından kuyuları incelemek. Günün 7-10 tarafından, Mtb / makrofaj agrega yeterince büyük olmalıdır ilaç etkinlik testleri (Bölüm 4) için devam etmek (referans için Şekil 2&#39;ye bakınız). </li><li> İstenirse, bir otomatik hücre görüntüleme sistemi kullanılarak 96-kuyuların yakalama görüntüleri monteparlak bir alan ve GFP filtresi ile Mtb / makrofaj agrega oluşumu belgelemek için ayarlar. NOT: Kullanıcıların otomatik görüntüleme sistemine erişimi yoksa, temsilci kuyuların görüntüleri GFP ve parlak bir alan yetenekleri ile herhangi bir uygun mikroskop kullanılarak alınabilir. </li></ol></li></ol> 4. Büyüme İnhibisyon Tahlili Mtb / Makrofaj Agrega türetilen Uyuşturucu Etkinlik Karşı MTB Değerlendirmek için <ol><li> İlaç hazırlama (iki ilaç için üçlü koşullar) NOT: Şablon için Şekil 1A bakınız. <ol><li> Ayrı 96 oyuklu bir plaka içerisinde, G10 üzerine B2&#39;ye 7H9-Cı ortamın 125 uL ekleyin. </li><li> Aşama 4.2.4 seyreltmeden dolayı 7H9-C 1 mL çift en arzu edilen nihai konsantrasyonda iki ilaç hazırlanması. </li><li> üçlü tedaviler için sırasıyla kuyulara B11-C11-D11 ve E11-F11-G11 her ilacın 250 mcL ekleyin. </li><li> Çok kanallı bir pipet kullanılarak, seri Dilute testi ilaçlar B10-G10 içine B11-G11 125 uL hareket ettirerek iki kat. Her adımda 5 kez pipetleme karıştırın. </li><li> plaka üzerinde (sağdan sola) sütun sütun 125 uL taşımak ve sütun 4 sonra durdurmak için devam edin. </li><li> sütunu 4 karıştırıldıktan sonra, bir atık kabı içine 125 uL atın. Sütunlar 2, 3 arka plan (boş) ve pozitif bir büyüme kontrol olarak kullanmak için izin vermek için herhangi bir ilaç içermemelidir. Alternatif test ilaç kütüphaneleri için Şekil 1B şablonu izleyin: Not. Her 96 oyuklu plaka tek bir konsantrasyonda 58 ilaçları verebilir. bu adımda 4.2.4 yarı yarıya seyreltilmiş olacağından çift arzu edilen nihai konsantrasyonu kullanılarak bu ilaç tabak hazırlayın. </li></ol></li><li> İlaç tedavisi: <ol><li> MTB ihtiva eden 96 oyuklu plaka makrofajlar (MTB / makrofaj agregalar) ile enfekte al. </li><li> Dikkatle çok kanallı pipet ile ilgili tüm kuyular (G11 yoluyla B2) süzün.iki adımlı bir şekilde bu gerçekleştirin: ilk plaka eğmeden 150 uL kaldırın ve ardından plakayı devirme ve iyi alt kenarına pipet takarak kalan medya (~ 50 uL) çıkarın. Makrofaj Mtb / agrega, çukurun tabanına yapışık olarak, önemli bir yok olması gerekmektedir. </li><li> Yavaşça Mtb / makrofaj toplulukları ihtiva plakanın ilgili tüm kuyular (G11 ile B2) 7H9-C medya 100 mcL ekleyin. </li><li> Çok kanallı bir pipet kullanılarak, enfeksiyon levhanın tekabül eden gözleri 96 oyuklu plaka (aşama 4.1) ihtiva eden bir ilaç kupasında 100 uL aktarın. </li><li> kapalı torbada yer ve 37 ° C &#39;de 3 gün boyunca inkübe edilir. </li></ol></li></ol> Resazurin microtiter Test kullanma Niceleme İlaç Etkinliğinin 5. <ol><li> 0.8 mg nihai konsantrasyonda stok solüsyonu resazurin Hazırlama / ml H 2 O. sterilizasyon için 0.22 um gözenek boyutlu PVDF zarından filtre.</li><li> 1: 1 oranında bir 2 resazurin stok solüsyonu, H2O ve Tween-80 (H 2 O içinde% 20 çözelti) karıştırılarak çalışma çözeltisi resazurin hazırlayın. Nihai konsantrasyon 0.4 mg / mL resazurin ve% 5 Tween-80 bulunmaktadır. </li><li> Bir plaka okuyucusu, kurulum 530 nm&#39;de uyarma ve 590 nm&#39;de emisyonla 37 ° C&#39;de 24 saat süre ile, her 30 dk floresan okumak için bir programı kullanarak. 37 ° C&#39;ye kadar ön-sıcak plaka okuyucu. </li><li> Çok kanallı bir pipet kullanılarak ilaç tedavi plaka (aşama 4.11) ilgili tüm oyuklara (G11 ile B2) resazurin çalışma çözeltisinin 20 uL ekleyin. </li><li> plaka okuyucu üzerinde plakası yerleştirin ve adım 5.3 kurmak programını başlatın. Not: deney plakası, yüksek hacimli işlenmesini kolaylaştırmak için, 37 ° C kuluçka makinesi içinde bir analiz geliştirmek, tek flüoresan 24 saatte bir okuma yapmak için yeterlidir. Bu aynı zamanda kinetik ve inkübasyon özelliklerine sahip bir plaka okuyucu erişimi olmayan kullanıcılar için geçerlidir. </li></ol>

<ol><li>Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+seven+decades+of+antituberculosis+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery.</a> Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).</li>
<li>Bass, J. B. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+tuberculosis+and+tuberculosis+infection+in+adults+and+children.+American+Thoracic+Society+and+The+Centers+for+Disease+Control+and+Prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention.</a> Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).</li>
<li>Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+new+drug+discovery+for+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The challenge of new drug discovery for tuberculosis.</a> Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).</li>
<li>Palomino, J. C., Martin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMC207+becomes+bedaquiline%2C+a+new+anti-TB+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug.</a> Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).</li>
<li>Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+for+early-stage+tuberculosis+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The future for early-stage tuberculosis drug discovery.</a> Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).</li>
<li>Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+anti-tuberculosis+drug+efficacy%3A+rethinking+bacterial+populations+and+how+we+model+them%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them.</a> Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).</li>
<li>Ekins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+back+to+the+future%3A+predicting+in+vivo+efficacy+of+small+molecules+versus+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Inf+Model%22%5BJournal%5D)">Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis.</a> J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).</li>
<li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2%27+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathog. 5 (10), e1000645(2009).</li>
<li>Hartkoorn, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+drug+susceptibility+of+intracellular+and+extracellular+tuberculosis%2C+and+the+impact+of+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein.</a> Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).</li>
<li>Queval, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscopic+phenotypic+assay+for+the+quantification+of+intracellular+mycobacteria+adapted+for+high-throughput%2Fhigh-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening.</a> J Vis Exp. (83), e51114(2014).</li>
<li>Sorrentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intracellular+screen+for+new+compounds+able+to+inhibit+Mycobacterium+tuberculosis+growth+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).</li>
<li>Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+drug+uptake+in+phenotypically+resistant+nutrient-starved+nonreplicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).</li>
<li>Dutta, N. K., Karakousis, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+duration+of+tuberculosis+treatment+be+shortened+with+higher+dosages+of+rifampicin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin?</a> Front Microbiol. 6, 1117(2015).</li>
<li>van Ingen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+Do+We+Use+600+mg+of+Rifampicin+in+Tuberculosis+Treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment?</a> Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).</li>
<li>Donald, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+concentrations+of+antituberculosis+agents+in+adults+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children.</a> Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).</li>
<li>Schaaf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Macrophage+Infection+Model+to+Predict+Drug+Efficacy+Against+Mycobacterium+Tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis.</a> Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).</li>
<li>Sampson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+elicited+by+a+double+leucine+and+pantothenate+auxotroph+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs.</a> Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).</li>
<li>Jain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+transduction+designed+for+precise+high-throughput+unmarked+deletions+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis.</a> MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).</li>
<li>Davis, J. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+granuloma+in+expansion+and+dissemination+of+early+tuberculous+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection.</a> Cell. 136 (1), 37-49 (2009).</li>
<li>Collins, L., Franzblau, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+alamar+blue+assay+versus+BACTEC+460+system+for+high-throughput+screening+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis+and+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium.</a> Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).</li>
<li>Snewin, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada, ayrıntılı olarak ilaç etkinlik testleri için uygun bir alternatif Mtb enfeksiyonu modeli tarif var. Bu model hesabına erken TB ilaç geliştirme sürecinde daha fazla dikkate alınmalıdır iki önemli faktör dikkate alır: ilaç penetrasyonu ve enfeksiyon sırasında Mtb metabolik değişikliklere fizyolojik ilgili engellerin varlığı. Daha önce bizim enfeksiyon modelinin yararları gösterilmiştir ve verimlilik uyumluluğu 16 enfeksiyon ölçekleme olasılığını önerdi ederken, biz burada ...

<html> Tüberküloz (TB) 40 yılı aşkın 1 TBC kemoterapi rejimlerinin varlığına rağmen ciddi bir küresel sağlık tehdidi olmaya devam etmektedir. Bu uyumsuzluğu 2 hastaya neden çoklu ilaç kombinasyonları kullanılarak 6 aydan uzun tedavi dönemleri için gereksinimi, kısmen kaynaklanmaktadır. Klinik onaylı ilaçların başarılı gelişimi 3 neredeyse varolmayan olduğu son yıllarda ilaca dirençli TB çıkması ayrıca bir alanda sorunları bileşik etti. Nitekim, ayrıntılı bir anti-TB ilaç geliştirme rağmen, sadece tek bir ilaç FDA son 40 yılda 4 klinik kullanım için onaylanmıştır olmuştur. Bu nedenle, anti-TB ilaçların yeni nesil acilen bu sorunu çözmek için ihtiyaç vardır. TB ilaç keşfinde önemli bir sorun klinik ortamda etkinliğine in vitro aktiviteye sahip bileşikler başarılı transfer olmaması= &quot;xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Başlangıçta, hedef bazlı yaklaşımlar tam bakteriyel hücrelere çevirmek için başarısız anti-Mtb Drugs 5, taranması için kullanıldı. Mtb hücreleri kullanılır bile, genellikle doğru vivo 8, 9 ilaç etkinliğini öngörmek olmayan suyu üreyen kültürler, kullanılarak gerçekleştirilir. Bu sorunlar, tanınmış ve MTB veya gizli Mtb içeren makrofajlar karşı ilaç tarama deneyleri başarıyla 8, 10, 11, 12 tespit edilmiştir. Ancak, hatta bu daha gelişmiş analizler ilaçlar non-vaskülarize akciğer lezyonları karşılaştıkları penetrasyon engelleri yeterli önem vermesi ve yok enfeksiyon yerinde nekrotik odaklar. AslındaHatta ilk basamak TB ilaç rifampisin için, sub-optimal doz nedeniyle in vivo doku ve beyin omurilik sıvısı (BOS) &#39;de vasat sorgulanmıştır hücre içi Mtb 8, 9 karşı etkinin azalmasına yanı sıra 13, 14, 15 nüfuz. şüphesiz TB ilaç keşif çabalarını artıracak erken kurşun geliştirme sürecinde dikkate bu parametreleri alacak gibi, yeni modeller ve tahlilleri gibi. Bu ihtiyacı karşılamak için, biz son zamanlarda Mtb ilaç etkinlik testleri 16 için, ucuz, hızlı ve BSL-2 uyumlu alternatif enfeksiyon modeli kurdu. Fizyolojik ilgili hücresel penetrasyon engelleri değinmeyecek ve makrofaj pasajlandı oluşturulan yoğun üretilen büyük makrofaj agrega yapılar içinde Mtb paketlenmiş Bu enfeksiyon modeli, <em&gt; gizli Mtb benzeyen değiştirilmiş bir fizyolojik durum ile Mtb. Bu enfeksiyon modeli türetilmiş Mtb diğer hücre içi enfeksiyon modellerinde tutarlı sonuçlar ilaç etkinliğini değerlendirmek için resazurin mikrotiter tahlilde (REMA) ile birleştirildi ve serum konsantrasyonlarına kıyasla yüksek CSF konsantrasyonlarının elde edilmesi için ortak bir TBC ilaç bildirilen yeteneği ile de korelasyon 16. Burada ayrıntılı olarak rema kullanılarak ilaç duyarlılık testi için makrofaj geçirilmiş Mtb uygun üretmek Mtb / makrofaj agrega yapıların üretilmesini tarif eder. Özel olarak, bu enfeksiyonun sistemi aday anti-TBC ilaçların verimli tarama ile uyumlu bir 96-gözlü formata adapte olabilir şeklini göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>7H9</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>Üreticinin tavsiyelerine uyun</td></tr><tr><td>Middlebrook OADC</td><td>BD Biosciences</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tyloxapol</td><td>Sigma</td><td>T8761</td><td>H2O'da %20 stok çözeltisi hazırlayın; filtre sterilize</td></tr><tr><td>eder D-Pantotenik asit hemikalsiyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>P5710</td><td>H2</ içinde 24 mg / mL stok çözeltisi hazırlayın alt >O; filtre sterilize</td></tr><tr><td>L-lösin</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>194694</td><td>H 2 O'da 50 mg / mL stok çözeltisi hazırlayın; filtre sterilize</td></tr><tr><td>eder Higromisin B</td><td>EMD Kırlangıç</td><td>400051</td> H <td>< alt > 2 < / alt > O Nalgene Meydanı PETG medya şişesinde 200 mg / mL stok çözeltisi hazırlayın</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>2019-0030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medya</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Corning</td><td>MT25005CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>Sitasyon 3 plaka okuyucu</td><td>Biotek</td><td></td><td>Herhangi bir floresan plaka okuyucu ve mikroskop ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Gen5 Yazılımı</td><td>Biotek</td><td></td><td>Kayıt ve analizi rezasurin coversion</td></tr><tr><td>Rifampicin&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2679250</td><td>H2O</td></tr><tr><td>Moksifloksasin Hidroklorür</td><td>Acros Organics</td><td></td> içinde <td>10 mg / mL stok çözeltisi hazırlayın 457960010 H <2 / sub > O</td></tr><tr><td>Resazurin Sodyum Tuzu</td><td>Sigma</td><td>R7017'de</td> 10 mg / mL stok çözeltisi hazırlayın <td>800 & hazırlayın; H2O'da g/mL stok çözeltisi; filtre sterilize</td></tr><tr><td>etmek Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164500</td><td>H2O'da% 20 stok solüsyonu hazırlayın; filtre sterilize edin</td></tr></tbody></table>

bir yüksek verim uyumlu deneyi makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Anti-tüberküloz ilaçlar için erken ilaç geliştirme süreci, in vitro aktiviteye sahip bileşiklerin klinik ortamda etkinliğe verimsiz çevirisi nedeniyle engellenmektedir. Bu muhtemelen, enfekte konakta bulunan fizyolojik olarak ilgili hücresel penetrasyon bariyerlerinin dikkate alınmamasından kaynaklanmaktadır. Yakın zamanda, özünde yoğun paketlenmiş M. tuberculosis (Mtb) içeren büyük makrofaj agregat yapıları oluşturan ve ilaç duyarlılık testi için uygun olan alternatif bir enfeksiyon modeli oluşturduk. Bu enfeksiyon modeli ucuz, hızlı ve en önemlisi BSL-2 uyumludur. Burada, ilaç duyarlılık testi için makrofaj geçişli Mtb üretecek Mtb/makrofaj agrega yapıları oluşturmak için deneysel prosedürleri açıklıyoruz. Özellikle, bu enfeksiyon sisteminin, bileşik kütüphanelerin Mtb'ye karşı taranması için verim kapasitesini gösteren 96 oyuklu plaka formatına nasıl doğrudan uyarlanabileceğini gösteriyoruz. Genel olarak, bu tahlil, basitliği, maliyet etkinliği ve ölçeklenebilirliği nedeniyle şu anda mevcut olan Mtb ilaç keşif araç kutusuna değerli bir ektir.

96 gözlü plaka formatında bu enfeksiyon modeli uyarlamak sağlamlığını teyit etmek için, burada Şekil verilen şablona göre bir ilaç eden 96 oyuklu türetilen Mtb duyarlılığını enfeksiyonu rifampisin modeli (RIF) ve moksifloksasin (Moxi) adapte incelenmiştir 1 A. Bu deneyde anahtarı Mtb / makrofaj agrega yapıların üretimi güvenilir bir şekilde ve böylece verim uyumluluğu (Şekil 1B) sağlayarak, bir 96 gözlü plaka formatında...

Yeni nesil anti-tüberküloz ilaçlar için erken ilaç geliştirme sürecini iyileştirecek yeni modeller ve testler oldukça arzu edilmektedir. Burada, Mycobacterium tuberculosis'e karşı ilaç etkinliğini değerlendirmek için yüksek verimli tarama için kolayca uyarlanabilen hızlı, ucuz ve BSL-2 uyumlu bir testi açıklıyoruz.

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Bu prosedürün genel amacı, canlılık boyası kullanılarak yapılan ilaç duyarlılık testleri için 96 kuyucuklu plaka formatında, tekrarlanabilir şekilde mycobacterium tuberculosis ile enfekte makrofaj agregat yapıları oluşturmaktır. Bu yöntem, aday bileşiklerin klinik ortama verimsiz aktarımı nedeniyle engellenen anti-tüberküloz bileşikler için erken aşama ilaç geliştirme sürecini iyileştirebilir. BSL iki uyumlu olan bu basit ve düşük maliyetli enfeksiyon modelinin temel avantajı, tüberküloz granülomlarını anımsatan fizyolojik olarak ilgili hücresel penetrasyon bariyerlerini yeniden oluşturmasıdır.Bu işlem, in vivo etkinliğin daha öngörülebilir olduğu ilaç duyarlılık sonuçları üretir. Bu prosedüre, enfeksiyon için yeşil floresan protein eksprese eden M.tuberculosis MC squared 6206 (bundan böyle MTBGFP olarak anılacaktır) hazırlayarak başlayın. Bunun avirülent bir suş olduğu unutulmamalıdır, bu nedenle burada açıklanan protokole ait tüm çalışmalar biyogüvenlik seviyesi iki olan bir tesiste yürütülebilir.Hazırlanacak her 96 kuyucuklu plaka için 2,8 × 10⁸ MTBGFP, sallanan kova tipi bir santrifüjde 3.200 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatantı

a-high-throughput-compatible-assay-to-evaluate-drug-efficacy-against

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, ilaçların Mycobacterium tuberculosis (Mtb) enfeksiyonuna karşı etkinliğini değerlendirmek için bir testi göstermektedir. İn vivo enfeksiyonu taklit eden Mtb/makrofaj agregatları içeren bir in vitro enfeksiyon modeli oluşturulur. Uygun antibiyotikler eklendikten sonra, artan ilaç konsantrasyonları ile bakterilerin hayatta kalmasını izlemek için etkinlikleri resuzarin testi ile test edilir.

Mycobacterium tuberculosis Enfeksiyon Modeline Karşı İlaç Etkinliğini Değerlendirmek İçin Bir Test

Burada, küçük müdahale eden sentetik RNA (siRNA), kimyasal bileşik ve Mycobacterium tuberculosis mutant kütüphanelerinin Yüksek verimli / Yüksek içerikli ekranları için geçerli olan fenotipik bir test açıklıyoruz. Bu yöntem, otomatik konfokal mikroskopi kullanılarak floresan etiketli konak hücre içinde floresan etiketli Mycobacterium tuberculosis'in tespitine dayanır.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Bu hücre içi, Mycobacterium tuberculosis karşısında roman bileşiklerin bulunması hedefleme için ve in suyu memeli konakçı hücreye karşı bakteri hem de sitotoksisite büyüyen modüler yüksek verimli bir tarama sistemini geliştirdik.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Hücre içi M. tuberculosis büyümesinin hızlı ve etkili bir şekilde ölçülmesi, tüberküloza (TB) karşı gelişmiş tedavilerin sürdürülmesi için çok önemlidir. Bu protokol, aday konakçı tarafından yönlendirilen tedavilerle tedavi edilen makrofajlarda Mtb büyümesini ölçmek için otomatik bir sıvı kültür sistemi kullanan et suyu bazlı bir kolorimetrik tespit testini tanımlar.

Tüberküloz için Ev Sahibi Tarafından Yönlendirilen Tedavilerin Preklinik Testlerinde Kullanılmak Üzere Otomatik Bir Kültür Sistemi

Koloni oluşturan birimlerin (CFU) belirlenmesi, görünür koloniler oluşturması haftalar sürebilen Mycobacterium tuberculosis de dahil olmak üzere bakterilerin miktarını belirlemek için altın standart tekniktir. Burada, artan zaman verimliliği, azaltılmış laboratuvar alanı ve reaktif maliyeti ve orta ve yüksek verimli deneylere ölçeklenebilirlik ile CFU belirleme için bir mikro-CFU'yu açıklıyoruz.

Tüberküloza Karşı Aşıların Etkinlik Değerlendirmesi için Mikro Koloni Oluşturan Birim Testi

Bu çalışma, bakteri canlılığını hızlı bir şekilde değerlendirmek için floresan ve lüminesans kullanarak, yakın zamanda oluşturulmuş bir çift raportör suşu ile Mycobacterium abscessus'a karşı yüksek verimli tarama için bir test geliştirdi. Bu protokol, bu ilaca dirençli bakterilere karşı yeni ilaçları taramayı amaçlayan araştırmacılar için geçerli olacaktır.

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Bu çalışma, Mycobacterium tuberculosis'in SLAMF1 mikrobiyal sensörü ile etkileşimini değerlendirmek için bir protokol sağlar. Deneyler, akış sitometrisi ve floresan mikroskobu kullanılarak insan monositinden türetilmiş makrofajlar üzerinde gerçekleştirildi. Açıklanan araçlar, patojenler ve immünoreseptörler arasındaki etkileşimleri incelemek için önemlidir.

Mycobacterium tuberculosis'in İmmün Reseptör SLAMF1 ile Etkileşiminin İncelenmesi için Floresan Testleri

Belli koşullarda kültüre zaman Mycobacterium tuberculosis ilaç hoşgörülü biyofilm oluşturmaktadır. Burada kültür M. yöntemleri tarif tuberculosis biyofilmler ve ilaç tolerans persisters sıklığını belirlenmesi. Bu protokoller M. ilaç hoşgörü mekanizmalarına daha sonraki çalışmalar için faydalı olacaktır tüberküloz.

Büyüme Mycobacterium tuberculosis Biyofilmler

Tüberküloz ve sıtma insan ve tropik yoksul toplumlarda morbidite ve mortalitenin önemli nedenlerinden en yaygın enfeksiyonlardan ikisidir. Bu enfeksiyon, doğal yoldan hem patojenler ile yüklemeden sonra farelerde sıtmaya tüberküloz koenfeksiyonu sonucunu çalışma deneysel bir model sistemi kurulmuştur.

Doğal İletim üzerine Tüberküloz-Sıtma Koenfeksiyonu Çalışması için Deneysel Bir Model Mycobacterium tuberculosis Ve Plasmodium berghei</i

Bir amplifikasyon mikrodizi önemli ölçüde son kullanıcı için mikro-dizi iş akışını tek bir oda içine asimetrik PCR amplifikasyonu ve mikrodizi hibridizasyon birleştirir. Mikrodizi iş akışı basitleştirilmesi rutin alt-kaynak ortamlarda kullanılabilir mikroarray tabanlı tanı oluşturmak için gerekli bir ilk adımdır.

Çok ilaca dirençli Demonstrating<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplifikasyon Microarray

Keşfedin, 96 kuyucuklu plaka formatında makrofaj agregatları oluşturarak Mycobacterium tuberculosis'e karşı ilaç duyarlılık testi yapma yöntemini. Bu BSL-2 uyumlu, yüksek verimli tarama assay, tüberküloz ilaç geliştirme sürecini iyileştirir ve in vivo etkinliği daha iyi tahmin eder.

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir

Daha fazla video keşfet