Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir Mycobacterium tuberculosis

Yeni nesil anti-tüberküloz ilaçlar için erken ilaç geliştirme sürecini iyileştirecek yeni modeller ve testler oldukça arzu edilmektedir. Burada, Mycobacterium tuberculosis'e karşı ilaç etkinliğini değerlendirmek için yüksek verimli tarama için kolayca uyarlanabilen hızlı, ucuz ve BSL-2 uyumlu bir testi açıklıyoruz.

Bu prosedürün genel amacı, bir canlılık boyası kullanılarak ilaç duyarlılık testi için 96 oyuklu plaka formatında mikobakteri tüberkülozu ile enfekte makrofaj agrega yapılarını tekrarlanabilir bir şekilde oluşturmaktır. Bu yöntem, aday bileşiklerin klinik ortama verimsiz bir şekilde çevrilmesiyle engellenen anti tüberküloz bileşikleri için erken ilaç geliştirme sürecini iyileştirebilir. Bu basit, ucuz, BSL iki uyumlu enfeksiyon modelinin ana avantajı, tüberküloz granülomlarını anımsatan fizyolojik olarak ilgili hücresel penetrasyon bariyerlerini özetlemesidir.

Bu, in vivo etkinliği daha öngören ilaç duyarlılık sonuçları üretir. Bu prosedüre, bundan sonra MTBGFP olarak anılacak olan M.tuberculosis MC squared 6206'yı eksprese eden yeşil floresan proteini hazırlayarak başlayın. Bunun avirulent bir suş olduğunu unutmayın, bu nedenle burada açıklanan protokoldeki tüm çalışmalar bir biyogüvenlik seviyesi iki tesiste gerçekleştirilebilir.

Her 96 kuyulu plaka için, sallanan bir kova santrifüjünde beş dakika boyunca 3, 200 kez G'de 2.8 kez 10 ila sekizinci MTBGFP'de santrifüj kurun. Döndürmeden sonra, süpernatanı aspire edin ve bakterileri yıkamak için beş mililitre RPMIC ekleyin. Hücreyi yeniden süspanse etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin.

Sonra tekrar santrifüj edin. İkinci dönüşten sonra süpernatanı dökün ve bakteri hücrelerini yedi mililitre RPMIC'de yeniden süspanse edin, ardından 10 saniye boyunca girdap yapın. Daha sonra, kurulacak her 96 oyuklu plaka için, beş dakika boyunca 250 kez G'de altıncı THP1 insan monositik hücrelerine yedi kez 10 kez santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dökün ve THP1 hücrelerini yedi mililitre RPMIC içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra, A ve H sıralarındaki ve birinci ve 12. sütunlardaki kuyucuklara 200 mikrolitre steril su ekleyerek enfeksiyon için 96 oyuklu bir plaka hazırlayın. Bu su kenarı, kültür ortamının buharlaşmasını önleyecektir.

Arka plan kontrolü veya boş için ikinci sütuna 200 mikrolitre RPMIC, B iki ila G iki ekleyin. THP1 monositini enfekte etmek için, hazırlanan tüm MTBGFP bakteri süspansiyonunu THP1 hücre süspansiyonuna aktarmak için bir pipet kullanın ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Nihai THP1 hücre yoğunluğu mililitre başına beş kez 10 ila beşincidir ve buna karşılık gelen enfeksiyonun iyi kopyası 40'tır.

Daha sonra, THP1 MTBGFP süspansiyonunu 25 mililitrelik bir rezervuara dökün ve ardından çok kanallı bir pipet kullanarak, kalan 96 kuyucuğun tümüne 200 mikrolitre THP1 MTBGFP süspansiyonu ekleyin, E üç ila G 11. Plakayı yedi ila 10 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyon boyunca her iki günde bir, her bir oyuğun üstünden 100 mikrolitre kullanılmış ortamı yavaşça çıkararak ve yavaşça 100 mikrolitre önceden ısıtılmış RPMIC ekleyerek ortamı değiştirmek için çok kanallı bir pipet kullanın.

Ortamı değiştirirken, kuyucukların dibindeki MTB makrofaj agregalarını rahatsız etmemeye dikkat etmek önemlidir. Her gün, parlak alan ve dört ila 10 X objektifli GFP filtre setleri ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak kuyuları görsel olarak inceleyin. MTB makrofaj agregalarının boyutuna dikkat edin ve istenirse görüntü yakalayın.

Yedi ila 10. güne kadar, MTB makrofaj agregatları, videonun ilerleyen bölümlerinde açıklandığı gibi, ilaç etkinlik testine devam etmek için yeterince büyük olmalıdır. İlaç testi için, iki anti tüberküloz ilacını aşağıdaki gibi yeni bir 96 oyuklu plaka üzerinde üç nüsha halinde hazırlayın. İlk olarak, B ikiden G 10'a kadar olan kuyulara 125 mikrolitre 7H9C ortamı ekleyin.

Daha sonra, iki ilacı bir mililitre 7H9C'de istenen en yüksek nihai konsantrasyonun iki katı şekilde hazırlayın. Bir pipet kullanarak, üçlü tedaviler için her ilacın 250 mikrolitresini B, C ve D 11 kuyularına ve ardından sırasıyla E, F ve G 11'e ekleyin. Daha sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak, 125 mikrolitreyi B 11'den G 11'e B 10'dan G 10'a hareket ettirerek test ilaçlarını seri olarak iki kat seyreltin.

Her adımda beş kez pipetleyerek karıştırın. 125 mikrolitreyi plaka boyunca sütundan sütuna sağdan sola hareket ettirmeye devam edin ve dördüncü sütundan sonra durun. Dördüncü sütunu karıştırdıktan sonra, 125 mikrolitreyi bir atık kabına atın.

İkinci ve üçüncü sütunlar herhangi bir ilaç içermemelidir. Bu, onların bir arka plan olarak ve pozitif büyüme kontrolleri için kullanılmalarına izin verecektir. Daha sonra, MTB ile enfekte olmuş makrofajları içeren 96 kuyulu plakayı inkübatörden alın.

Plakayı eğmeden, B iki ila G 11 kuyularından 150 mikrolitre ortamı çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Ardından plakayı burada gösterildiği gibi eğin ve pipet uçlarını kuyucukların alt kenarına yerleştirin ve kalan ortamı yaklaşık 50 mikrolitre çıkarın. MTB makrofaj agregaları kuyu dibine yapıştığı için herhangi bir materyal kaybı yaşanmamalıdır.

Bununla birlikte, ortamın çıkarılması mümkün olduğunca yumuşak olmalı ve bu işlem sırasında yeniden süspansiyonu önlemek için özen gösterilmelidir. MTB makrofaj agregalarını içeren plakanın B iki ila G 11 kuyularına yavaşça 100 mikrolitre 7H9C ortamı ekleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuklu plaka içeren ilacın 100 mikrolitresini enfeksiyon plakasının karşılık gelen kuyucuklarına aktarın.

Daha sonra plakayı kapalı bir torbaya koyun ve 37 santigrat derecede üç gün boyunca inkübe edin. Resazorin testi, mavi resazurini floresan pembe resorufin'e dönüştürmek için metabolik olarak aktif MTB tarafından üretilen oksidatif türlere dayanır. Renk ve floresanstaki değişiklik, bakteri üremesinin miktarını belirlemek için vekil bir belirteç olarak kullanılabilir.

Suda mililitre başına 8 miligramlık bir nihai konsantrasyonda bir resazurin stok çözeltisi hazırlayın. Sterilizasyon için 22 mikrometre gözenek boyutunda bir PVDF membrandan süzün. Stok çözeltisini, suyu ve Tween-80'i ikiye bire bir oranında karıştırarak resazurin içinde çalışan bir çözelti hazırlayın.

Nihai konsantrasyonlar mililitre resazurin başına 4 miligram ve% 5 Tween-80'dir. Bir plaka okuyucu kullanarak, 37 santigrat derecede her 30 dakikada bir 24 saat boyunca 530 nanometre uyarma ve 590 nanometre emisyonda floresan okumak için bir program ayarlayın. Plaka okuyucuyu önceden 37 santigrat dereceye ısıtın.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, ilaçla tedavi edilen plakanın B iki ila G 11 kuyularına 20 mikrolitre resazurin çalışma solüsyonu ekleyin. Plakayı okuyucunun üzerine yerleştirin ve programı başlatın. Bu enfeksiyon modelinin 96 kuyulu plaka formatına uyarlanmasının sağlamlığını doğrulamak için, moksifloksasin moksisindeki MTB rifampisin RIF'in duyarlılığı bu videoda tarif edildiği gibi değerlendirildi.

Burada gösterildiği gibi, MTB makrofaj agrega yapıları, 96 kuyulu plaka formatında başarılı bir şekilde oluşturuldu ve böylece put uyumluluğu sağlandı. Bakteriyel büyümenin bir göstergesi olarak resazurinin dönüşümünü kantitatif olarak ölçmek için, tek tek kuyucukların floresansı 24 saat boyunca kinetik olarak izlendi. Canlı MTB hücrelerinin varlığı, mavi resazurin boyasının, doygunluk zaman noktasında nispi floresan z ağları tarafından kantitatif olarak yansıtılan pembe indirgenmiş formuna dönüştürülmesi ile belirlenir.

Bu temsili mini grafikler, X ekseninde gösterilen zamana karşı Y ekseninde gösterilen sonuçta elde edilen floresan birimlerini gösterir. İlaç duyarlılığı öldürme eğrileri oluşturmak için, rifampisin ve moksifloksasin ile tedavi edilen kuyucuklar, ilaç kontrolü olmayan maksimum MTB büyümesine% 100 sağkalım olarak normalize edildi. Arka plan kontrolü boş sinyalleri her numune kuyucuğundan çıkarıldı.

Hayatta kalma yüzdesi, bir öldürme eğrisi oluşturmak için her bir ilaç tedavisi konsantrasyonu için çizildi. Bu veriler, minimal inhibitör konsantrasyonun, enfeksiyon modelimizden türetilen MTB'ye karşı hem rifampisin hem de moksifloksasin için% 90 büyüme inhibisyonunun gözlendiği en düşük antibiyotik konsantrasyonunu mililitre başına iki mikrogramdan daha büyük olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, enfeksiyon modelimizi ve tahlilimizi kullanarak bu iki ilacın MTB'ye karşı minimal inhibitör konsantrasyonu, bu ilaçların in vivo aktivitesini daha fazla yansıtmaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, resazurin testi kullanılarak ilaç duyarlılık testi için MTB ile enfekte makrofaj agrega yapılarının güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü takiben, ilaç şablonunun gösterildiği gibi iki ilaçtan 58 ilaç kütüphanesi paneline değiştirilmesi, yüksek miktarda ilaç taraması sağlamak için kolayca gerçekleştirilir.