Name: Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Keşfedin fare embriyonik fibroblastların GHMT transkripsiyon faktörleriyle kardiyomiyosit alt tiplerine yeniden programlanması yöntemini. Bu teknik, kardiyak hücre dönüşümü ve alt tip belirlenmesi mekanizmalarını incelemek için nicel analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AF-P., Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu tarafından 2015165336 No'lu Hibe kapsamında desteklenmiştir. N.V.M, NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838) ve March of Dimes (#5-FY14-203) tarafından sağlanan hibelerle desteklendi. Young-Jae Nam, Christina Lubczyk ve Minoti Bhakta'ya protokol geliştirme ve veri analizine yaptıkları önemli katkılardan dolayı teşekkür ederiz. Ayrıca değerli teknik katkılar için John Shelton'a ve bilimsel tartışmalar için Munshi laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz.

Hayvan uygulamaları içeren tüm deneysel prosedürleri UT Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Hcn4-GFP E12.5 Fare Embriyonik Fibroplastı 1. izolasyonu (MEFS) <ol><li> homozigot Hcn4-GFP erkeklerde ve CD-1 dişiler arasındaki zamanlanmış çiftleşmelerin ayarlayın. </li><li> karbondioksit ötanazi ve sonraki servikal dislokasyon ile E12.5 hamile kadın Kurban. <ol><li> , Daha önce 23 22 tarif edildiği gibi kesme forseps ile rahim boynuzları çıkarın ve Ca + 2 ya da Mg olmayan 1x Fosfat tamponlu tuz (PBS) ile buz üzerinde bir Petri 2+ içine yerleştirin. </li></ol></li><li> steril tekniği kullanarak doku kültürü kaputu sonraki tüm adımları uygulayın. <ol><li> makas kullanılarak ve forseps diseksiyon kesesi rahim ve amniyotik embriyolar çıkarın. Daha iyi kullanım için ekli plasentayı tutun. pregnant CD-1 dişi genellikle 10 ila 14 yavrular doğurur. </li><li> Forseps kesme kullanılarak, izole edilmiş embriyolar, almak ve hızlı bir şekilde% 70 (h / h), EtOH içinde iki kez yıkayın. NOT: yıkar hücre ölümünü en aza indirmek için hızlı olmalıdır. </li><li> İzole embriyolardan kalp de dahil olmak üzere, baş, kol ve bacaklarını, kuyruk ve iç organları çıkarın. </li><li> Yaklaşık olarak 1 mm3 büyüklüğünde steril bir jilet kullanılarak 1 x PBS ve ince kıyma 1 mL 10 cm&#39;lik bir tabak içinde kalan doku yerleştirin. </li><li> PBS ile 50 ml konik tüp içine kıyılmış doku aktarın. </li><li> 3 dakika boyunca 300 xg&#39;de Spin. Dikkatle aşırı PBS aspire. </li><li> embriyo başına steril% 0.25 tripsin-EDTA 1 ml. 15 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde hücreleri inkübe edin. Yavaşça tüpü her 4 dakikada bir karıştırın. Aşırı sindirim dokusu önemli ölçüde verim düşürecektir. </li><li> 4 saniye boyunca maksimum hızda (3200 rpm) vorteks hücre karışımı. </li><li> embriyo başına fibroblast ortam 2 ml ilave edilir ve karıştırılır. filtre tsüzgecinden hücreleri yardım etmek için bir pipet kullanarak 100 mikron hücre süzgecinden hrough. Sonraki tüm ortamlar oluşturulması için Tablo 1&#39;e bakınız. </li><li> 4 dakika boyunca 300 xg&#39;de Spin. Dikkatle süpernatant aspire. </li><li> 3 embriyoların başına taze fibroblast medya 10 ml ekleyin ve 6-10 kez çiğnemek. </li><li> hazırlanan her 3 embriyolar için 1 15 cm doku kültürü çanak hücreleri Plate. 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde kültür, gece boyunca. </li><li> Gece boyunca inkübasyondan sonra, plaka başına ortam taze 30 ml ile değiştirin. bir gecede geri kuvöz içine hücreleri yerleştirin. NOT: floresan mikroskop altında Hcn4-GFP + hücre kirlenme kontrol edin. Kültür GFP olmalı - ve sadece yeniden programlama üzerine GFP + olur. </li><li> Bir sonraki gün, taze, önceden ısıtılmış,% 0.25 tripsin-EDTA 3 mL hasat hücreleri. Kont ve hücreleri dondurma. Tipik olarak, mL başına 3 x 10 6 hücre hücreleri dondurma. beklenen YieLD embriyo başına 3 x 10 6 hücre olmalıdır. </li></ol></li></ol> 2. Retrovirus Üretim ve yeniden programlanması Dikkat: Aşağıdaki protokol bulaşıcı retrovirüslerin üretimi ve işleme gerektirir. BSL-2 kurallar ve steril tekniği altında Biyogüvenlik Seviye 2 kabine aşağıdaki adımları uygulayın. retrovirüslere maruz kalan tüm malzemelerin imha etmek için% 10 çamaşır suyu kullanın. <ol><li> Retrovirüs üretimi ve MEFS hazırlık Not: Aşağıdaki protokol 24 oyuklu plakalar içinde retroviral 6 oyuklu plakalar içinde üretimi ve MEF enfeksiyonu içindir. Diğer formatlar için, Tablo 2&#39;ye bakınız. Zamanlama (bölüm 2.3 ve Şekil 2&#39;ye bakın) her bir deney için uygun bir şekilde koordine edilmesi gerekir bu yüzden MEFS, Gün -1 de kaplanır. <ol><li> Plat-E (PE) üreticinin önerilerine göre hücreler koruyun. Kısaca, DMEM kültür PE hücreleri,% 10 FBS, 1 ug / ml ile takviye edilmiş puromycin, 10 ug / ml Blasticidin, penisilin ve streptomisin üzerine yayıldı. Passage hücreleri 1: Kültür% 70-90 confluency ulaştığında 4 her iki günde. </li><li> Gün -2: Transfeksiyondan bir önceki gün, transfeksiyon ortamı bir 6-yuvalı plaka / oyuk 1 x 10 6 hücre Plat-E hücreleri tohum. Hücreler, transfeksiyondan zamanında% 70-80 konfluent olmalıdır. </li></ol></li><li> Ticari bir transfeksiyon ajanı kullanılarak transfeksiyon. Not: Ticari reaktifler transfeksiyondan önce oda sıcaklığında (RT) olmalıdır. DNA, transfeksiyonu için, GHMT kokteyli 9 oluşturmak için her bir retroviral plazmid DNA tek tek (G, H, K ve T) ekleyin. <ol><li> Gün -1: 15 ml konik bir tüp içinde polistiren, bir 6-yuvalı plaka formatı için reaksiyon başına transfeksiyon reaktifi 6 uL düşük serum ortamında 60 uL karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe karışımı. Not: Burada kullanılan transfeksiyon reaktif plastik bağlanır beri,doğrudan indirgenmiş serum ortamına Transfeksiyon etkinliğindeki bir azalma bilmek dd. </li><li> reaksiyon başına GHMT kokteyli 2 mikrogram toplam ekleyin ve hafifçe karıştırın dokunun. vorteks etmeyin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca reaksiyon inkübe edin. </li><li> damla damla bir şekilde PE hücrelere adım 2.2.3 den karışımı ekleyin. </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde bir gece boyunca transfekte Plat-E hücreleri inkübe edin. transfeksiyon zamanı kaydedin. </li></ol></li><li> Hcn4-GFP fare embriyonik fibroblast tohumlama. <ol><li> 1 saat MEFS kaplama önce, immünsitokimya 24 plaka hazırlayın. <ol><li> kuyu başına 12 mm fibronektin lamel ekleyin. </li><li> (Örneğin, SureCoat) sığır kollagen çözeltisi 300 uL ile kaplayın kuyu, 1 saat boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edilir. </li><li> hemen MEF kaplama öncesi aspire kaplama solüsyonu. </li></ol></li><li> Hcn4-GFP MEFS donmuş şişe çözülme ve önceden ısıtılmış fibrobl ile x1 yıkayın5 dakika boyunca 500 xg&#39;de ast ortamı. </li><li> tripan mavisi dışlama veya benzeri boyalar kullanarak hücre canlılığı belirleyin. aşağıdaki formül kullanılarak kültür mL&#39;si başına canlı hücre sayısını hesaplayın: % Canlı hücreler = [1.00 - (toplam hücrelerin mavi hücre sayısı / Adet)] x 100 <ol><li> aşağıdaki formül kullanılarak canlı hücrelerin toplam sayısını hesaplayın: Hücre süspansiyonu canlı hücreler =% canlı hücreler x seyreltme faktörü x 10,000 x toplam hacim </li></ol></li><li> Daha önce hazırlanan sığır kollagen çözelti fibronektin lamel ile 24 oyuklu plaka oyuk başına tohum 3 x 10 4 hücre. </li></ol></li><li> İletimi ve MEF&#39;lerin yeniden programlama NOT: Üreticinin notlarına göre, düzgün Plat-E hücreleri 1 x 10 7 enfeksiyon birimlerinin / mL ortalama titreye üretmek yapılmaktadır. titre doğrudan her bir deney için ölçülen olmasa da, bir GFP kontrolü her zaman enfeksiyon verimliliği için bir vekil olarak yer almaktadır.Yüksek GFP tanımı ve yoğunluğu (GFP +&gt;% 95), tipik olarak iCLMs başarıyla GHMT aracılı üretimi ile ilişkilidir. <ol><li> Gün 0: 24 saat post-transfeksiyon, 0.45 um gözenek boyutlu yüzey aktif madde içermeyen selüloz asetat filtre ile PE retroviral orta filtre ve 15 ml konik bir tüp aktarın. 8 ug / mL&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar polibren ekleyin. Dikkatle taze transfeksiyon orta 2 ml hücreleri doldurmak. NOT: Ortam çok hızlı değiştirilirse Hücreler kolayca levhadan ayırmak. </li><li> Kültür MEF&#39;lerin orta aspire ve taze toplanan retroviral orta eklemek; Bir 6-çukurlu levha başına ortam 1.7 mL vermelidir. 24-iyi levha başına ~ 800 uL ekleyin. inkübatör MEF plaka dönün ve gece inkübe edin. </li><li> 1. Gün: tekrarlayın 2.4.1 ve 2.4.2 adımları. 2. Virüs toplandıktan sonra hücreleri atın. inkübatör virüslü MEFS dönün ve onları bir gecede dinlendirin. </li><li> 2. Gün: 48 saat sonrası indüksiyon, 1x PBS ile hücre klimalı ortam ve yıkama x1 aspire. 24 gözlü bir levha başına 500 uL önceden ısıtılmış iCLM ortam ekleyin. </li><li> 3 gün - her 2 iCLM medya değiştirin. 14 gün kalp reprogramming immünsitokimya (ICC) analizi için viral indüksiyon sonrası süreç plakası. </li></ol></li></ol> Yeniden programlanması MEFS 3. immün <ol><li> 14-gün-indüksiyon sonrası, dikkatlice medya aspirat. </li><li> buz soğukluğunda 1x PBS 300 ul her bir durulayın. Fazla çözüm aspire. </li><li> 24 gözlü bir levha başına% 4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi 250 uL hücreleri saptamak. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkalayın. Not: - boyama önce 2 hafta sabit hücreler 1, 4 ° C de PBS içinde saklanabilir. </li><li> 300 uL% 0.1 PBS-Triton® X-100 (PBST) ile yıkanır kuyu X3 Permeabilize hücreleri. Yıkamalar arasında oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Son yıkamadan sonra aşırı çözüm aspire. </li><li> 10 Blok300 uL / ​​kuyu başında 1x Evrensel Blok Tampon ile oda sıcaklığında min. </li><li> (ICC) boyama tampon hazırlayın: engelleme tampon 1x PBS ve 1x Universal 1: 1 ekleyin. ICC boyama tamponu primer antikorlar seyreltilir ve 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe antikor. Önerilen dilüsyonları için maddi bölümüne bakın. <ol><li> Jüri özel IPM ve IAM tanımlama için fare a-aktinin, tavuk αGFP ve tavşan ile slaytlar bir çift Leke. </li><li> iPM ve IVM tanımlama için fare α-aktinin, tavuk αGFP ve tavşan Myl2 ile slaytlar bir çift Leke. </li></ol></li><li> Ertesi gün, 300 uL% 0.1 PBST ile kuyu x3 yıkayın. Yıkamalar arasında oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Son yıkamadan sonra aşırı çözüm aspire. </li><li> ICC tampon boyama ikincil antikor dilüsyonları hazırlayın. Önerilen dilüsyonları için maddi bölümüne bakın. İkincil antikorlar, ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. <ol><li> Aşağıdaki ikincil Antikorların tüm slaytlar Lekes: fare Alexa-555, tavuk Alexa-488 ve tavşan Alexa-647. </li></ol></li><li> 300 uL% 0.1 PBST ile kuyu x3 yıkayın. Yıkamalar arasında oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Işıktan koruyunuz. </li><li> cam bir mikroskop lamı, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), 1.5 ug / ml ihtiva eden montaj medya 2.4 uL ekleyin. Dikkatle, 24 plaka kuyudan lamel kaldırmak fazla çözüm kaldırmak ve montaj medya ile cam slayt transfer. Yavaşça fazla hacim ve havayı çıkarmak için lamel basın. </li><li> Tercih oje veya plastik dolgu macunu ile mühür slaytlar. Mağaza ışıktan korunan 4 ° C&#39;de slaytlar. </li></ol> Konfokal Mikroskobu kullanılarak Kardiyak Alt Tiplerinin 4. Kimlik Not: görüntüleme için, konfokal mikroskop en az 2 floresan 405 spektral algılama kapasitesine sahip detektörler 488, 555 ve 639 nm dalga boyları ile donatılmış IPMS, IamS ve IVMS tespit etmek için gereklidir. imagPlan-Apochromat 20X / 0.75 objektif ya da daha iyi kullanarak e hücreleri. Üreticinin görüntü analiz yazılımı kullanarak 40X-immersiyon yağı kaliteli görüntüler elde edebilirsiniz yakınlaştırma görüntüleri taramak. <ol><li> Resim kütüphanesi: DAPI, Alexa-488, Alexa-555 ve Alexa-647 kanallı 8 bitlik görüntüleri almak (Böl.). Piksel 2&#39;de 6 s 1024 çerçeve boyutu, çizgi adımı kalma süresi ve 2 ortalama yüksek çözünürlüklü görüntüler için yeterlidir. </li><li> Her slayt için, bir ucundan başlayıp yukarı taramaya başlamak ve α-aktinin + Sarkomer + hücreleri için kırmızı floresan kanal (Böl.) Aşağı (örnekler için Şekil 3&#39;e bakın ve Şekil 5A). Sarkomer çizgiler 555 nm dalga boyundaki görsel tespit etmek kolaydır. <ol><li> Bir α-aktinin + Sarkomer + hücre tespit edildikten sonra, yeşil ch geçin. pozitif olması durumunda ve (IPM) notu tutmak. uzak-kırmızı 647 ch değerlendirmek için bilgisayara geçin. (IAM veya IVM). NOT: Hangi Hücrelerα-aktinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP + / jüri özel - / Myl2 - IPMS olarak belirlenir. GFP ifade hücre (Şekil 4A) boyunca görülecektir. </li><li> α-aktinin (fare-Alexa555), Hcn4-GFP (tavuk-Alexa488) ile Leke slaytlar, jüri özel (tavşan-Alexa647) ve DAPI. Α-aktinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP olan Hücreler - / jüri özel + IAM vardır. Jüri özel boyama perinükleer ve noktasal (Şekil 4B) görünecektir. </li><li> α-aktinin (fare-Alexa555) ile Leke slaytlar, Hcn4-GFP (tavuk-Alexa488), Myl2 (tavşan-Alexa647). Α-aktinin için pozitif hücrelerin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP - / Myl2 + IVMS vardır. Myl2 boyama sarkomer filamanın boyunca çizgili formu sergileyecek. Nedeniyle lekelenmesi ve Z-düzleminde kalitesinde farklılıklar nedeniyle, çizgiler her zaman (Şekil 4C) kolayca görülebilir olmayabilir. </li></ol></li></ol> Not: potansiyel olarak yeniden programlanabilir MEF&#39;ler gerçek sayısını belirlemek için, 24-çukurlu plaka 2 kuyu deney oyuklara paralel tohumlanır ve kaplama bir gün sonra hasat edilir. kaplama hücrelerinin toplam sayısı, daha sonra iki kuyu ortalamasının alınmasıyla belirlenmektedir. Bu kaplama gerçek toplam hücreleri (atotal) olur. <ol><li> sarkomer + <ol><li> Görme uygun α-aktinin + / Sarkomer + (Sağ paneller Şekil 3) ve kayıt (Şekil 5B-i) bir lamel her hücreyi kontrol edin. </li><li> Kaplama gerçek toplam hücrelerin (atotal) her lamel ve böl üzerinde α-aktinin + / Sarkomer + toplam sayısını tablolaştırıyoruz (Şekil 5B-iii). Atotal = 12,500 hücre ve 100 hücre a-aktinin edildi, örneğin, + / Sarkomer + sonra kaplama MEF&#39;ler% 0.8 yeniden programlanması edildi. Bir ortalamareprograming Deney,% 1 α-aktinin + / Sarkomer + hücreler (Şekil 5C) ürün elde edilir. </li></ol></li><li> Alt tür + NOT: Aşağıdaki adımlar için, bir temsilci iCLM miktar iş akışı için 5B / C Şekil bakın. Ya alt (Şekil 5B-I) için farklı ise, kısa bir süre, her sarkomerinde + hücre için, çizelgeye. Ortalama sarkomerinde + hücreleri x 100 (Şekil 5B-i) üzerinden alt tipi + hücrelerinin sayısına bölünmesiyle% Alt (Şekil 5B-iii) hesaplayın. Mutlak% alt verimi (Şekil 5B-IV) hesaplamak için, Şekil, alt + hücre sayısına bölün 5B-i x 100 (Şekil 5B-II) &#39;tohumlanmıştır hücrelerin toplam sayısına göre. <ol><li> GFP + jüri özel + veya Myl2 ise α-aktinin her + / Sarkomer + hücreleri için, değerlendirme <s&gt; + yukarı. </li><li> / Myl2 - - aktinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP - / jüri özel + ve α-aktinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP α-aktinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP + / jüri özel sayısı tablolaştırıyoruz - / Myl2 + hücreleri (Şekil 5B-I). </li><li> Her alt tip yüzdesini hesaplamak için, iyi ki + / Sarkomer + hücreleri α-aktinin toplam sayısına göre Tipi + hücre sayısını bölmek ve 100 GHMT ile çarpın IPMS, Iams ve IVMS kabaca eşit oranlarda oluşturur (Şekil 5B-iii). </li><li> Alt tipi + hücrelerinin mutlak sayısını hesaplamak için, atotal tarafından deneysel koşul için alt tipi + hücrelerinin toplam sayısını bölmek ve 100 (Şekil 5B-ii) ile çarpın. ortalama iPMS toplam enfekte hücre popülasyonunun% 0.3, Iams% 0,3, temsil veIVMS% 0.25 (Şekil 5B-IV). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sissman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+landmarks+in+cardiac+morphogenesis%3A+comparative+chronology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology.</a> Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).</li>
<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).</li>
<li>Ali, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existing+cardiomyocytes+generate+cardiomyocytes+at+a+low+rate+after+birth+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Senyo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+heart+renewal+by+pre-existing+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes.</a> Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).</li>
<li>Lin, Z., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+cardiac+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Strategies for cardiac regeneration and repair.</a> Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231(2014).</li>
<li>Writing Group, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2016+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li>
<li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li>
<li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).</li>
<li>Fu, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+human+fibroblasts+toward+a+cardiomyocyte-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state.</a> Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).</li>
<li>Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1%2Fprotein+kinase+B+enhances+transcriptional+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+Is+a+Key+Epigenetic+Barrier+to+Direct+Cardiac+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+reprogramming+of+fibroblasts+into+cardiomyocytes+requires+suppression+of+pro-fibrotic+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling.</a> Nat Commun. 6, 8243(2015).</li>
<li>Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+steady+progress+on+direct+cardiac+reprogramming+toward+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application.</a> Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).</li>
<li>Atkinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+molecular+mapping+of+the+left+and+right+ventricular+His-Purkinje+conduction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).</li>
<li>Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+cardiomyocyte+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Atrial cardiomyocyte calcium signalling.</a> Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).</li>
<li>Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+mouse+ventricular+conduction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of the mouse ventricular conduction system.</a> Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).</li>
<li>Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25406392">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li>
<li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li>
<li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConner%2C+DA+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors%3A+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li>
<li>Ichim, C. V., Wells, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-titer+viral+preparations+by+concentration+using+successive+rounds+of+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation.</a> J Transl Med. 9, 137(2011).</li>
<li>Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocyte-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro.</a> Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nat Commun. 5, 5807(2014).</li>
<li>Muraoka, N., Ieda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+myocytes+to+reverse+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis.</a> Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).</li>
<li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).</li>
<li>Bass, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+identifies+signaling+pathways+regulating+distinct+signatures+of+cardiac+myocyte+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu çalışmada kardiyak transkripsiyon retrovirüs aracılı ifade yoluyla kardiyak alt tiplerinin farklı setine MEFS dönüşüm için doğrudan yeniden programlama strateji sağlar Gata4, Mef2c Tbx5 ve Hand2 (GHMT) faktörleri. Bir PM özgü muhabiri fare ile birlikte bir multipleks immün yaklaşımı kullanarak, biz tek bir hücre çözünürlükte IAM, IVMS ve IPMS tespit edebiliyoruz. Böyle bir tahlil alt tip çeşitlilik ve sarkomer geliştirilmesine yönelik bireysel transkripsiyon faktörlerinin katkıları izole edebilen vitro siste...

Kalp embriyo 1, 2 geliştirmek için ilk fonksiyonel bir organdır. dolaşım sistemi ile birlikte, bu oksijen, besin ve geliştirme sırasında bir atık bertaraf mekanizması sağlamaktadır. Üç hafta döllenmeden sonra, insan kalbi ilk kez yener ve onun uygun düzenleme kardiyomiyositlerde (CMS) tarafından yapılmaktadır. Bu özel hücrelerin geri dönüşümsüz kaybı dolayısıyla ilerici kalp yetmezliği altında yatan temel bir konudur. Böyle Zebra balığı ve Xenopus gibi bazı organizmaların kalp rejenerasyon potansiyeli varken, yetişkin memeli kalp 3, 5, 6 daha sınırlıdır. Böylece, kalbin kritik işlevi göz önüne alındığında, kalp hastalığı tek başına 7 Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde 600.000 ölüm için muhasebe, dünyada önde gelen ölüm nedeni olduğunu şaşırtıcı değildir.verimli tamir veya yaralı miyokard yerine refore, hücre bazlı terapiler büyük bir klinik öneme sahiptir. Yamanaka ve arkadaşları 8 seminal Çalışma dört transkripsiyon faktörlerinin zorla ifade pluripotent kök hücreleri tamamen farklılaşmış fibroblast hücrelerini dönüştürmek için yeterli olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, tüm pluripotent kök hücre stratejilerinin tümörijenik kapasitesi terapötik amaçlar için kullanımı ile önemli bir sorun olmuştur. Bu bir pluripotent sahne kaçınarak alternatif yöntemler hücrelerin transdifferentiate için aramak için bilimsel alanını motive etti. Son zamanlarda, çeşitli gruplar transkripsiyon ektopik ifadesi ile uyarılan kardiyomiyosit-benzeri hücreler (iCLMs) fare fibroblast doğrudan dönüşüm göstererek bu stratejinin uygulanabilirliğini göstermiştir Gata4, Mef2c Tbx5 ve daha sonra, Hand2 (GMT ve GHMT faktörleri sırasıyla) 9, 10. furthermore aynı strateji, in vivo olarak, insan-türevi doku 9, 11, 12 gerçekleştirilebilir. Son çalışmalar, ek faktörler ya da daha fazla kalp yeniden programlama verim 13, 14, 15 geliştirmek için modüle edilebilir yolakları sermiştir. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar rejeneratif tedaviler için yönlendirilmiş transdiferansiyonun potansiyelini göstermektedir. Ancak, metodolojik farklılıklara 16 CM yeniden programlama, bilinmeyen moleküler mekanizmaları, tutarsız tekrarlanabilirlik düşük verimlilik ve iCLMs heterojen yapısı adressiz kalır. şirketinden iCLM heterojen değerlendirmek için biz sarkomer gelişimi ve kardiyak nesilli Specificatio tanımlanması için ayrı ve sağlam tek hücreli deneyi tasarlanmıştırN-iki fonksiyonel kardiyomiyositlerde gerekli özellikleri. Atriyal (AM), ventriküler (VM) ve kalp pili (PM) 17, 18, 19, 20: konumlarını ve eşsiz elektriksel özellikleri ile tanımlanan kalbinde CM en az üç ana tipi vardır. Bir orkestra birlikte, onlar kan düzgün pompalama sağlar. Kalp yaralanması sırasında, bir veya tüm alt tipleri etkilenebilir ve hücre tedavisi tip bir vaka ile ayrı ayrı ele alınması gerekir. az iş alt tipi özellikleri düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için yapılırken Şu anda, en stratejileri, kardiyomiyositlerinin genel nesil odaklanmak. Aşağıdaki çalışma düzgün iyi organize sarkomer ölçmek kardiyomyosit alt tiplerinin çeşitli bir dizi tanımlamak için nasıl ayrıntıları. Kalp pili (PM) &#39;e özgü muhabir Fareyi kullanarak, biz bir i uygulamak mümkünmmunocytochemical yaklaşım kaynaklı atriyal benzeri miyositleri (IAM), uyarılmış ventriküler benzeri miyositleri (IVM) ve uyarılmış PM benzeri miyositleri (IPMS) 21 ayırt etmek. Bizim gözlemlere dayanarak sadece sarkomer organizasyonu sergileyen hücreler spontan dayak yeteneğine sahiptirler. Bu eşsiz yeniden programlama platformu rolünü değerlendirmek için izin verir tek hücreli çözünürlükte sarkomer organizasyonu, alt tip şartname ve CM yeniden programlama verimliliği belli parametreleri.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td>iCLM ortamı, Plat-E ortamı, fibroblast ve Transfeksiyon ortamının</td></tr><tr><td>bileşeni Orta 199</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>11150059</td><td>iCLM ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>Fetal sığır serrumunun (FBS)</td> <td>Sigma</td><td>F2442</td><td>iCLM ortamı, Plat-E ortamı, fibroblast ve Transfeksiyon ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>İnsülin-Transferrin-Selenyum G</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>41400-045</td><td>iCLM ortamının</td></tr> bileşeni <tr><td>MEM vitamin çözeltisi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11120-052</td><td>iCLM ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>MEM amino asitleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1601149</td><td>iCLM ortamının</td></tr><tr><td>bileşeni Esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td>iCLM ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotikler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>iCLM ortamının</td></tr> bileşeni <tr><td>B-27 takviyesi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>iCLM ortamının</td></tr> bileşeni <tr><td>Isıyla İnaktive Edilmiş At Serumu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050-088</td><td>iCLM ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-70</td><td>iCLM ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>1514022</td><td>Plat-E media ve fibroblast media</td></tr><tr><td>bileşeni Puromisin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11139-03</td><td>Plat-E ortamının</td></tr><tr><td>bileşeni Blasticidin&nbsp; &nbsp;</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-128P</td><td>Plat-E ortamının</td></tr> bileşeni <tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>Fibroblast ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>Konfokal lazer tarama LSM700</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Konfokal analiz için</td></tr><tr><td>FuGENE 6 transfeksiyon Reaktifi</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Transfeksiyon reaktifi&nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>Transfeksiyon reaktifi&nbsp;</td></tr><tr><td>Polibren</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>İndüksiyon reaktifi. 8 & mu'luk bir son konsantrasyonda kullanın; M/mL</td></tr><tr><td>Platinyum-E (PE) Retroviral Packagin Hücre Hattı, Ekotropik</td><td>HücreBiolabs</td><td>RV-101</td><td>Retroviral pacaking hücre hattı</td></tr><tr><td>Tripsin% 0.25 EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>MEF'ler ve Plat-E ayrışması için</td></tr><tr><td>Fare anti ve alfa; -Aktinin (Klon EA-53)</td> Konfokal analiz için <td>Sigma</td><td>A7811</td><td>Antikoru. Konfokal analiz için 1:200</td></tr><tr><td>Tavuk anti-GFP IgY</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10262</td><td>Antikorunda kullanın. 1:200</td></tr><tr><td>Tavşan Pab anti-NPPA&nbsp'de kullanın;</td>Konfokal analiz için <td>Abgent</td><td>AP8534A</td><td>Antikoru. 1:400</td></tr><tr><td>Tavşan Pab anti Myl2 IgG&nbsp'de kullanın;</td>Konfokal analiz için <td>ProteinTech</td><td>10906-1-AP</td><td>Antikoru. DAPI</td></tr><tr><td>(4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür) ile 1:200 Vectashield çözeltisinde kullanın)</td> <td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td>Konfokal analiz için boya</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Mikroskop slaytları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>25 x 75 x 1.0 mm</td></tr><tr><td>BioCoat Fibronektin 12 mm lameller</td><td>NeuVitro Corp</td><td>GG-12-1.5</td><td>Konfokal analiz için lameller</td></tr><tr><td>100 &mu; m hücreli süzgeç</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m Şırınga filtreleri SFCA 25MM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-740-106</td><td>Virüs filtrasyonu için</td></tr><tr><td>6 mL Şırıngalar</td><td>Covidien</td><td>8881516937</td><td>Virüs filtrasyonu için</td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavuk IgY (H & L) A488</td><td>Abcam</td><td>AB150169</td><td>Konfokal analiz için ikincil antikor. 1:400</td></tr><tr><td>Eşek anti-tavşan A647 IgG(H+L)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31573</td><td>Konfokal analiz için ikincil antikor. 1:400</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG (H + L) A555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21422</td><td>Konfokal analiz için ikincil antikorda kullanın. Hücre geçirgenliği için 1:400</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443-100ml'de</td> kullanın<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun CaCl 2 ve MgCl 2 içermeyen PBS'si (D-PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Güç Bloğu 10x Evrensel Engelleme reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9495720</td><td>H2O'da 1x'e seyreltin</td></tr><tr><td>%16 Paraformaldehit sulu çözeltisi (PFA)Elektro</td> <td>Mikroskopi Bilimleri&nbsp;</td><td>15710</td><td>%4'te dH2O</td></tr><tr><td>6 cm&nbsp; plakalarda</td> kullanın <td>Olympus</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plakalar</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Doku kültürü kapları</td><td>Corning</td><td>4239</td><td></td></tr><tr><td>15 cm&nbsp; Doku kültürü kapları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5442</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konik tüpler</td><td>Corning</td><td>4308</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konik tüpler</td><td>Corning</td><td>4249</td><td></td></tr><tr><td>%0.4 Tripan mavisi çözeltisi Sigma</td><td></td><td>T8154</td><td>Canlılık için</td></tr><tr><td>Etil Alkol 200 geçirmez</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7005</td><td></td></tr><tr><td>Çamaşır Suyu</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>6009</td><td></td></tr></tbody></table>

fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Bir hücre tipinin diğerine doğrudan yeniden programlanması, son zamanlarda rejeneratif tıp, hastalık modellemesi ve soy spesifikasyonu için güçlü bir paradigma olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, fibroblastların Gata4, Hand2, Mef2c ve Tbx5 (GHMT) tarafından indüklenmiş kardiyomiyosit benzeri miyositlere (iCLM'ler) dönüştürülmesi, in vitro ve in vivo olarak de novo kardiyak miyositler oluşturmak için önemli bir yolu temsil eder. Son kanıtlar, GHMT'nin daha önce takdir edilenden daha fazla kardiyak alt tip çeşitliliği ürettiğini ve bu nedenle ek çalışmalar yürütmek için sistematik bir yaklaşıma duyulan ihtiyacın altını çizdiğini göstermektedir. Bununla birlikte, doğrudan yeniden programlama terapötik bir strateji olarak kullanılmadan önce, spesifik kardiyak alt tipler oluşturmak için soy dönüşümünün mekanik temelleri ayrıntılı olarak anlaşılmalıdır. Burada, fare embriyonik fibroblastlarının (MEF'ler) GHMT aracılı yeniden programlanması yoluyla iCLM'lerin üretilmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. 
Verimli yeniden programlamayı gerçekleştirmek için MEF izolasyonu, retroviral üretim ve MEF enfeksiyonu yöntemlerini özetliyoruz. Yeniden programlanmış hücrelerin alt tip kimliğini belirlemek için, tanımlanmış bir dizi uyumlu antikor kullanarak iCLM'ler üzerinde immünositokimya gerçekleştirmek için adım adım bir yaklaşımı detaylandırıyoruz. iCLM'lerin ve bireysel atriyal (iAM), ventriküler (iVM) ve kalp pili (iPM) alt tiplerinin konfokal mikroskopi, tanımlanması ve miktar tayini için yöntemler de sunulmaktadır. Son olarak, prototipik doğrudan yeniden programlama deneylerinin temsili sonuçlarını tartışıyoruz ve verimli soy dönüşümünü sağlamak için protokolümüzün önemli teknik yönlerini vurguluyoruz. Birlikte ele alındığında, optimize edilmiş protokolümüz, araştırmacıların bireysel CM alt tiplerinin tanımlanmasını gerektiren anlamlı kardiyak yeniden programlama deneyleri yürütmeleri için aşamalı bir yaklaşım sağlamalıdır.

PM-spesifik raportör fare yararlanan biz Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi çeşitli endojen miyositleri tanımlamak için multipleks immün strateji geliştirdi. Şekil 2&#39;de gösterilen yeniden programlama adımları aşağıdakı, alt özel CMS indüksiyonu olsa düşük bir oranda, erken 4. günde 21 olarak tespit edilebilir. 14. günde tarafından, deney durdurulabilir ve sarkomer organizasyonu (Şekil 3) ve alt tip-şartname <str...

Bu el yazması, Gata4, Hand2, Mef2c ve Tbx5'in retrovirüs aracılı bir iletimini kullanarak çeşitli yeniden programlanmış kardiyak alt tiplerin oluşturulması ve ölçülmesi için adım adım bir protokolü açıklar.

Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli indüklenmiş kardiyomiyosit alt tiplerini üretmek ve nicelleştirmektir. Bu yöntem, sarkomer montajını ve alt tip spesifikasyonunu düzenleyen gerekli sinyaller gibi, kardiyak yeniden programlama sırasında alt tipe özgü soy hattı dönüşümüne ilişkin temel ve kritik soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mekanizma çalışmalarının gerçekleştirilmesi için gerekli olan, kardiyo alt tip spesifikasyonu üzerindeki nicelleştirilmiş etkileri belirleme yöntemini sunmasıdır.Başlamak için, E 12.5 evresindeki embriyolardan fare embriyonik fibroblastlarını izole edin. Bunları, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde sıvı azot içerisinde saklayın. Ardından, plat-E hücrelerini hasat edin ve hücrelerin 24 saat içinde %70 ila %80 konfluense ulaşması için altı kuyucuklu bir plakaya her kuyucuğa bir milyon hücre gelecek şekilde ekleyin.Hücrelerin üzerini transfeksiyon medyumu ile kapatın ve standart kültür koşullarında inkübe edin. Deney gününden bir gün önce, 15 ml'lik konik polistiren tüp alın ve reaksiyon başına 60 µL düşük serumlu medyumu altı µL transfeksiyon reaktifi ile karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Transfeksiyon verimliliğindeki herhangi bir düşüşü önlemek için, transfeksiyon reaktifini doğrudan serumu azaltılmış ortama ekleyin. Ardından, reaksiyon başına toplam iki mikrogram GHMT kokteyli ekleyin ve karıştırmak için tüpe hafifçe vurun. Reaksiyonu oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin ve ardından karışımı damla damla plat-E hücrelerine ekleyin.Transfeksiyonun tarihini ve saatini kaydedin. Transfekte edilmiş plat-E hücrelerini gece boyunca inkübe edin. Fare embriyonik fibroblastlarını ekimden bir saat önce, her kuyuya 12 millimeter fibronectin kaplı lamel ekleyerek immünositokimya için 24 kuyucuklu bir plaka hazırlayın.Ardından, her kuyuya 300 µL sığır kollajen çözeltisi ekleyin ve plakayı bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonuna doğru, dondurulmuş bir HCN4GFP fare embriyonik fibroblast tüpünü çözdürün. Hücreleri hızlıca çözdürün, önceden ısıtılmış fibroblast medyası ile bir kez yıkayın ve canlı hücre konsantrasyonunu sayın.Ardından, 24 kuyucuklu plaktaki kaplama solüsyonunu aspire edin ve hemen kuyucuk başına 30.000 hücreyi kolajen ve fibronektin kaplı lamellerin üzerine ekleyin. Transfeksiyondan 24 saat sonra, retroviral medyumu 0,45 mikron gözenek boyutunda sürfaktansız selüloz asetat filtreden süzün ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, son konsantrasyonu mililitre başına sekiz mikrogram olacak şekilde polybrene ekleyin.plat-E hücrelerini iki mililitre taze transfeksiyon medyumu ile dikkatlice yenileyin. Medyumun çok hızlı değiştirilmesi hücrelerin ayrılmasına neden olabilir. Uygun şekilde bakılan plat-E hücreleri, mililitre başına ortalama on milyon enfeksiyon birimi üretir.Hücrelerin %95'inden fazlasında görülen yüksek GFP ekspresyonu ve yoğunluğu, tipik olarak GHNT aracılı başarılı bir indüklenmiş kardiyomiyosit benzeri miyosit üretimi ile korelasyon gösterir. Ardından, kültüre edilmiş embriyonik fibroblastların ortamını aspire edin ve taze toplanmış retroviral ortamı ekleyin. Daha sonra plakayı inkübatöre geri yerleştirin ve gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, medyayı plat-E hücrelerinden embriyonik fibroblastlara tekrar aktarın. İkinci virüs toplama işleminden sonra plat-E hücrelerini atın. İndüklemeden 48 saat sonra, hücre koşullandırma medyasını aspire edin ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.Ardından, 24 kuyucuklu plakanın her kuyucuğuna 500 µL önceden ısıtılmış indüklenmiş kardiyomiyosit benzeri miyosit medyumu ekleyin. Sonraki 12 gün boyunca medyumu iki ila üç günde bir yenileyin. İndüksiyondan 14 gün sonra medyumu dikkatlice aspire edin ve her kuyucuğu 300 µL buz gibi soğuk PBS ile durulayın.Ardından PBS'yi uzaklaştırın, kuyuma başına 250 µL %4'lük paraformaldehit solüsyonu ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, kuyumaları 300 µL %0,1 Triton X-100 ve PBS ile beşer dakikalık üç yıkama yaparak hücreleri permeabilize edin. Son yıkamadan sonra fazla permeabilizasyon solüsyonunu aspire edin ve ardından kuyuma başına 300 µL üniversal bloklama tamponu ekleyin.Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bloklama yapın. İndüklenmiş atriyal benzer miyositler içindeki indüklenmiş pacemaker benzeri miyositleri belirlemek için, bir çift lamı fare anti-alfa aktinin, tavuk anti-GFP ve tavuk anti-NPPA antikorları ile gece boyunca boyayın. Ertesi gün, kuyucukları yıkayın ve beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde uygun sekonder antikoru ekleyin.Ek yıkama işlemlerinin ardından, bir cam mikroskop lamına 2,4 µL montaj medyumu ekleyin. 24 kuyucuklu plaktan bir lamelleştirme camı alın ve fazla solüsyonu uzaklaştırın. Ardından, bunu montaj medyumu bulunan cam lamın üzerine aktarın.Her bir lam için, bir kenardan başlayarak alfa-aktinin pozitif sarkomer pozitif hücreleri tanımlamak amacıyla kırmızı floresan kanalında yukarı ve aşağı doğru tarama yapın. Sarkomer çizgilenmelerinin tanımlanması 555 nanometre dalga boyunda en kolaydır. Hücreler tanımlandıktan sonra yeşil kanala geçiş yapın ve hücrelerin pozitif olup olmadığını not edin.Ardından, NPPA veya MYL2 boyamasını incelemek için bilgisayara geçerek uzak kırmızı 647 nanometre dalga boyunu değerlendirin. Alfa-aktinin pozitif, sarkomer pozitif, Hnc4-GFP negatif ve Nppa pozitif olan hücreler, indüklenmiş atriyal benzeri miyositlerdir. Nppa boyaması paranükleer ve noktasal olarak görünecektir.Öncelikle, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı gibi, ekimden 24 saat sonra hücre sayısını belirleyin. Ardından, bir lamel üzerindeki her bir hücreyi alfa-aktinin ve sarkomer boyamasının uygunluğu açısından görsel olarak inceleyin ve her iki marka için pozitif boyanma gösteren hücre sayısını kaydedin. Daha sonra, bu sayıyı ekilen gerçek toplam hücre sayısına bölün.Ortalama bir yeniden programlama deneyi, hem alfa-aktinin hem de sarkomer pozitif olan yaklaşık yüzde bir oranında hücre verecektir. 14. güne gelindiğinde deney durdurulabilir ve sarkomer organizasyonu açısından değerlendirilebilir. Bu durum, burada kırmızı renkte gösterilen pozitif alfa-aktinin boyaması ile tanımlanır.Sadece sarkomer organizasyonu sergileyen hücreler spontan atım yapabildiğinden, bu işlem iyi bir ilk kontrol yöntemidir. Burada, Hcn4-GFP raporlayıcı farelerden elde edilen indüklenmiş pacemaker benzeri kardiyomiyositler gösterilmiştir. Bu görünümdeki üç hücre sarkomer organizasyonu sergilemektedir.Görüntünün merkezinde Hcn4-GFP için pozitif olan üç hücre kümesi bulunmaktadır ve bunlar pacemaker hücre tipi olarak tanımlanabilir. Sol alt köşedeki bir hücre, alfa-aktinin boyaması ile gözlemlenebilmekte ancak sarkomer organizasyonu veya tanımlanabilir bir alt tip belirteci görülmemektedir. İndüklenmiş ventriküler benzer kardiyomiyosit popülasyonunda, merkezdeki hücre sarkomer organizasyonu sergilemekte olup, bu hücre aynı zamanda ventriküler kardiyomiyositlerin bir belirteci olan miyosin hafif zincir belirteci MYL-2 için de pozitif boyanmaktadır.Uzmanlaşıldığında, plat-E hücrelerinin ekimi ve transfeksiyonu bir saat içinde gerçekleştirilebilir. Fare embriyonik fibroblastlarının indüksiyonu bir ila iki saat, 24 kuyucuklu bir plakanın tamamının mito kuantifikasyonu ise yaklaşık sekiz saat sürer. Bu prosedür uygulanırken, başarılı bir yeniden programlama deneyi için sağlıklı fare embriyonik fibroblastlarının ve yüksek titreli virüslerin temel gereksinimler olduğunu unutmamak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, bireysel indüklenmiş kardiyomiyosit alt tiplerinin nasıl oluşturulacağı ve miktarlarının nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

assessing-cardiomyocyte-subtypes-following-transcription-factor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Tek hücreli ifade profil, tek tek hücrelerin ayrıntılı gen ekspresyon analizi sağlar. Biz kardiyomiyositlerde izolasyonu için yöntemler tanımlamak ve belirli hedeflere bütün transcriptome mikroarray veya qPCR için lizatları hazırlanıyor.

Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde Tek Hücre transkripsiyonel Profilleme

Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

Burada, polisistronik bir yapıda Gata4, Tbx5 ve Mef2c'nin retrovirüs aracılı dağıtımını kullanarak iCM'lerin üretilmesi için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, geliştirilmiş verimlilik ve kaliteye sahip nispeten homojen bir yeniden programlanmış hücre popülasyonu sağlar ve gelecekteki iCM yeniden programlama çalışmaları için değerlidir.

Gata4, Mef2c ve Tbx5 Optimal Oranı ifade bir polisistronik Construct kullanma Kaynaklı kardiyomiyositlerde Geliştirilmiş Nesil

Gen transkripsiyonu bir ince ayar düzenlemesi embriyonik hücre kaderi kararı temelini oluşturmaktadır. Bu yazıda, kök hücre ve fare embriyoları kalp gelişimi hem kalp farklılaşma epigenetik düzenleme araştırmak için kullanılan kromatin immünopresipitasyon analizler açıklanmaktadır.

Embriyonik Kök Hücre ve Doku Kardiyak Farklılaşma epigenetik Yönetmelik

Bu protokol, yüksek verim, saflık ve canlılığa sahip yetişkin fare kardiyomiyositlerinin tekrarlanabilir izolasyonu ve uzun süreli kültürü için adım adım bir yöntemi açıklar.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Burada açıklanan protokol, minimal bir transkripsiyon faktörü setinin aşırı ekspresyonu yoluyla fare embriyonik fibroblastlarında bir hemojenik programın indüksiyonunu detaylandırır. Bu teknoloji, hematopoez, hematolojik hastalık ve hematopoietik kök hücre nakli ile ilgili gelecekteki çalışmalar için platformlar sağlamak üzere insan sistemine çevrilebilir.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

Kardiyomiyositlerde hücre bölünmesini hücre döngüsü varyasyonlarından ayırt etmek için, iki transgenik fare hattı kullanarak protokoller sunuyoruz: kardiyomiyosit çekirdeklerinin kesin olarak tanımlanması için Myh6-H2B-mCh transgenik fareler ve hücre bölünmesini hücre döngüsü varyasyonlarından ayırt etmek için CAG-eGFP-anilin fareleri.

Doğum sonrası kardiyomiyositlerde Hücre Döngüsü Varyasyonları görselleştirme ve Çekirdeklenme Belirlenmesi

Burada, fonksiyonel, sözleşme, cardiomyocyte benzeri hücreler üretmek için kardiyak farklılaşma potansiyeli insan Mezenkimal kök hücrelerin genç kaynaklarının verimli koşum için bir yöntem mevcut tüp bebek.

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Burada birincil embriyonik fibroblastlar içine fonksiyonel cardiomyocytes overexpression GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 ve miR-133, TGF-β sinyal inhibisyon yanında (GHMT2m) aracılığıyla yeniden programlamak için sağlam bir yöntem mevcut. Bizim iletişim kuralı dayak cardiomyocytes 7 gün sonrası iletim % 60 ile olduğu kadar erken oluşturur verimlilik.

Pro-fibrotik sinyal bastırma faktörü-aracılı fare embriyonik fibroblastlar indüklenen Cardiomyocytes yeniden programlama Potentiates

Burada, kardiyak yeniden programlama değerlendirmesi için bir Tg (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aşağıdaki αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 olarak adlandırılır) fare muhabir hattının kurulmasını ve uygulanmasını açıklıyoruz. Fare zorlanmasından izole edilen yenidoğan kardiyak fibroblastlar (NCF'ler) indüklenmiş kardiyomiyositlere (iCM' ler) dönüştürülerek, kalsiyum (Ca2+) akı yoluyla iCM'lerin yeniden programlama verimliliğinin ve fonksiyonel olgunlaşmasının rahat ve...

Bir GCaMP3 Muhabiri ile Kardiyak Spesifik Kalsiyum Akısını Ölçerek Kardiyak Yeniden Programlamanın İn vitro Değerlendirmesi

Keşfedin fare embriyonik fibroblastların GHMT transkripsiyon faktörleriyle kardiyomiyosit alt tiplerine yeniden programlanması yöntemini. Bu teknik, kardiyak hücre dönüşümü ve alt tip belirlenmesi mekanizmalarını incelemek için nicel analiz sağlar.

Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal

Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet