Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli indüklenmiş kardiyomiyosit alt tiplerini üretmek ve nicelleştirmektir. Bu yöntem, sarkomer montajını ve alt tip spesifikasyonunu düzenleyen gerekli sinyaller gibi, kardiyak yeniden programlama sırasında alt tipe özgü soy hattı dönüşümüne ilişkin temel ve kritik soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mekanizma çalışmalarının gerçekleştirilmesi için gerekli olan, kardiyo alt tip spesifikasyonu üzerindeki nicelleştirilmiş etkileri belirleme yöntemini sunmasıdır.

Başlamak için, E 12.5 evresindeki embriyolardan fare embriyonik fibroblastlarını izole edin. Bunları, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde sıvı azot içerisinde saklayın. Ardından, plat-E hücrelerini hasat edin ve hücrelerin 24 saat içinde %70 ila %80 konfluense ulaşması için altı kuyucuklu bir plakaya her kuyucuğa bir milyon hücre gelecek şekilde ekleyin.

Hücrelerin üzerini transfeksiyon medyumu ile kapatın ve standart kültür koşullarında inkübe edin. Deney gününden bir gün önce, 15 ml'lik konik polistiren tüp alın ve reaksiyon başına 60 µL düşük serumlu medyumu altı µL transfeksiyon reaktifi ile karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Transfeksiyon verimliliğindeki herhangi bir düşüşü önlemek için, transfeksiyon reaktifini doğrudan serumu azaltılmış ortama ekleyin. Ardından, reaksiyon başına toplam iki mikrogram GHMT kokteyli ekleyin ve karıştırmak için tüpe hafifçe vurun. Reaksiyonu oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin ve ardından karışımı damla damla plat-E hücrelerine ekleyin.

Transfeksiyonun tarihini ve saatini kaydedin. Transfekte edilmiş plat-E hücrelerini gece boyunca inkübe edin. Fare embriyonik fibroblastlarını ekimden bir saat önce, her kuyuya 12 millimeter fibronectin kaplı lamel ekleyerek immünositokimya için 24 kuyucuklu bir plaka hazırlayın.

Ardından, her kuyuya 300 µL sığır kollajen çözeltisi ekleyin ve plakayı bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonuna doğru, dondurulmuş bir HCN4GFP fare embriyonik fibroblast tüpünü çözdürün. Hücreleri hızlıca çözdürün, önceden ısıtılmış fibroblast medyası ile bir kez yıkayın ve canlı hücre konsantrasyonunu sayın.

Ardından, 24 kuyucuklu plaktaki kaplama solüsyonunu aspire edin ve hemen kuyucuk başına 30.000 hücreyi kolajen ve fibronektin kaplı lamellerin üzerine ekleyin. Transfeksiyondan 24 saat sonra, retroviral medyumu 0,45 mikron gözenek boyutunda sürfaktansız selüloz asetat filtreden süzün ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, son konsantrasyonu mililitre başına sekiz mikrogram olacak şekilde polybrene ekleyin.

plat-E hücrelerini iki mililitre taze transfeksiyon medyumu ile dikkatlice yenileyin. Medyumun çok hızlı değiştirilmesi hücrelerin ayrılmasına neden olabilir. Uygun şekilde bakılan plat-E hücreleri, mililitre başına ortalama on milyon enfeksiyon birimi üretir.

Hücrelerin %95'inden fazlasında görülen yüksek GFP ekspresyonu ve yoğunluğu, tipik olarak GHNT aracılı başarılı bir indüklenmiş kardiyomiyosit benzeri miyosit üretimi ile korelasyon gösterir. Ardından, kültüre edilmiş embriyonik fibroblastların ortamını aspire edin ve taze toplanmış retroviral ortamı ekleyin. Daha sonra plakayı inkübatöre geri yerleştirin ve gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, medyayı plat-E hücrelerinden embriyonik fibroblastlara tekrar aktarın. İkinci virüs toplama işleminden sonra plat-E hücrelerini atın. İndüklemeden 48 saat sonra, hücre koşullandırma medyasını aspire edin ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.

Ardından, 24 kuyucuklu plakanın her kuyucuğuna 500 µL önceden ısıtılmış indüklenmiş kardiyomiyosit benzeri miyosit medyumu ekleyin. Sonraki 12 gün boyunca medyumu iki ila üç günde bir yenileyin. İndüksiyondan 14 gün sonra medyumu dikkatlice aspire edin ve her kuyucuğu 300 µL buz gibi soğuk PBS ile durulayın.

Ardından PBS'yi uzaklaştırın, kuyuma başına 250 µL %4'lük paraformaldehit solüsyonu ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, kuyumaları 300 µL %0,1 Triton X-100 ve PBS ile beşer dakikalık üç yıkama yaparak hücreleri permeabilize edin. Son yıkamadan sonra fazla permeabilizasyon solüsyonunu aspire edin ve ardından kuyuma başına 300 µL üniversal bloklama tamponu ekleyin.

Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bloklama yapın. İndüklenmiş atriyal benzer miyositler içindeki indüklenmiş pacemaker benzeri miyositleri belirlemek için, bir çift lamı fare anti-alfa aktinin, tavuk anti-GFP ve tavuk anti-NPPA antikorları ile gece boyunca boyayın. Ertesi gün, kuyucukları yıkayın ve beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde uygun sekonder antikoru ekleyin.

Ek yıkama işlemlerinin ardından, bir cam mikroskop lamına 2,4 µL montaj medyumu ekleyin. 24 kuyucuklu plaktan bir lamelleştirme camı alın ve fazla solüsyonu uzaklaştırın. Ardından, bunu montaj medyumu bulunan cam lamın üzerine aktarın.

Her bir lam için, bir kenardan başlayarak alfa-aktinin pozitif sarkomer pozitif hücreleri tanımlamak amacıyla kırmızı floresan kanalında yukarı ve aşağı doğru tarama yapın. Sarkomer çizgilenmelerinin tanımlanması 555 nanometre dalga boyunda en kolaydır. Hücreler tanımlandıktan sonra yeşil kanala geçiş yapın ve hücrelerin pozitif olup olmadığını not edin.

Ardından, NPPA veya MYL2 boyamasını incelemek için bilgisayara geçerek uzak kırmızı 647 nanometre dalga boyunu değerlendirin. Alfa-aktinin pozitif, sarkomer pozitif, Hnc4-GFP negatif ve Nppa pozitif olan hücreler, indüklenmiş atriyal benzeri miyositlerdir. Nppa boyaması paranükleer ve noktasal olarak görünecektir.

Öncelikle, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı gibi, ekimden 24 saat sonra hücre sayısını belirleyin. Ardından, bir lamel üzerindeki her bir hücreyi alfa-aktinin ve sarkomer boyamasının uygunluğu açısından görsel olarak inceleyin ve her iki marka için pozitif boyanma gösteren hücre sayısını kaydedin. Daha sonra, bu sayıyı ekilen gerçek toplam hücre sayısına bölün.

Ortalama bir yeniden programlama deneyi, hem alfa-aktinin hem de sarkomer pozitif olan yaklaşık yüzde bir oranında hücre verecektir. 14. güne gelindiğinde deney durdurulabilir ve sarkomer organizasyonu açısından değerlendirilebilir. Bu durum, burada kırmızı renkte gösterilen pozitif alfa-aktinin boyaması ile tanımlanır.

Sadece sarkomer organizasyonu sergileyen hücreler spontan atım yapabildiğinden, bu işlem iyi bir ilk kontrol yöntemidir. Burada, Hcn4-GFP raporlayıcı farelerden elde edilen indüklenmiş pacemaker benzeri kardiyomiyositler gösterilmiştir. Bu görünümdeki üç hücre sarkomer organizasyonu sergilemektedir.

Görüntünün merkezinde Hcn4-GFP için pozitif olan üç hücre kümesi bulunmaktadır ve bunlar pacemaker hücre tipi olarak tanımlanabilir. Sol alt köşedeki bir hücre, alfa-aktinin boyaması ile gözlemlenebilmekte ancak sarkomer organizasyonu veya tanımlanabilir bir alt tip belirteci görülmemektedir. İndüklenmiş ventriküler benzer kardiyomiyosit popülasyonunda, merkezdeki hücre sarkomer organizasyonu sergilemekte olup, bu hücre aynı zamanda ventriküler kardiyomiyositlerin bir belirteci olan miyosin hafif zincir belirteci MYL-2 için de pozitif boyanmaktadır.

Uzmanlaşıldığında, plat-E hücrelerinin ekimi ve transfeksiyonu bir saat içinde gerçekleştirilebilir. Fare embriyonik fibroblastlarının indüksiyonu bir ila iki saat, 24 kuyucuklu bir plakanın tamamının mito kuantifikasyonu ise yaklaşık sekiz saat sürer. Bu prosedür uygulanırken, başarılı bir yeniden programlama deneyi için sağlıklı fare embriyonik fibroblastlarının ve yüksek titreli virüslerin temel gereksinimler olduğunu unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, bireysel indüklenmiş kardiyomiyosit alt tiplerinin nasıl oluşturulacağı ve miktarlarının nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.