Gen İfadesine Genel Bir Bakış
Gen ekspresyonu, bir hücrenin DNA'sında bulunan bilginin fonksiyonel ürünler yapmak için kullanıldığı süreçtir. Dikkatli bir şekilde düzenlenmiş bu prosedür birkaç aşamada düzenlenir ve yanlış düzenleme genellikle kanser gibi hastalıklara neden olabilir.
Bu video, gen ekspresyonu araştırmasının tarihine, temel sorulara, alandaki yöntemlere ve bu tekniklerin nasıl uygulandığına dair bir genel bakış sunmaktadır.
Gen ekspresyonu ile ilgili bazı önemli keşifleri gözden geçirerek başlayacağız.
DNA'nın genetik bilgiyi nasıl taşıyabileceğine dair ilk ikna edici model, 1953'te Francis Crick ve James Watson'ın, Rosalind Franklin'in verilerinin yardımıyla, DNA'nın yapısını çözdüğü zaman kuruldu.
Beş yıl sonra, Crick, gen ifadesi anlayışımızın bel kemiğini oluşturacak iki önemli fikir önerdi. "Dizi hipotezi", DNA'nın nükleotid dizisinin, kararsız bir RNA ara ürünü aracılığıyla, proteinlerin amino asit dizileri için bir kod olarak kullanıldığını öne sürdü. Aynı zamanda, onun "merkezi dogması", meydana gelebilecek farklı genetik bilgi akışlarını varsaydı ve özellikle, bilginin proteinden nükleik asitlere geri aktarılamayacağını savundu.
1960 yılında, François Jacob ve Jacques Monod, bakterilerdeki laktoz metabolize edici genler üzerine yaptıkları çalışmalarla, gen ekspresyonunun düzenlenmesi için bir model önerdiler. Yapısal veya enzimatik işlevleri yerine getiren "yapısal genlerin" ifadesinin, bitişik düzenleyici bölgelere bağlanan "düzenleyici genlerin" ürünleri tarafından kontrol edildiğini öne sürdüler. Artık, transkripsiyon faktörleri olarak adlandırılan proteinlerin aracılık ettiği büyük ölçüde benzer gen düzenleme modlarının tüm organizmalarda meydana geldiğini biliyoruz.
Bir yıl sonra, 1961'de Jacob, Sydney Brenner ile birlikte, Crick tarafından önerilen DNA ve proteinler arasındaki kararsız ara ürün olarak haberci veya "m"-RNA'yı keşfetti. Aynı yıl, Brenner ve Crick, DNA'daki bilginin proteinleri nasıl kodladığını belirleyen "genetik kodu" kırmaya başladılar. Bitişik nükleotidlerin her üçlüsünün veya bir "kodonun" proteinleri oluşturan 20 amino asitten birini belirlediğini belirlediler.
Önümüzdeki birkaç yıl boyunca, Marshall Nirenberg, Har Gobind Khorana ve Severo Ochoa liderliğindeki araştırmacılar, 64 olası kodonun tümü tarafından kodlanan amino asitleri tanımlamak için birden fazla yaklaşım kullandılar. Genetik kodun kırılmasıyla, bilim adamları gen ifadesinin nasıl düzenlendiğini araştırmaya devam ettiler.
1974'te Roger Kornberg ve meslektaşları, hayvanlar ve bitkiler gibi ökaryotik hücrelerdeki DNA'nın, histon proteinlerinin kompleksleri etrafında "sarıldığını" ve şimdi "nükleozomlar" olarak adlandırılan yapıları verdiğini gösterdiğinde büyük bir keşif geldi. Artık kromatin yapısındaki değişikliklerin gen regülasyonunda önemli roller oynadığını biliyoruz.
Başka bir bükülme 1977'de Phil Sharp ve Rich Roberts'ın mRNA dizilerinin karşılık gelen DNA şablonlarını tamamen tamamlayıcı olmadığını bulduklarında geldi. Şimdi intron olarak adlandırılan bazı "eksik bölgeler", "uçbirleştirme" olarak bilinen bir işlemle olgun RNA transkriptindeki protein kodlayan ekzonlar arasından çıkarılır. Beş yıl sonra, Ronald Evans'ın araştırma grubu, aynı transkriptin "alternatif" eklenmesinin, aynı proteinin farklı işlevlere sahip varyantlarını veya "izoformlarını" üretebileceğini gösterdi.
1990'lardan bu yana, gen düzenleyici ağların karmaşıklığı hakkındaki anlayışımız, RNA aracılı gen susturmanın keşfi ile önemli ölçüde genişledi. Artık, 20-30 nükleotid büyüklüğünde üyelere sahip birkaç farklı küçük RNA ailesinin, gen ekspresyonunu çeşitli şekillerde düzenlediğini biliyoruz.
Gen ekspresyonu araştırmasının tarihini gözden geçirdikten sonra, bu alandaki bazı önemli sorulara bakalım.
Araştırılan bir konu, transkripsiyon faktörlerinin genleri nasıl düzenlediğidir. Bilim adamları sadece transkripsiyon faktörlerine bağlı genomik dizileri tanımlamakla ilgilenmiyorlar, aynı zamanda düzenleyici proteinlerin sinyalleri entegre etmek ve gen ekspresyonunu düzenlemek için birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğine de bakıyorlar.
Diğer araştırmacılar alternatif uçbirleştirmeyi ve bu sürecin farklı biyolojik bağlamlarda nasıl düzenlendiğini inceler. Ek olarak, bazıları protein izoformlarının her zaman farklı, farklı işlevlere sahip olup olmadığını belirlemeye çalışıyor.
Son olarak, birçok araştırmacı küçük RNA'ların etki mekanizmasını araştırıyor ve düzenleyici hedeflerini belirlemeye çalışıyor. Küçük RNA'ların hastalıkları teşhis etmek için "biyobelirteçler" olarak kullanılıp kullanılamayacağına da artan bir ilgi var.
Şimdi, araştırmacıların gen ekspresyonunu değerlendirmek için kullandıkları araçlara bakalım.
Popüler bir yöntem, RNA'yı amplifikasyona tabi tutmadan önce tamamlayıcı veya "c"-DNA'ya dönüştüren ters transkripsiyon veya "RT"-PCR'dir. PCR sırasında DNA'ya dahil edilen floresan molekülleri dahil ederek, gen ekspresyonunu kantitatif olarak ölçmek ve sonuçları "gerçek zamanlı" olarak gözlemlemek için bu tekniği kullanmak mümkündür.
Binlerce genin ekspresyonunu aynı anda değerlendirmek için mikrodiziler kullanılabilir. Burada, DNA dizileri slaytlar üzerine "basılır", bunlar daha sonra örnek RNA'dan üretilen floresan problara hibritlenir. Elde edilen floresan modeli, ifade edilen genleri tanımlamak için kullanılabilir.
Gen ekspresyonunun profilini çıkarmak için başka bir teknik, transkriptomu veya bir hücrede ifade edilen RNA'ların tümünü sıralamaktır. Burada, RNA örneklerinden üretilen cDNA, yüksek verimli dizilemeye tabi tutulur. Mikrodizilerin aksine, transkriptom dizilimi önceden var olan genomik bilgi gerektirmez ve bilinmeyen transkriptleri veya yeni gen izoformlarını tanımlamak için kullanılabilir.
Araştırmacılar ayrıca in situ hibridizasyonu. Bu teknikte, RNA önce tamamlayıcı problarla hibritlenir, bu daha sonra görsel bir renk veya floresan sinyali üreten enzim konjuge antikorlar tarafından tanınabilir.
Raportör testi, gen regülasyonu hakkında fikir verebilecek başka bir tekniktir. Raportör gen ürünü, renk veya floresan gibi bir sinyal üretir. Raportör doğrudan ilgilenilen bir gene kaynaşmış olabilir veya bir genin transkripsiyonunu yönlendiren promotör veya daha uzak bir güçlendirici eleman gibi düzenleyici bir dizinin kontrolü altına alınabilir. Raportör sinyali daha sonra düzenleyici elemanın aktivitesi veya ilgilenilen genin ifade modeli için okuma görevi görebilir.
Son olarak, kromatin immünopresipitasyonu veya "ChIP", gen ekspresyonunu düzenlerken transkripsiyon faktörlerinin bağlandığı genomik bölgeleri tanımlamak için kullanılabilir. Burada, protein kompleksleri ve bağlandıkları DNA, antikorlar tarafından izole edilir ve hedef DNA, PCR veya dizileme ile tanımlanır.
Gen ekspresyonunu incelemek için yöntemleri inceledikten sonra, bazı uygulamalarına bakalım.
Bir popülasyon içindeki hücreler, biyolojik sonuçlara yol açabilecek gen ekspresyonunda ince farklılıklar gösterebilir. Bu çalışmada, araştırmacılar aynı kültürden bireysel insan embriyonik kök hücrelerini bir plaka üzerinde ayrı kuyucuklara yerleştirdiler. Bilim adamları, kantitatif RT-PCR kullanarak, Nanog—bir kök hücre "belirteci"—ifadesinin bir örnek içinde farklılık gösterdiğini belirlediler.
Bazı araştırmacılar, düzenleyici proteinlerin farklı izoformlarının farklı şekilde işlev görüp görmediğini araştırır. Burada, bir proteinin "uzun" ve "kısa" izoformlarının bağlanma hedeflerini belirlemek için insan bağışıklık hücrelerine ChIP uygulandı. Dizileme sonuçları, bazı gen hedeflerinin yalnızca kısa izoform tarafından tanındığını gösterdi ve bu da potansiyel fonksiyonel farklılıklara işaret etti.
Son olarak, raportör tahlilleri, mikroRNA'lar gibi küçük RNA'ların aracılık ettiği gen regülasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. MikroRNA'lar, mRNA'ların 3¢ çevrilmemiş bölgelerine bağlanarak gen ekspresyonunu inhibe edebildiğinden, bilim adamları bu bölgeyi farklı genlerden bir lusiferaz raportörüne bağladılar ve her birini bir mikroRNA ile birlikte hücrelere soktular. MikroRNA'nın gen hedefleri daha sonra lüminesans sinyali azalmış hücreler aranarak tanımlandı.
Az önce JoVE'nin gen ifadesine girişini izlediniz. Gen ekspresyonu araştırmalarındaki önemli bulguları, bu alanda öne çıkan soruları ve yöntemleri ve bazı güncel uygulamaları gözden geçirdik. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Gen ekspresyonu, bir hücrenin fonksiyonel ürünler yapmak için genetik bilgisini kullandığı karmaşık bir süreçtir. Bu süreç birden fazla aşamada düzenl…
Gen ekspresyonu, bir hücrenin DNA'sında bulunan bilginin fonksiyonel ürünler yapmak için kullanıldığı süreçtir. Dikkatli bir şekilde düzenlenmiş bu prosedür birkaç aşamada düzenlenir ve yanlış düzenleme genellikle kanser gibi hastalıklara neden olabilir.
Bu video, gen ekspresyonu araştırmasının tarihine, temel sorulara, alandaki yöntemlere ve bu tekniklerin nasıl uygulandığına dair bir genel bakış sunmaktadır.
Gen ekspresyonu ile ilgili bazı önemli keşifleri gözden geçirerek başlayacağız.
DNA'nın genetik bilgiyi nasıl taşıyabileceğine dair ilk ikna edici model, 1953'te Francis Crick ve James Watson'ın, Rosalind Franklin'in verilerinin yardımıyla, DNA'nın yapısını çözdüğü zaman kuruldu.
Beş yıl sonra, Crick, gen ifadesi anlayışımızın bel kemiğini oluşturacak iki önemli fikir önerdi. "Dizi hipotezi", DNA'nın nükleotid dizisinin, kararsız bir RNA ara ürünü aracılığıyla, proteinlerin amino asit dizileri için bir kod olarak kullanıldığını öne sürdü. Aynı zamanda, onun "merkezi dogması", meydana gelebilecek farklı genetik bilgi akışlarını varsaydı ve özellikle, bilginin proteinden nükleik asitlere geri aktarılamayacağını savundu.
1960 yılında, François Jacob ve Jacques Monod, bakterilerdeki laktoz metabolize edici genler üzerine yaptıkları çalışmalarla, gen ekspresyonunun düzenlenmesi için bir model önerdiler. Yapısal veya enzimatik işlevleri yerine getiren "yapısal genlerin" ifadesinin, bitişik düzenleyici bölgelere bağlanan "düzenleyici genlerin" ürünleri tarafından kontrol edildiğini öne sürdüler. Artık, transkripsiyon faktörleri olarak adlandırılan proteinlerin aracılık ettiği büyük ölçüde benzer gen düzenleme modlarının tüm organizmalarda meydana geldiğini biliyoruz.
Bir yıl sonra, 1961'de Jacob, Sydney Brenner ile birlikte, Crick tarafından önerilen DNA ve proteinler arasındaki kararsız ara ürün olarak haberci veya "m"-RNA'yı keşfetti. Aynı yıl, Brenner ve Crick, DNA'daki bilginin proteinleri nasıl kodladığını belirleyen "genetik kodu" kırmaya başladılar. Bitişik nükleotidlerin her üçlüsünün veya bir "kodonun" proteinleri oluşturan 20 amino asitten birini belirlediğini belirlediler.
Önümüzdeki birkaç yıl boyunca, Marshall Nirenberg, Har Gobind Khorana ve Severo Ochoa liderliğindeki araştırmacılar, 64 olası kodonun tümü tarafından kodlanan amino asitleri tanımlamak için birden fazla yaklaşım kullandılar. Genetik kodun kırılmasıyla, bilim adamları gen ifadesinin nasıl düzenlendiğini araştırmaya devam ettiler.
1974'te Roger Kornberg ve meslektaşları, hayvanlar ve bitkiler gibi ökaryotik hücrelerdeki DNA'nın, histon proteinlerinin kompleksleri etrafında "sarıldığını" ve şimdi "nükleozomlar" olarak adlandırılan yapıları verdiğini gösterdiğinde büyük bir keşif geldi. Artık kromatin yapısındaki değişikliklerin gen regülasyonunda önemli roller oynadığını biliyoruz.
Başka bir bükülme 1977'de Phil Sharp ve Rich Roberts'ın mRNA dizilerinin karşılık gelen DNA şablonlarını tamamen tamamlayıcı olmadığını bulduklarında geldi. Şimdi intron olarak adlandırılan bazı "eksik bölgeler", "uçbirleştirme" olarak bilinen bir işlemle olgun RNA transkriptindeki protein kodlayan ekzonlar arasından çıkarılır. Beş yıl sonra, Ronald Evans'ın araştırma grubu, aynı transkriptin "alternatif" eklenmesinin, aynı proteinin farklı işlevlere sahip varyantlarını veya "izoformlarını" üretebileceğini gösterdi.
1990'lardan bu yana, gen düzenleyici ağların karmaşıklığı hakkındaki anlayışımız, RNA aracılı gen susturmanın keşfi ile önemli ölçüde genişledi. Artık, 20-30 nükleotid büyüklüğünde üyelere sahip birkaç farklı küçük RNA ailesinin, gen ekspresyonunu çeşitli şekillerde düzenlediğini biliyoruz.
Gen ekspresyonu araştırmasının tarihini gözden geçirdikten sonra, bu alandaki bazı önemli sorulara bakalım.
Araştırılan bir konu, transkripsiyon faktörlerinin genleri nasıl düzenlediğidir. Bilim adamları sadece transkripsiyon faktörlerine bağlı genomik dizileri tanımlamakla ilgilenmiyorlar, aynı zamanda düzenleyici proteinlerin sinyalleri entegre etmek ve gen ekspresyonunu düzenlemek için birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğine de bakıyorlar.
Diğer araştırmacılar alternatif uçbirleştirmeyi ve bu sürecin farklı biyolojik bağlamlarda nasıl düzenlendiğini inceler. Ek olarak, bazıları protein izoformlarının her zaman farklı, farklı işlevlere sahip olup olmadığını belirlemeye çalışıyor.
Son olarak, birçok araştırmacı küçük RNA'ların etki mekanizmasını araştırıyor ve düzenleyici hedeflerini belirlemeye çalışıyor. Küçük RNA'ların hastalıkları teşhis etmek için "biyobelirteçler" olarak kullanılıp kullanılamayacağına da artan bir ilgi var.
Şimdi, araştırmacıların gen ekspresyonunu değerlendirmek için kullandıkları araçlara bakalım.
Popüler bir yöntem, RNA'yı amplifikasyona tabi tutmadan önce tamamlayıcı veya "c"-DNA'ya dönüştüren ters transkripsiyon veya "RT"-PCR'dir. PCR sırasında DNA'ya dahil edilen floresan molekülleri dahil ederek, gen ekspresyonunu kantitatif olarak ölçmek ve sonuçları "gerçek zamanlı" olarak gözlemlemek için bu tekniği kullanmak mümkündür.
Binlerce genin ekspresyonunu aynı anda değerlendirmek için mikrodiziler kullanılabilir. Burada, DNA dizileri slaytlar üzerine "basılır", bunlar daha sonra örnek RNA'dan üretilen floresan problara hibritlenir. Elde edilen floresan modeli, ifade edilen genleri tanımlamak için kullanılabilir.
Gen ekspresyonunun profilini çıkarmak için başka bir teknik, transkriptomu veya bir hücrede ifade edilen RNA'ların tümünü sıralamaktır. Burada, RNA örneklerinden üretilen cDNA, yüksek verimli dizilemeye tabi tutulur. Mikrodizilerin aksine, transkriptom dizilimi önceden var olan genomik bilgi gerektirmez ve bilinmeyen transkriptleri veya yeni gen izoformlarını tanımlamak için kullanılabilir.
Araştırmacılar ayrıca in situ hibridizasyonu. Bu teknikte, RNA önce tamamlayıcı problarla hibritlenir, bu daha sonra görsel bir renk veya floresan sinyali üreten enzim konjuge antikorlar tarafından tanınabilir.
Raportör testi, gen regülasyonu hakkında fikir verebilecek başka bir tekniktir. Raportör gen ürünü, renk veya floresan gibi bir sinyal üretir. Raportör doğrudan ilgilenilen bir gene kaynaşmış olabilir veya bir genin transkripsiyonunu yönlendiren promotör veya daha uzak bir güçlendirici eleman gibi düzenleyici bir dizinin kontrolü altına alınabilir. Raportör sinyali daha sonra düzenleyici elemanın aktivitesi veya ilgilenilen genin ifade modeli için okuma görevi görebilir.
Son olarak, kromatin immünopresipitasyonu veya "ChIP", gen ekspresyonunu düzenlerken transkripsiyon faktörlerinin bağlandığı genomik bölgeleri tanımlamak için kullanılabilir. Burada, protein kompleksleri ve bağlandıkları DNA, antikorlar tarafından izole edilir ve hedef DNA, PCR veya dizileme ile tanımlanır.
Gen ekspresyonunu incelemek için yöntemleri inceledikten sonra, bazı uygulamalarına bakalım.
Bir popülasyon içindeki hücreler, biyolojik sonuçlara yol açabilecek gen ekspresyonunda ince farklılıklar gösterebilir. Bu çalışmada, araştırmacılar aynı kültürden bireysel insan embriyonik kök hücrelerini bir plaka üzerinde ayrı kuyucuklara yerleştirdiler. Bilim adamları, kantitatif RT-PCR kullanarak, Nanog—bir kök hücre "belirteci"—ifadesinin bir örnek içinde farklılık gösterdiğini belirlediler.
Bazı araştırmacılar, düzenleyici proteinlerin farklı izoformlarının farklı şekilde işlev görüp görmediğini araştırır. Burada, bir proteinin "uzun" ve "kısa" izoformlarının bağlanma hedeflerini belirlemek için insan bağışıklık hücrelerine ChIP uygulandı. Dizileme sonuçları, bazı gen hedeflerinin yalnızca kısa izoform tarafından tanındığını gösterdi ve bu da potansiyel fonksiyonel farklılıklara işaret etti.
Son olarak, raportör tahlilleri, mikroRNA'lar gibi küçük RNA'ların aracılık ettiği gen regülasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. MikroRNA'lar, mRNA'ların 3¢ çevrilmemiş bölgelerine bağlanarak gen ekspresyonunu inhibe edebildiğinden, bilim adamları bu bölgeyi farklı genlerden bir lusiferaz raportörüne bağladılar ve her birini bir mikroRNA ile birlikte hücrelere soktular. MikroRNA'nın gen hedefleri daha sonra lüminesans sinyali azalmış hücreler aranarak tanımlandı.
Az önce JoVE'nin gen ifadesine girişini izlediniz. Gen ekspresyonu araştırmalarındaki önemli bulguları, bu alanda öne çıkan soruları ve yöntemleri ve bazı güncel uygulamaları gözden geçirdik. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Gen ekspresyonu, bir hücrenin DNA'sında bulunan bilginin fonksiyonel ürünler yapmak için kullanıldığı süreçtir. Dikkatli bir şekilde düzenlenmiş bu prosedür birkaç aşamada düzenlenir ve yanlış düzenleme genellikle kanser gibi hastalıklara neden olabilir.
Bu video, gen ekspresyonu araştırmasının tarihine, temel sorulara, alandaki yöntemlere ve bu tekniklerin nasıl uygulandığına dair bir genel bakış sunmaktadır.
Gen ekspresyonu ile ilgili bazı önemli keşifleri gözden geçirerek başlayacağız.
DNA'nın genetik bilgiyi nasıl taşıyabileceğine dair ilk ikna edici model, 1953'te Francis Crick ve James Watson'ın, Rosalind Franklin'in verilerinin yardımıyla, DNA'nın yapısını çözdüğü zaman kuruldu.
Beş yıl sonra, Crick, gen ifadesi anlayışımızın bel kemiğini oluşturacak iki önemli fikir önerdi. "Dizi hipotezi", DNA'nın nükleotid dizisinin, kararsız bir RNA ara ürünü aracılığıyla, proteinlerin amino asit dizileri için bir kod olarak kullanıldığını öne sürdü. Aynı zamanda, onun "merkezi dogması", meydana gelebilecek farklı genetik bilgi akışlarını varsaydı ve özellikle, bilginin proteinden nükleik asitlere geri aktarılamayacağını savundu.
1960 yılında, François Jacob ve Jacques Monod, bakterilerdeki laktoz metabolize edici genler üzerine yaptıkları çalışmalarla, gen ekspresyonunun düzenlenmesi için bir model önerdiler. Yapısal veya enzimatik işlevleri yerine getiren "yapısal genlerin" ifadesinin, bitişik düzenleyici bölgelere bağlanan "düzenleyici genlerin" ürünleri tarafından kontrol edildiğini öne sürdüler. Artık, transkripsiyon faktörleri olarak adlandırılan proteinlerin aracılık ettiği büyük ölçüde benzer gen düzenleme modlarının tüm organizmalarda meydana geldiğini biliyoruz.
Bir yıl sonra, 1961'de Jacob, Sydney Brenner ile birlikte, Crick tarafından önerilen DNA ve proteinler arasındaki kararsız ara ürün olarak haberci veya "m"-RNA'yı keşfetti. Aynı yıl, Brenner ve Crick, DNA'daki bilginin proteinleri nasıl kodladığını belirleyen "genetik kodu" kırmaya başladılar. Bitişik nükleotidlerin her üçlüsünün veya bir "kodonun" proteinleri oluşturan 20 amino asitten birini belirlediğini belirlediler.
Önümüzdeki birkaç yıl boyunca, Marshall Nirenberg, Har Gobind Khorana ve Severo Ochoa liderliğindeki araştırmacılar, 64 olası kodonun tümü tarafından kodlanan amino asitleri tanımlamak için birden fazla yaklaşım kullandılar. Genetik kodun kırılmasıyla, bilim adamları gen ifadesinin nasıl düzenlendiğini araştırmaya devam ettiler.
1974'te Roger Kornberg ve meslektaşları, hayvanlar ve bitkiler gibi ökaryotik hücrelerdeki DNA'nın, histon proteinlerinin kompleksleri etrafında "sarıldığını" ve şimdi "nükleozomlar" olarak adlandırılan yapıları verdiğini gösterdiğinde büyük bir keşif geldi. Artık kromatin yapısındaki değişikliklerin gen regülasyonunda önemli roller oynadığını biliyoruz.
Başka bir bükülme 1977'de Phil Sharp ve Rich Roberts'ın mRNA dizilerinin karşılık gelen DNA şablonlarını tamamen tamamlayıcı olmadığını bulduklarında geldi. Şimdi intron olarak adlandırılan bazı "eksik bölgeler", "uçbirleştirme" olarak bilinen bir işlemle olgun RNA transkriptindeki protein kodlayan ekzonlar arasından çıkarılır. Beş yıl sonra, Ronald Evans'ın araştırma grubu, aynı transkriptin "alternatif" eklenmesinin, aynı proteinin farklı işlevlere sahip varyantlarını veya "izoformlarını" üretebileceğini gösterdi.
1990'lardan bu yana, gen düzenleyici ağların karmaşıklığı hakkındaki anlayışımız, RNA aracılı gen susturmanın keşfi ile önemli ölçüde genişledi. Artık, 20-30 nükleotid büyüklüğünde üyelere sahip birkaç farklı küçük RNA ailesinin, gen ekspresyonunu çeşitli şekillerde düzenlediğini biliyoruz.
Gen ekspresyonu araştırmasının tarihini gözden geçirdikten sonra, bu alandaki bazı önemli sorulara bakalım.
Araştırılan bir konu, transkripsiyon faktörlerinin genleri nasıl düzenlediğidir. Bilim adamları sadece transkripsiyon faktörlerine bağlı genomik dizileri tanımlamakla ilgilenmiyorlar, aynı zamanda düzenleyici proteinlerin sinyalleri entegre etmek ve gen ekspresyonunu düzenlemek için birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğine de bakıyorlar.
Diğer araştırmacılar alternatif uçbirleştirmeyi ve bu sürecin farklı biyolojik bağlamlarda nasıl düzenlendiğini inceler. Ek olarak, bazıları protein izoformlarının her zaman farklı, farklı işlevlere sahip olup olmadığını belirlemeye çalışıyor.
Son olarak, birçok araştırmacı küçük RNA'ların etki mekanizmasını araştırıyor ve düzenleyici hedeflerini belirlemeye çalışıyor. Küçük RNA'ların hastalıkları teşhis etmek için "biyobelirteçler" olarak kullanılıp kullanılamayacağına da artan bir ilgi var.
Şimdi, araştırmacıların gen ekspresyonunu değerlendirmek için kullandıkları araçlara bakalım.
Popüler bir yöntem, RNA'yı amplifikasyona tabi tutmadan önce tamamlayıcı veya "c"-DNA'ya dönüştüren ters transkripsiyon veya "RT"-PCR'dir. PCR sırasında DNA'ya dahil edilen floresan molekülleri dahil ederek, gen ekspresyonunu kantitatif olarak ölçmek ve sonuçları "gerçek zamanlı" olarak gözlemlemek için bu tekniği kullanmak mümkündür.
Binlerce genin ekspresyonunu aynı anda değerlendirmek için mikrodiziler kullanılabilir. Burada, DNA dizileri slaytlar üzerine "basılır", bunlar daha sonra örnek RNA'dan üretilen floresan problara hibritlenir. Elde edilen floresan modeli, ifade edilen genleri tanımlamak için kullanılabilir.
Gen ekspresyonunun profilini çıkarmak için başka bir teknik, transkriptomu veya bir hücrede ifade edilen RNA'ların tümünü sıralamaktır. Burada, RNA örneklerinden üretilen cDNA, yüksek verimli dizilemeye tabi tutulur. Mikrodizilerin aksine, transkriptom dizilimi önceden var olan genomik bilgi gerektirmez ve bilinmeyen transkriptleri veya yeni gen izoformlarını tanımlamak için kullanılabilir.
Araştırmacılar ayrıca in situ hibridizasyonu. Bu teknikte, RNA önce tamamlayıcı problarla hibritlenir, bu daha sonra görsel bir renk veya floresan sinyali üreten enzim konjuge antikorlar tarafından tanınabilir.
Raportör testi, gen regülasyonu hakkında fikir verebilecek başka bir tekniktir. Raportör gen ürünü, renk veya floresan gibi bir sinyal üretir. Raportör doğrudan ilgilenilen bir gene kaynaşmış olabilir veya bir genin transkripsiyonunu yönlendiren promotör veya daha uzak bir güçlendirici eleman gibi düzenleyici bir dizinin kontrolü altına alınabilir. Raportör sinyali daha sonra düzenleyici elemanın aktivitesi veya ilgilenilen genin ifade modeli için okuma görevi görebilir.
Son olarak, kromatin immünopresipitasyonu veya "ChIP", gen ekspresyonunu düzenlerken transkripsiyon faktörlerinin bağlandığı genomik bölgeleri tanımlamak için kullanılabilir. Burada, protein kompleksleri ve bağlandıkları DNA, antikorlar tarafından izole edilir ve hedef DNA, PCR veya dizileme ile tanımlanır.
Gen ekspresyonunu incelemek için yöntemleri inceledikten sonra, bazı uygulamalarına bakalım.
Bir popülasyon içindeki hücreler, biyolojik sonuçlara yol açabilecek gen ekspresyonunda ince farklılıklar gösterebilir. Bu çalışmada, araştırmacılar aynı kültürden bireysel insan embriyonik kök hücrelerini bir plaka üzerinde ayrı kuyucuklara yerleştirdiler. Bilim adamları, kantitatif RT-PCR kullanarak, Nanog—bir kök hücre "belirteci"—ifadesinin bir örnek içinde farklılık gösterdiğini belirlediler.
Bazı araştırmacılar, düzenleyici proteinlerin farklı izoformlarının farklı şekilde işlev görüp görmediğini araştırır. Burada, bir proteinin "uzun" ve "kısa" izoformlarının bağlanma hedeflerini belirlemek için insan bağışıklık hücrelerine ChIP uygulandı. Dizileme sonuçları, bazı gen hedeflerinin yalnızca kısa izoform tarafından tanındığını gösterdi ve bu da potansiyel fonksiyonel farklılıklara işaret etti.
Son olarak, raportör tahlilleri, mikroRNA'lar gibi küçük RNA'ların aracılık ettiği gen regülasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. MikroRNA'lar, mRNA'ların 3¢ çevrilmemiş bölgelerine bağlanarak gen ekspresyonunu inhibe edebildiğinden, bilim adamları bu bölgeyi farklı genlerden bir lusiferaz raportörüne bağladılar ve her birini bir mikroRNA ile birlikte hücrelere soktular. MikroRNA'nın gen hedefleri daha sonra lüminesans sinyali azalmış hücreler aranarak tanımlandı.
Az önce JoVE'nin gen ifadesine girişini izlediniz. Gen ekspresyonu araştırmalarındaki önemli bulguları, bu alanda öne çıkan soruları ve yöntemleri ve bazı güncel uygulamaları gözden geçirdik. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the central dogma of gene expression?
Francis Crick's central dogma hypothesizes the different flows of genetic information that can occur in cells. It holds that information cannot be transferred from protein back to nucleic acids. This principle, established in 1958, forms a backbone of understanding how genetic information flows from DNA through RNA to proteins, establishing the directional nature of genetic information transfer.
Q2: How do transcription factors regulate gene expression?
Transcription factors are regulatory proteins that bind to adjacent regulatory sites to control the expression of structural genes. Scientists investigate how these regulatory proteins interact with one another to integrate signals and regulate gene expression. Understanding transcription factor binding sites and protein interactions helps reveal mechanisms of gene regulation across all organisms.
Q3: What role do introns and exons play in gene expression?
Introns are non-coding sequences removed from RNA transcripts during splicing, while exons are protein-coding regions that remain in mature RNA. Alternative splicing of the same transcript can produce variants called isoforms with different functions. This process, discovered in 1977, adds complexity to how a single gene can generate multiple protein products.
Q4: How does reverse transcription PCR measure gene expression?
Reverse transcription PCR, or RT-PCR, converts RNA into complementary DNA before amplification. By including fluorescent molecules during PCR, researchers can quantitatively measure gene expression and observe results in real-time using detection and quantification of nucleic acids by real time pcr techniques. This method allows scientists to assess expression levels of specific genes in samples.
Q5: What advantages does transcriptome sequencing offer over microarrays?
Transcriptome sequencing sequences all expressed RNAs in a cell by subjecting cDNA to high-throughput sequencing. Unlike microarrays, this technique does not require preexisting genomic information and can identify unknown transcripts or novel gene isoforms. This flexibility makes transcriptome sequencing valuable for discovering new genes and variants.
Q6: How can chromatin immunoprecipitation identify gene regulation sites?
Chromatin immunoprecipitation, or ChIP, isolates protein-DNA complexes using antibodies and identifies target DNA by PCR or sequencing. This technique reveals genomic sites where transcription factors bind when regulating gene expression. ChIP has been applied to study functional differences between protein isoforms and their distinct gene targets.
Q7: How do small RNAs regulate gene expression?
Small RNAs, including families with members 20-30 nucleotides in size, regulate gene expression through multiple mechanisms. MicroRNAs can inhibit gene expression by binding to the 3' untranslated regions of mRNAs. Researchers investigate small RNA mechanisms and identify their regulatory targets to understand gene silencing and explore their potential as biomarkers for disease diagnosis.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
0:39
Historical Highlights
5:02
Key Questions
6:09
Prominent Methods
8:57
Applications
10:38
Summary