Kardiyak İlaç güvenlik Taraması için insan mühendisliği kalp dokusunun Otomatik Büzülme Analizi
15 Nisan 2017
uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSC) kardiyomiyositlerini -türevlenmiş dan Burada, insan mühendisliği kalp dokusu üretimini göstermektedir. Biz hERG kanalı inhibitörü e-4031 ile büzülme kuvveti ve kasılma biçimi örnek değişiklik analiz etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem, kalp ilaç taraması için sağlamlık ve uygunluğu yüksek seviyesini gösterir.
Bu tekniğin genel amacı, ilaç taraması ve hastalık modellemesi için in vitro kasılma analiz platformu olarak kullanılabilecek üç boyutlu mühendislik kalp dokusu oluşturmaktır. Bu yöntem, kardiyak alanda hastalık modellemesi, güvenlik farmakolojisi ve gen varyantlarının veya ilaçların kasılma kuvveti üzerindeki etkileri hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kasılma kuvvetinin farklı türlerden tasarlanmış kalp dokularında steril koşullar altında, uzun süreler boyunca ölçülebilmesidir.
Bu yöntemde yeni olan bilim adamları, hücresel kalite eksikliği ile mücadele edebilirler. Ya da ortamda bir eksikliği. Kendi kendine hazırlığı optimize etmek ve bu prosedürü gösteren Anika Benzin ve Umber Saleem olacak döngülerinden kaçınmak önemlidir.
Prosedüre başlamadan önce, 24 oyuklu bir plakanın ilk yardım kuyucuklarına 1.6 mililitre ılık yüzde iki agaroz ekleyin. Ve hemen politetrafloroetileni aralayıcılara agarozun içine yerleştirin. Oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika sonra, agaroz opak hale gelecek ve katılaştığını gösterecektir.
Ara parçaları çıkarın ve PDMS raflarını, raf direği çiftleri her bir agaroz kalıba ulaşacak şekilde dökümlere yerleştirin. Tüm raflar yerleştirildiğinde, kardiyomiyositleri mililitrede en az 1.5 kez 10 ila yedi hücre konsantrasyonunda askıya alırız ve fibrinojen pıhtısı eriyene kadar serolojik pipet ile 10 ila 15 kez fibrinojen ile taze hazırlanmış sulandırma karışımını yaparız. Pipetteki sulandırma karışımının homojenliğini kontrol edin.
Daha sonra, her tasarlanmış kalp dokusu veya EHT için, 200 mikrolitrelik bir tüpte 100 mikrolitre sulandırma karışımını üç mikrolitre trombin ile karıştırın. Ve hemen bu EHT trombin karışımından 100 mikrolitreyi agaroz yuvalarına alın. Her EHT için yeni bir filtre ucu kullanın.
Tüm yuvalar sulandırma karışımı ile doldurulduktan sonra, hücre kültürü kabının kapağını kapatın ve preparatları 37 santigrat derece ve yüzde yedi karbondioksitte iki saat inkübe edin. Kuluçka işleminin sonunda, plakayı steril bir davlumbazın içine yerleştirin ve her bir kuyuyu 200 ila 500 mikrolitre ortamla örtün. Plakayı hafifçe çalkalayın ve EHT'leri inkübatöre geri koyun.
10 dakika sonra, rafları dikkatlice oyuk başına 1,5 mililitre EHT ortamı içeren 24 oyuklu yeni bir plakaya aktarın ve plakayı uygun kültür koşulları altında bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. EHT'leri her pazartesi, çarşamba ve cuma günleri, PDMS raflarını taze ortamlı ikinci bir plakaya aktararak besleyin. Dökümden yedi ila 10 gün sonra, EHT'ler PDMS raflarının direklerini saptıran spontan kasılmalar göstermelidir.
EHT'nin kasılmalarını analiz etmek için, deney günü, ölçümden iki saat önce EHT analiz cihazındaki ısıtma cihazını açın. Analizden hemen önce, eksen sisteminin gaz ve elektronik beslemelerini açın. Temel bir kayıt için, EHT plakasını EHT analiz cihazına yerleştirin ve üreticinin talimatlarına göre kasılma analiz yazılımını başlatın.
Yeni bir çalıştırma başlatmak için yazılım kılavuzu talimatlarını kullanarak, ilgili çalışma bilgilerini girmek için protokol sekmesine tıklayın. Kurulum sekmesini açın ve analiz için kuyuları seçin. Zaman kısıtlamaları nedeniyle, bu videoda yalnızca iki EHT için gösterilmiştir.
Ardından kamera görünümü sekmesine tıklayın ve otomatik şekil algılama modu ile kamera canlı modunu başlatın. 24 kuyulu çanakta seçilen her kuyu için kamera konumunu xyz koordinatlarıyla ayarlayın, her bir EHT'nin pencerenin ortasında ve odakta olmasına dikkat edin. Mavi çarpıların EHT'lerin üst ve alt uçlarında olduğundan ve EHT'lerin kasılmalarına uyacak şekilde hareket ettiğinden emin olun.
Ve her bir kuyunun kurulum konumlarını kaydetmek için konum tamam düğmesine basın. Şimdi, yazılımın bir daralma zirvesini tanımladığı kriterleri tanımlamak için parametreler sekmesine tıklayın ve zirveleri yeşil karelerle işaretleyin. Tüm kuyucuklarda parametreleri kullan düğmesine basarak girilen tüm ayarları kaydedin.
Ardından, temel EHT kasılmalarını kaydetmek ve her EHT için spontan temel kasılmayı hesaplamak için otomatik sekmesine ve başlat düğmesine tıklayın. Canlı kasılma analizi, gerçek zamanlı sekmede görüntülenecektir. Mavi haçların, EHT'lerin kasılmalarına uyması için yalnızca dikey olarak hareket ettiğinden emin olun.
İlgilenilen belirli bir ilacın kasılmalar üzerindeki etkilerini analiz etmek için, önce steril bir başlık altında protein içermeyen tiroid solüsyonu ile doldurulmuş 24 oyuklu bir plakayı aktarın ve karbon elektrotları kuyucuklara yerleştirin. EHT'leri PDMS raflarında elektrotların üzerine aktarın ve EHT'leri inkübatöre geri koyun. Yaklaşık yarım saat sonra, EHT'leri EHT analiz cihazının kilidine yerleştirin ve EHT başına 20 saniye boyunca spontan temel kasılma değerini kaydedin.
Ardından, karbon elektrotları pacing kablosuna bağlayın ve EHT'leri elektriksel olarak uyarmaya başlayın. Tüm EHT'lerin uygun şekilde tempolu olmasına dikkat ederek, tempolu taban çizgisini EHT başına 10 saniye boyunca kaydedin. İlerleme hızı sinyali artık her zirveden önce kasılma greftine dahil edilen mavi dikey çizgilerle işaretlenmiştir.
Temel kayıttan sonra, elektrotları ve PDMS raflarını ilk ilaç konsantrasyonunu içeren yeni bir 24 oyuklu plakaya aktarın ve EHT'leri 20 dakikalık bir inkübasyon için hemen EHT analiz cihazının kilidine geri koyun. Pacing kablolarını yeniden bağlayın, şekil tanımayı ayarlayın ve ilk ilaç konsantrasyonuna yanıt olarak EHT kasılmalarını kaydedin. Tüm ilaç konsantrasyonları test edildikten sonra, elde edilen tüm PDF kayıtlarını kaydedin ve her kaydı şekil tanıma ve kasılma tepe karelerinin ve artefaktlarının doğru konumlandırılması için kontrol edin.
Çevrimdışı analiz için, çalıştırma veritabanından ilgili çalıştırma için çalıştır seç'e tıklayın ve parametre sekmesinde kasılma analizi parametresini değiştirin. Ardından çevrimdışı sekmesinde, videoları yeniden analiz etmek için çevrimdışı analizi seçin. Şekil tanımayı ayarlamak ve yeni bir video dosyası kaydetmek için.
Gerçek zamanlı sekmesinde şekil tanımayı ayarlayın ve örnek incelemeyi seçin. EHT şimdi yeni pozisyonlara göre analiz edilecek. Her bir EHT'nin analizi, dokunun üst ve alt uçlarındaki şekil tanımaya dayanır.
Filme alınan EHT kasılmaları daha sonra EHT analiz cihazı yazılım algoritması tarafından otomatik olarak analiz edilir ve tepe noktaları ilgili önceden tanımlanmış kriterlere göre belirlenir. EHT kasılma analizinin uzun vadeli ölçümü, kasılma kuvveti, atım frekansı, T1 kasılması veya T2 gevşeme sürelerinde 20 saate kadar zamana bağlı belirgin bir değişiklik olmadığını göstermektedir. Yapılar için yüksek düzeyde stabilite olduğunu gösterir.
Gerçekten de, her bir EHT sinyali için sonuçlar düşük bir değişkenlikle yeniden üretilebilir. Bununla birlikte, bir hERG kanal blokerine maruz kalmak, konsantrasyondan başlayarak T2 gevşeme süresinin önemli ölçüde uzamasına neden olur. Ve daha yüksek konsantrasyonlarda düzensiz bir atım modeli.
Bir kez ustalaştıktan sonra, hazırlık uygun şekilde yapılırsa 30 dakika içinde 24 EHT oluşturulabilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, hastalık modellemesi alanındaki araştırmacıların gen varyantlarının in vitro etkisini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu modelin çok yönlülüğü, insan kaynaklı kök hücreler veya genom düzenleme teknolojisi ile birleştirilmesine izin verir.
Bu prosedürü takiben, gen transkripsiyonu ve ekspresyonu ile ilgili ek soruları yanıtlamak için histoloji veya RNA ve protein analizi gibi ek yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, EHT'lerin nasıl yayınlanacağı ve analiz edileceği konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız. Bu prosedürle ilgili herhangi bir sorunuz varsa, lütfen tereddüt etmeyin ve doğrudan bizimle iletişime geçin.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, in vitro kasılma analizi için insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSCs) üç boyutlu mühendislik yapılmış kalp dokusunun üretimini gösterir. Yöntem, kasılma kuvvetinin değerlendirilmesine ve hERG kanalı inhibitörü E-4031 gibi farmakolojik ajanların kasılma düzenleri üzerindeki etkisine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kalp dokusu mühendisliği
- Farmakoloji
- Kök hücre araştırması
Arka Plan
- Mühendislik yapılmış kalp dokuları, kalp hastalıklarını modelleyebilir.
- In vitro platformlar, ilaç tarama ve güvenlik farmakolojisi için gereklidir.
- Kasılma kuvvetini anlamak, kalp fonksiyonunu değerlendirmek için kritik öneme sahiptir.
- Mühendislik yapılmış kalp dokusunun hücresel kalitesinin korunması ve kültür koşullarının optimize edilmesi gibi zorluklar bulunmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Mühendislik yapılmış kalp dokusu üretmek için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- İlaçların kalp kasılması üzerindeki etkilerini analiz etmek.
- Gen varyantlarını ve bunların kalp fonksiyonu üzerindeki etkilerini incelemek için bir platform sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- hiPSC'den türetilen kardiyomiyositlardan mühendislik yapılmış kalp dokusunun üretilmesi.
- Steril koşullar altında kasılma kuvvetinin ölçülmesi.
- Farmakolojik ajanlara yanıt olarak kasılma düzenlerinin değerlendirilmesi.
- Hücresel kalite için kültür koşullarının optimize edilmesi.
Ana Sonuçlar
- İşlevsel mühendislik yapılmış kalp dokusunun başarılı bir şekilde üretilmesi.
- E-4031 ile kasılma düzenlerinde değişikliğin gösterilmesi.
- Yöntemin sağlamlığı, ilaç taramalarında kullanımını destekler.
- Kalp fonksiyonu üzerinde uzun vadeli çalışmalar için potansiyel.
Sonuçlar
- Yöntem, kalp araştırmaları için değerli bir araç sağlar.
- Kalp dokusundaki ilaç etkilerini in vitro olarak incelemeyi sağlar.
- Gelecekteki uygulamalar arasında hastalık modellemesi ve güvenlik farmakolojisi bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Automated contraction analysis of human engineered heart tissue provides a scalable, standardized platform for early cardiac drug safety screening, enabling quantitative assessment of contractile force and drug-induced arrhythmia risk. This approach supports mechanistic de-risking by replicating human cardiac responses to pharmacological agents like hERG inhibitors, improving target validation confidence. The method enhances predictive value in lead identification by bridging stem cell-derived models with functional readouts relevant to clinical safety outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through force-generating human heart tissue models that reflect disease-relevant contractile physiology.
- Operational Value: Supports biological de-risking by detecting drug effects on contraction kinetics and relaxation times in a human-derived system.
- Predictive Value: Generates quantitative data on T2 prolongation and beating irregularity to prioritize targets with improved cardiac safety profiles.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, sterile 3D tissues in 24-well format compatible with automated imaging and contraction analysis workflows.
- Quantitative Output: Measures shortening-based force via PDMS post deflection, enabling dose-response assessment of compounds like E-4031.
- Scalability: Allows generation of several hundred engineered heart tissues per week, limited only by cardiomyocyte availability, supporting medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses human cardiomyocytes to model contraction dynamics, improving translational alignment with human cardiac function.
- Mechanistic Continuity: Captures auxotonic contractions and relaxation parameters that reflect electromechanical coupling, supporting preclinical risk assessment.
- Decision Support: Enables replication of drug-induced contractile changes, informing go/no-go decisions in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical safety assessment, providing functional validation of molecular targets in a human tissue context.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on gene variants and drug effects by measuring real-time contractile force in engineered human heart tissue.
- Screening: Delivers reproducible, automated contraction readouts that support assay standardization and compound screening under controlled conditions.
- Analytics: Generates quantifiable parameters including contraction amplitude, beating frequency, and T2 relaxation time for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Uses human-derived tissues to bridge in vitro findings with clinical safety expectations, particularly for ion channel liabilities.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiac safety screening that can be applied across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cardiac drug response.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through automated figure recognition and controlled environmental conditions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by identifying cardiotoxic compounds early, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through quantitative safety signals derived from human heart tissue models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac tissue engineering, sterile cell culture, and cardiomyocyte handling.
- Depends on imaging hardware with XYZ axis control and automated figure recognition software for contraction detection.
- Necessitates cross-team standardization of tissue generation, drug exposure, and analysis protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to different cell sources or genetic models while maintaining tissue integrity and function.
- Limited by cardiomyocyte availability and maturation state, which affects contractile performance and assay consistency.
