Kardiyak İlaç güvenlik Taraması için insan mühendisliği kalp dokusunun Otomatik Büzülme Analizi

Bu tekniğin genel amacı, ilaç taraması ve hastalık modellemesi için in vitro bir kontraksiyon analiz platformu olarak kullanılabilecek üç boyutlu mühendislik ürünü kalp dokusu üretmektir. Bu yöntem; hastalık modellemesi, güvenlik farmakolojisi ile gen varyantlarının veya ilaçların kontraktil kuvvet üzerindeki etkileri hakkında kardiyak alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, farklı türlerden elde edilen mühendislik ürünü kalp dokularındaki kontraktil kuvvetin, steril koşullar altında ve uzun süreler boyunca ölçülebilmesidir.

Bu yöntemde yeni olan bilim insanları, hücresel kalite yetersizliği nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Veya ortamdaki eksiklikler sorun olabilir. Kendi hazırlığını optimize etmek ve döngülerden kaçınmak önemlidir. Bu prosedürü Anika Benzin ve Umber Saleem gerçekleştirecektir.

Prosedüre başlamadan önce, 24 kuyucuklu bir plakadaki ilk yardım kuyucuklarına 1,6 milliliters sıcak yüzde iki agaroz ekleyin. Ardından politetrafloroetilen ara parçaları hemen agarozun içine yerleştirin. Oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika sonra agaroz opaklaşacak ve bu durum katılaştığını belirtecektir.

Ara parçaları çıkarın ve PDMS rafları, raf desteklerinin çiftleri her bir agaroz kalıba girecek şekilde döküm alanlarına yerleştirin. Tüm raflar yerleştirildiğinde, kardiyomiyositleri minimum 1,5 x 10⁷ hücre/mL konsantrasyonda ortamda ve taze hazırlanmış fibrinojenli rekonstitüsyon karışımında, fibrinojen pıhtısı çözülene kadar serolojik pipetle 10-15 kez süspande ederiz. Pipetteki rekonstitüsyon karışımının homojenliğini kontrol edin.

Ardından, her bir mühendislik ürünü kalp dokusu (EHT) için, 200 µL'lik bir tüp içerisinde 100 µL rekonstitüsyon karışımını üç µL trombin ile karıştırın. Bu EHT trombin karışımından 100 µL'lik porsiyonları hemen agaroz yuvalarına aktarın. Her bir EHT için yeni bir filtre uç kullanın.

Tüm yuvalar rekonstitüsyon karışımıyla doldurulduğunda, hücre kültür kabının kapağını kapatın ve preparasyonları 37 °C'de ve yüzde yedi karbondioksit ortamında iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, plakayı steril bir kabine yerleştirin ve her kuyucuğu 200 ila 500 µL besiyeri ile kaplayın. Plakayı hafifçe sallayın ve EHT'leri inkübatöre geri koyun.

10 dakika sonra, rafları her kuyucuğunda 1,5 milliliters EHT besiyeri içeren yeni bir 24 kuyucuklu plakaya dikkatlice aktarın ve plakayı uygun kültür koşulları altındaki bir hücre kültür inkübatörüne yerleştirin. PDMS rafları taze besiyeri içeren ikinci bir plakaya aktararak EHT'leri her Pazartesi, Çarşamba ve Cuma günleri besleyin. Dökümden 7 ila 10 gün sonra, EHT'lerin PDMS raflarının direklerini saptıran spontan kontraksiyonlar göstermesi gerekir.

EHT'nin kasılmalarını analiz etmek için, deney günü, ölçümden iki saat önce EHT analiz cihazındaki ısıtma düzeneğini açın. Analizden hemen önce, eksen sisteminin gaz ve elektronik beslemelerini açın. Temel çizgi kaydı için EHT plakasını EHT analiz cihazına yerleştirin ve üretici talimatlarına göre kasılma analiz yazılımını başlatın.

Yeni bir çalıştırma başlatmak için yazılım kılavuzu talimatlarını kullanarak, ilgili çalışma bilgilerini girmek için protokol sekmesine tıklayın. Kurulum sekmesini açın ve analiz için kuyucukları seçin. Zaman kısıtlılığı nedeniyle, bu video içerisinde işlem yalnızca iki EHT için gösterilmiştir.

Ardından kamera görünümü sekmesine tıklayın ve otomatik figür algılama moduyla kamera canlı modunu başlatın. Her bir EHT'nin pencerenin merkezinde ve odakta olduğundan emin olarak, 24 kuyucuklu kapta seçilen her bir kuyucuk için xyz koordinatlarıyla kamera konumunu ayarlayın. Mavi artıların EHT'lerin üst ve alt uçlarında olduğundan ve EHT'lerin kasılmalarıyla uyumlu şekilde hareket ettiğinden emin olun.

Ve her bir kuyucuğun ayarlanmış konumlarını kaydetmek için position okay butonuna basın. Şimdi, yazılımın bir kontraksiyon pikini tanımlama kriterlerini belirlemek ve pikleri yeşil karelerle işaretlemek için parameters sekmesine tıklayın. Girilen tüm ayarları, use parameters on all wells butonuna basarak kaydedin.

Ardından, bazal EHT kasılmalarını kaydetmek ve her bir EHT için spontan bazal kontraktiliteyi hesaplamak için otomatik sekmesine ve başlat düğmesine tıklayın. Canlı kasılma analizi, gerçek zamanlı sekmesinde görüntülenecektir. Mavi artıların, EHT'lerin kasılmalarıyla eşleşecek şekilde yalnızca dikey olarak hareket ettiğinden emin olun.

İlgilenilen belirli bir ilacın kontraksiyonlar üzerindeki etkilerini analiz etmek için, öncelikle protein içermeyen tiroid çözeltisi ile doldurulmuş 24 kuyucuklu bir plakayı steril bir kabine transfer edin ve kuyucukların içine karbon elektrotlar yerleştirin. PDMS raflarındaki EHT'leri elektrotların üzerine transfer edin ve EHT'leri inkübatöre geri yerleştirin. Yaklaşık yarım saat sonra, EHT'leri EHT analiz cihazının kilit mekanizmasına yerleştirin ve her bir EHT için 20 saniye boyunca spontan bazal kontraktiliteyi kaydedin.

Ardından, karbon elektrotları pacing kablosuna bağlayın ve EHT'leri elektriksel olarak stimüle etmeye başlayın. Tüm EHT'lerin uygun şekilde pace edildiğinden emin olarak, her EHT için 10 saniyelik paced bazal değerleri kaydedin. Pacing sinyali şu anda, her pikin öncesinde kontraksiyon grafiğine dahil edilen mavi dikey çizgilerle işaretlenmiştir.

Bazal kayıt işleminden sonra, elektrotları ve PDMS raflarını ilk ilaç konsantrasyonunu içeren yeni bir 24 kuyucuklu plakaya aktarın ve EHT'leri 20 dakikalık inkübasyon için derhal EHT analiz cihazının kilidine yerleştirin. Pace kablolarını yeniden bağlayın, şekil tanıma ayarlarını yapın ve ilk ilaç konsantrasyonuna yanıt olarak EHT kasılmalarını kaydedin. Tüm ilaç konsantrasyonları test edildikten sonra, ortaya çıkan tüm PDF kayıtlarını kaydedin ve her bir kaydı şekil tanıma, kasılma pik karelerinin doğru konumlandırılması ve artefaktlar açısından kontrol edin.

Çevrimdışı analiz için, çalıştırmalar veri tabanından ilgili çalıştırma için "select run" seçeneğine tıklayın ve parametre sekmesinde, kontraksiyon analizi parametresini değiştirin. Ardından çevrimdışı sekmesinde, videoları yeniden analiz etmek için "offline analysis" seçeneğini belirleyin. Şekil tanımayı ayarlamak ve yeni bir video dosyası kaydetmek için.

Gerçek zamanlı sekmesindeki figür tanımayı ayarlayın ve örnek incelemeyi seçin. EHT artık yeni konumlarına göre analiz edilecektir. Her bir EHT'nin analizi, dokunun üst ve alt uçlarındaki figür tanımasına dayanmaktadır.

Kaydedilen EHT kasılmaları daha sonra EHT analiz cihazı yazılım algoritması tarafından otomatik olarak analiz edilir ve pikler, ilgili önceden tanımlanmış kriterlere göre belirlenir. EHT kasılma analizinin uzun süreli ölçümü, 20 saate kadar olan süre boyunca kasılma kuvvetinde, atım frekansında, T1 kasılma veya T2 gevşeme sürelerinde belirgin bir zamana bağlı değişim olmadığını göstermektedir. Bu durum, konstrüktlerin yüksek düzeyde stabiliteye sahip olduğuna işaret etmektedir.

Nitekim, her bir EHT sinyali için elde edilen sonuçlar düşük bir değişkenlikle tekrarlanabilmektedir. Ancak, bir hERG kanal bloklayıcısına maruz kalma, belirtilen konsantrasyondan itibaren T2 relaksasyon süresinin önemli ölçüde uzamasına ve daha yüksek konsantrasyonlarda düzensiz bir atım paternine yol açmaktadır.

Yöntem kavrandıktan sonra, hazırlık süreci düzgün şekilde yürütüldüğünde 30 dakika içinde 24 adet EHT üretilebilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, hastalık modelleme alanındaki araştırmacıların gen varyantlarının etkilerini in vitro ortamda incelemelerine olanak sağlamıştır. Bu modelin çok yönlülüğü, insan kaynaklı indüklenmiş kök hücreler veya genom düzenleme teknolojisi ile birleştirilmesine imkan tanır.

Bu prosedürün ardından, gen transkripsiyonu ve ekspresyonuna ilişkin ek soruları yanıtlamak için histoloji veya RNA ve protein analizi gibi ek yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, EHT'lerin nasıl döküldüğü ve analiz edildiği konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız. Bu prosedürle ilgili herhangi bir sorunuz olursa, lütfen tereddüt etmeyin ve doğrudan bizimle iletişime geçin.