Name: Uzun Okuma Dizi Yapmak İçin Küllemesi Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Öğrenin, küllemesi mantarından yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA izolasyonu ve uzun okuma dizileme için saflaştırma yöntemini. Bu teknik, karmaşık fungal genomları incelemeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu protokol, Ortak Genom Enstitüsü-Topluluk Dizileme Projesi'ni (#1657) desteklemek için geliştirilmiştir. Çalışma kısmen Philomathia Vakfı, Ulusal Bilim Vakfı (#0929226) ve Enerji Biyobilimleri Enstitüsü tarafından S. Somerville'e desteklendi; ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (#310030_163260) tarafından B. Keller'e. Meslektaşlarımız M. Figureroa ve M. Miller'a (Minnesota Üniversitesi), R. Panstruga'ya (RWTH Aachen Üniversitesi), C. Pedersen (Kopenhag Üniversitesi), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja'ya (California Berkeley Üniversitesi), M. Wildermuth (California Berkeley Üniversitesi), R. Wise (Iowa Eyalet Üniversitesi) ve S. Xiao'ya (Maryland Üniversitesi) cömert tavsiyeleri ve burada açıklanan protokolü geliştirirken protokollerine gönüllü oldukları için teşekkür ederiz.

Mantar Malzemesinin 1. Hazırlanması <ol><li> Külleme Büyüyen <ol><li> Aşağıdaki koşullara büyüme odalarına bitkilerin büyümesi: 22 ° C gündüz sıcaklığı, 20 ° C gece sıcaklığı,% 80 nispi nem, 14 saat gün uzunluğu ve 125 uE / m2 / s &#39;lik bir ışık yoğunluğu (floresan aydınlatma sağladığı ). </li><li> 18, 29 tarif edilen şekilde Golovinomyces cichoracearum gerilme UCSC1 salatalık bitkileri (Cucumis sativa çeşitli Bush Champion) Infect. </li></ol></li><li> Hasat Küllemesi Konidyumlar <ol><li> conidia toplandığı bir in-line filtre (11 um) ile bir küçük vakum kullanılarak aşılamadan sonra 10 gün - 7 enfekte bitkilerden hasat conidia. hafif basınç uygulanması, konıdi toplamak için yaprağın yüzeyi boyunca vakum memesi çalıştırın. Not: G. cichoracearum ortalama verimi ağır INFE gelen konidia 20 mg olanbölgede yaklaşık 130 cm2 CTED salatalık yaprağı. </li><li> temiz bir kağıt tabakası üzerine filtreden (7-8 enfekte salatalık yapraklarına yaklaşık 375 uL hacmi veya conidia) conidia yaklaşık 150 mg bir fırça. Buradan (sıvı azot içinde) önceden soğutulmuş iki 5/32 inç çapında çelik öğütme topları ile 2 ml cryovials içine konıdi aktarın. Hemen sıvı nitrojen tüpleri döndürür. -80 ° C&#39;de saklayın borular. </li></ol></li><li> Topu Mamüller tarafından Breaking Açık Konidyumlar <ol><li> Sıvı nitrojen içinde bilyalı değirmen alüminyum plakalar dondurma. Yük bilyeli değirmen rafa cryovials. Şiddetle (oda sıcaklığında) 30 döngü / s&#39;de 30 s için bilyeli değirmende conidia ve çelik topları ile cryovials sallayın. Hemen sıvı azot içinde cryovials dondurursam. NOT: Başlangıçta, öğütme sırasında hücre duvarı kopma verimliliği için 100X büyütme mikroskobu ile Konidyumların bir örneğe erişmek. 30 döngü / S, B 30 saniyelik 2 mermi - Gerekirse, ek 1 öğütmekut minimuma mermi sayısını tutmak. Optimal koşullar kurulduktan sonra bu aşamada mikroskopla konidial kırılma Rutin değerlendirme gereksizdir. </li></ol></li></ol> 2. genomik DNA saflaştırma <ol><li> Konidyumlar Liziz <ol><li> hızla çalışarak, çözdürme konidianıri önlemek bir mıknatısla cryovials çelik topları kaldırmak için. Karışım bir bulamaç elde edilinceye kadar 10 s - 700 ul 65 ° C lizis tamponu (Tablo 1) ve bir girdap 5 ekleyin. </li><li> 300 uL (65 ° C) önceden ısıtılmış% 5 (h / h) sarkosil ekleyin ve yavaşça karıştırmak için beş kez (3 s başına 1 inversiyon) ters çevirin. 65 ° C&#39;de 30 dakika boyunca inkübe edin; 10, 20 ve 30 dakika yavaşça 3 kez ters çevirin. Geniş çaplı bir pipet kullanarak, yeni 2 mL mikrosantrifüj tüpüne tüm çözüm aktarın. takip eden tüm adımlar da, yumuşak, yavaş ters çevirme ile karıştırmak ve geniş çaplı bir pipet uçları olan bir DNA-içeren çözeltiler aktarın. </li></ol></li><li> DNA Ekstraksiyon I <ol><li> kloro 1 hacim eklemeformu: izoamil alkol: yavaşça lizis çözeltisine (24 1 hacim / hacim) ve beş kez çevrilerek karıştırılmıştır. yavaşça inkübasyonun sonunda tekrar orta noktada beş kez karıştırmak ve tersini, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. 14,000 x g &#39;de 15 dakika süre ile oda sıcaklığında santrifüje. Geniş çaplı bir pipet kullanarak dikkatli bir şekilde yeni bir 2 ml mikrosantrifüj tüpüne Sulu tabaka transferi; arayüzünden madde içeren kaçının. </li></ol></li><li> DNA, yağış I <ol><li> 1 hacim oda sıcaklığında% 100 izopropanol (yaklaşık 750 uL) ilave edilir ve yavaşça, altı kez çevrilerek karıştırılmıştır. 14,000 x g &#39;de 15 dakika süre ile oda sıcaklığında santrifüje. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın. </li><li> 450 uL önceden soğutulmuş (-20 ° C)% 70 etanol ekleme. 14.000 x g&#39;de oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüje. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın. dikkatli bir şekilde ince bir pipet ucu ile süpernatantı ve atın, 3 s 1,000 x g&#39;de santrifüjleyin. 15 dakika a için pelet hava-kurutunt, oda sıcaklığı. daha uzun 15 dakika kurutmayın. </li><li> 300 uL TE pelet (10 mM Tris-CI, 1 mM etilen diamin tetra-asetik asit, pH 8.0) içinde yeniden süspanse edin. 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. Yavaşça çözelti içine gitmedi kalan malzemeyi yeniden süspanse etmek fiske. </li></ol></li><li> RNA kontaminasyonu temizlemek 10 mL RNaz A (10 mg / ml) ekleyin. Yavaşça üç kez karıştırmak için ters. 3 s 1,000 x g&#39;de santrifüjleyin. 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> DNA Ekstraksiyon II <ol><li> 300 ul fenol ekleyin: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1 h / h) ve yavaşça beş kez çevrilerek karıştırılmıştır. nazikçe inkübasyon sonunda yine yarım işaretinde beş kez karıştırın ve için tersini, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 14.000 x g&#39;de oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj. Geniş çaplı bir pipet kullanarak, yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne süpernatant aktarın. </li></ol></li><li> DNA, yağış II <ol><li> 0.01 hacim 3 M sodyum asetat pH 5.2 (approximatel eklemey3 uL) yavaşça beş kez çevrilerek karıştırılmıştır. 2.5 hacim önceden soğutulmuş (-20 ° C),% 100 etanol (yaklaşık 750 uL) ilave edilir. Yavaşça beş kez karıştırmak için ters. -20 ° C de bir gece boyunca inkübe </li><li> Santrifüj 14,000 x g&#39;de 4 ° C&#39;de 30 dakika. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın. </li><li> 450 uL önceden soğutulmuş (-20 ° C)% 70 etanol ekleme. 14,000 x g&#39;da 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın. 3 s 1,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Dikkatle ince pipet ucu ve tamamen yok olan süpernatant kaldırmak. </li><li> Oda sıcaklığında 30-60 dakika boyunca pelet hava-kurutun. 27.5 uL TE içinde pelletini. 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. Yavaşça çözelti içine gitmedi kalan malzemeyi yeniden süspanse etmek fiske. </li><li> Kısım kalite kontrol testleri için 22.5 uL TE (nihai hacim 25 ul) halinde 2.5 uL (aşağıya bakınız). dizileme için gönderilmeden önce 4 ° C&#39;de saklayın DNA örnekleri. Uzun süreli depolama, mağaza örnekleri içinve -80 ° C &#39;de yırtılmayı önlemek için donma-erime döngülerinden en aza indirir. Not: doğru pipetle zor olabilir, yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA olarak bu aşamada pipetleme dikkat ediniz, ve &quot;QC kısım&quot;, genomik DNA örneği doğru bir temsili olduğundan emin olmak için önemlidir. </li></ol></li></ol> 3. Kalite Kontrol <ol><li> Numune Saflık <ol><li> TE boş kullanarak, küçük hacimli spektrofotometrede QC alikot 1 uL yükleme ile DNA numunesi, saflığı analiz. Tutanak A260 / A280 ve A260 / A230 okumaları. Saf DNA, 1.8 ve 2.2 arasında, yaklaşık 1.8 ve A260 / A230 oranı olan bir A260 / A280 oranı olacaktır. </li></ol></li><li> Genomik DNA miktar belirlemesi, <ol><li> üreticinin talimatlarına göre bir ticari çift sarmallı DNA miktar deney kiti kullanılarak QC kısım ölçümü gerçekleştirmek. </li></ol></li><li> DNA Kalite Değerlendirmesi I <ol><li> Yük yaklaşık olarak 60 ng genomik DNA ve bir1x TAE (40 mM Tris, 20 mM asetik asit ve 1 mM EDTA, pH 8.0) içinde bir% 0.7 agaroz jeli üzerinde DNA merdiveni. 70 V 40 çalıştırmak jel tertibatına - genomik DNA bantları kadar, 45 dakika, yaklaşık merdiven iyi ve bant ayırma 2 cm belirgindir. Bu koşullar mevcut jel elektroforez aygıtı göre ayarlanması gerekebilir. </li></ol></li><li> DNA Kalite Değerlendirmesi II <ol><li> Yük, yaklaşık 60, 0.5 x TBE (44.5 mM Tris, 44.5 mM borik asit, 1 mM EDTA, pH 8.3) ve bir% 1 agaroz jeli üzerinde genomik DNA ve (değişken alanlı jel elektroforez için uygun), yüksek moleküler ağırlıklı DNA merdiveni ng 16 saat boyunca 80 kbp&#39;lik dalga palslı-alan jel elektroforezi protokolü - 5 ile 0.5x TBE tamponunda çalıştırın. </li></ol></li><li> Bakteri, mantar, ve Bitki Kirleticilerin Değerlendirilmesi <ol><li> primerler ve amplifikasyon koşulları listesini kullanarak ribozomal genlerinin uygun iç transkripsiyonlu aralayıcılar (ITS) bölgelerin yükseltilmesi için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirmekTablo 2&#39;de ed. Bir jel üzerinde elde edilen reaksiyon yük 10 uL. Not: ITS bölgesi ITS primerler mantar ile amplifiye edilmelidir külleme temsil eden bir grup. bu amplikonun ve bakteriyel veya bitki primerleri ile üretilen herhangi bir amplikon DNA kirlenme kaynağı belirlemek üzere dizilenmiştir edilmelidir. Sadece külleme ITS dizileri mantar amplikonuna bulunmalıdır. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Agrios, G. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgrios%2C+GN+%22Plant+Pathology%22">Plant Pathology</a>. , 4th, Academic Press. (1969).</li>
<li>Braun, U., Cook, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBraun%2C+U+%22Taxonomic+manual+of+the+Erysiphales+%28Powdery+Mildews%29%22">Taxonomic manual of the Erysiphales (Powdery Mildews)</a>. , CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre Utrecht. The Netherlands. (2012).</li>
<li>Both, M., Csukai, M., Stumpf, M. P. H., Spanu, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+of+Blumeria+graminis+indicate+dynamic+changes+to+primary+metabolism+during+development+of+an+obligate+biotrophic+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles of Blumeria graminis indicate dynamic changes to primary metabolism during development of an obligate biotrophic pathogen.</a> Plant Cell. 17 (7), 2107-2122 (2005).</li>
<li>Glawe, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+powdery+mildews%3A+A+review+of+the+world%27s+most+familiar+%28yet+poorly+known%29+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">The powdery mildews: A review of the world's most familiar (yet poorly known) plant pathogens.</a> Annu Rev Phytopathol. 46, 27-51 (2008).</li>
<li>Fabro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+profiling+Arabidopsis+at+the+stage+of+Golovinomyces+cichoracearum+haustorium+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression profiling Arabidopsis at the stage of Golovinomyces cichoracearum haustorium formation.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1421-1439 (2008).</li>
<li>Hückelhoven, R., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+the+plant-powdery+mildew+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of the plant-powdery mildew interaction.</a> Curr Opin Plant Biol. 14 (6), 738-746 (2011).</li>
<li>Micali, C. O., Neumann, U., Grunewald, D., Panstruga, R., O'Connell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+a+specialized+plant-fungal+interface+during+host+cell+internalization+of+Golovinomyces+orontii+haustoria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of a specialized plant-fungal interface during host cell internalization of Golovinomyces orontii haustoria.</a> Cell Microbiol. 13 (2), 210-226 (2011).</li>
<li>Chandran, D., Inada, N., Hather, G., Kleindt, C. K., Wildermuth, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+of+Arabidopsis+cells+at+the+powdery+mildew+infection+site+reveals+site-specific+processes+and+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection of Arabidopsis cells at the powdery mildew infection site reveals site-specific processes and regulators.</a> Proc Natl Acad Sci. 107 (1), 460-465 (2010).</li>
<li>Spanu, P. D., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Powdery+mildew+genomes+in+the+crosshairs%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Powdery mildew genomes in the crosshairs.</a> New Phytol. 195 (1), 20-22 (2012).</li>
<li>Vela-Corcía, D., Romero, D., Torés, J. A., De Vicente, A., Pérez-García, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+Podosphaera+xanthii+by+electroporation+of+conidia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of Podosphaera xanthii by electroporation of conidia.</a> BMC Microbiol. 15 (20), (2015).</li>
<li>Hacquard, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHacquard%2C+S+%22Advances+in+Botanical+Research%22">Advances in Botanical Research</a>. Francis, M. M. 70, Academic Press. 109-142 (2014).</li>
<li>Spanu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+expansion+and+gene+loss+in+powdery+mildew+fungi+reveal+tradeoffs+in+extreme+parasitism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome expansion and gene loss in powdery mildew fungi reveal tradeoffs in extreme parasitism.</a> Science. 330 (6010), 1543-1546 (2010).</li>
<li>Wicker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wheat+powdery+mildew+genome+shows+the+unique+evolution+of+an+obligate+biotroph%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The wheat powdery mildew genome shows the unique evolution of an obligate biotroph.</a> Nat Genet. 45 (9), 1092(2013).</li>
<li>Jones, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+genomic+structural+variation+in+the+grape+powdery+mildew+pathogen%2C+Erysiphe+necator%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Adaptive genomic structural variation in the grape powdery mildew pathogen, Erysiphe necator.</a> BMC Genomics. 15, 1081(2014).</li>
<li>Thomma, B. P. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind+the+gap%3B+seven+reasons+to+close+fragmented+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">Mind the gap; seven reasons to close fragmented genome assemblies.</a> Fungal Genet Biol. 90, 24-30 (2016).</li>
<li>Parlange, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+invasion+of+transposable+elements+accounts+for+the+large+size+of+the+Blumeria+graminis+f.sp.+tritici+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Integr+Genomics%22%5BJournal%5D)">A major invasion of transposable elements accounts for the large size of the Blumeria graminis f.sp. tritici genome.</a> Funct Integr Genomics. 11, 671-677 (2011).</li>
<li>Faino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+real-time+sequencing+combined+with+optical+mapping+yields+completely+finished+fungal+genome%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Single-molecule real-time sequencing combined with optical mapping yields completely finished fungal genome.</a> mBio. 6, (2015).</li>
<li>Adam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Erysiphe+cichoracearum+and+E.+cruciferarum+and+a+survey+of+360+Arabidopsis+thaliana+accessions+for+resistance+to+these+two+powdery+mildew+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+In%22%5BJournal%5D)">Comparison of Erysiphe cichoracearum and E. cruciferarum and a survey of 360 Arabidopsis thaliana accessions for resistance to these two powdery mildew pathogens.</a> Mol Plant Microbe In. 12 (12), 1031-1043 (1999).</li>
<li>Bourras, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+avirulence+loci+and+allele-specific+effector+recognition+control+the+PM3+race-specific+resistance+of+wheat+to+powdery+mildew%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple avirulence loci and allele-specific effector recognition control the PM3 race-specific resistance of wheat to powdery mildew.</a> Plant Cell. 27 (10), 2991-3012 (2015).</li>
<li>Joint Genome Institute DNA sample submission guidelines. , 
 <a target="_blank" href="http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/DNA-Preparation-Requirements-1.pdf">http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/DNA-Preparation-Requirements-1.pdf</a> (2016).</li>
<li>Chovatia, M., Sharma, A. Genomic DNA sample QC version 4.0. , 
 <a target="_blank" href="http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2013/11/Genomic-DNA-Sample-QC.pdf">http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2013/11/Genomic-DNA-Sample-QC.pdf</a> (2014).</li>
<li>Daum, C. iTag sample amplification QC version 1.3. , 
 <a target="_blank" href="http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/iTag-Sample-Amplification-QC-v1.3.pdf">http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/iTag-Sample-Amplification-QC-v1.3.pdf</a> (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Plant+genotyping+II%3A+SNP+technology%22">Plant genotyping II: SNP technology</a>. Henry, R. J. , CABI. Oxfordshire, UK. (2008).</li>
<li>Healey, A., Furtado, A., Cooper, T., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+a+simple+method+for+extracting+next-generation+sequencing+quality+genomic+DNA+from+recalcitrant+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species.</a> Plant Methods. 10 (21), (2014).</li>
<li>Fang, G., Hammar, S., Grumet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+and+inexpensive+method+for+removing+polysaccharides+from+plant+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA.</a> Biotechniques. 13 (1), 52-54 (1992).</li>
<li>Jordon-Thaden, I. E., Chanderbali, A. S., Gitzendanner, M. A., Soltis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+CTAB+and+TRIzol+protocols+improve+RNA+extraction+from+chemically+complex+Embryophyta%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Modified CTAB and TRIzol protocols improve RNA extraction from chemically complex Embryophyta.</a> Appl Plant Sci. 3 (5), 1400105(2015).</li>
<li>Murray, M. G., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+high+molecular+weight+plant+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.</a> Nucleic Acids Res. 8 (19), 4321-4325 (1980).</li>
<li>Greco, M., Sáez, C. A., Brown, M. T., Bitonti, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+effective+method+for+high+quality+co-extraction+of+genomic+DNA+and+total+RNA+from+low+biomass+Ectocarpus+siliculosus%2C+the+model+brown+alga%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A simple and effective method for high quality co-extraction of genomic DNA and total RNA from low biomass Ectocarpus siliculosus, the model brown alga.</a> PLoS One. 9 (5), e96470(2014).</li>
<li>Wilson, I. W., Schiff, C. L., Hughes, D. E., Somerville, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+analysis+of+powdery+mildew+disease+resistance+in+the+Arabidopsis+thaliana+accession+Kashmir-1%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci analysis of powdery mildew disease resistance in the Arabidopsis thaliana accession Kashmir-1.</a> Genetics. 158 (3), 1301-1309 (2001).</li>
<li>User Manual: Pippin Pulse Electrophoresis Power Supply. , Sage Science. 
 <a target="_blank" href="http://www.sagescience.com/wp-content/uploads/2014/01/Pippin-Pulse-User-Manual-RevH.pdf">http://www.sagescience.com/wp-content/uploads/2014/01/Pippin-Pulse-User-Manual-RevH.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Zorunlu biotrophic külleme mantar saf, yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA elde etmek için, daha önce tarif edilen yöntemlerin değiştirilmiş bir versiyonu 30 geliştirilmiştir. Bu optimize edilmiş bir protokol kullanılarak ortalama verim 150 mg conidia başına 7 mg DNA, bir önceki protokol ile elde edilenin iki katıdır. Ayrıca, ortalama boyutu 48.5 kbp boyunca yaklaşık 20 kbp yükselmiştir. Bu protokol cucumber- G. cichoacearum sisteminde optimize edildi. biotrophic mantarların, diğer kü...

<html> Pudra küfleri zorunlu biotrophic mantar bitkinin bir grup birlikte alındığında, bitki hastalık dünya çapında 1 büyük nedenidir, bu patojenler bulunmaktadır. Taksonomik ailesi Erisyphaceae 2 içinde beş kabileler halinde gruplandırılmış olan külleme 900&#39;ün üzerinde açıklanan türler vardır. ekonomik önemleri ve onların ana geliştirmek samimi bir ilişki için her iki dolayı, külleme hastalıkları&gt; 100 yıldır araştırma konusu olmuştur. enfeksiyon üzerine, toz küfler bu patojenin yararlanmak için, hücreli yapının, metabolizma ve ana moleküler biyolojide önemli değişiklikler ortaya çıkarır. Bununla birlikte, toz küfü çalışma nedeniyle bunların zorunlu yaşam tarzı ve saf kültürde mantar büyümesi yapılmamış 5, 4, 3 tarif edilmemiştir için özellikle zor olduğu,&quot;xref&quot;&gt; 6, 7, 8. Geçici transformasyon bazı türler 9, 10, rapor edilmiştir, ancak toz küfü güvenilir ve sabit bir genetik transformasyon ayrıca henüz gerçekleştirilmiş değildir. külleme genomunun sıralama ve montaj nedeniyle genomun kendisinin bir dizi özellik zor olduğu kanıtlanmıştır. Diğer mantar genomların - (180 Mbp 120) göreli ve 60 oluşur - Toz halinde küf genomları büyüktür% 90 eşit olarak dağıtılmış tekrar eden kısımlar 11. Bu elemanlar, uzun terminal tekrarı, hem de edilmemiş tekrarlayan elementleri içerir. Tek külleme türleri, Blumeria graminis f iki formae SPECIALES. sp. hordei ve f. sp. tritici (BGH sırasıyla BGT) hem de üzüm külleme Erysiphe necator, arın sıralandı ve birkaç diğerleri için taslak genomları 12, 13, 14 tamamlanmıştır. Genomların tekrarlayan doğası düzeneği zorlaştırmıştır ve tamamlanan BGH genom 2 arasında bir L50 Mb 12 ile 6,989 supercontigs içine monte edilmiştir. Büyük genomesi rağmen, toz küfler sırasıyla BGH&#39;nin ve Bgt tahmin 5.845 ve 6,540 genleri ile, protein kodlama genlerinin az sayıda sahip gibi görünmektedir. Birbirini izleyen toz küfler de hayatta kalma 11, 12, 13, 14 ev sahibi bitki üzerinde mantar bağımlılığı ile tutarlıdır başka mantarlar içerisinde gerekli olan en az 99 çekirdek genlerden yoksun görünmektedir. telomerlerin, sentromer, ribozomal RN yakın Tekrarlanan dizilerBir gen dizileri ve transpoze edilebilir elemanları zengin bolgelerın zayıf kısa okuma dizileme stratejilerinden monte edilir ve yeterince temsil genom tertibatları 15 genellikle edilir. Bu bölgelerin genom dizileri meydana boşlukların çok sorumlu olduğu düşünülen ve bu tekrar eden kısımlar 16 kendi geniş genişleme ile toz küfü için geçerli olan. Yüksek plastik genom bölümlerinin genellikle tekrar eden bölgeler 3 bulunmaktadır. Bunlar kromozom yeniden düzenlemelerinin bir alanı olarak hizmet ve genellikle bu efektör proteinlerini kodlayan genler ve ikincil metabolizma enzimleri kodlayan genler gibi güçlü selektif basınç altındaki genleri kodlayan. Tek moleküllü uzun okuma sekans teknolojilerini gelişmeler genomları 15 tekrarlamalı bölgelerde dizileme için potansiyel bir çözüm sağlar. Örneğin, Faino ve diğ. (2015) da dahil olmak üzere, uzun-dizi teknolojisi ve optik m okuma bulunduapping gen açıklamaları gen ek açıklama sayısını artırarak (ve kısmen sayısını azaltarak ya da eksik, genom içinde tekrar eden DNA dizilerinin oranını üçe bunları fungal bitki patojen Verticillium Dahlia iki soy için bir boşluk daha az genom dizisi üretmek için izin ) ve ortaya genom 17 yeniden düzenlemelerinin. en az boyutları&gt; 20 kbp bu uzun okuma dizileme teknolojileri, yüksek kaliteli, genomik DNA, yüksek konsantrasyonlarda kullanılması için, ihtiyaç vardır. Burada conidia gelen konidial toplanması, yüksek molekül ağırlıklı DNA &#39;nın arıtılması için yöntemleri tarif eder ve külleme türün Golovinomyces cichoracearum kullanarak kalite kontrol değerlendirmeleri salatalık 18 üzerinde büyümüş. Bu protokol B. Keller laboratuvar grubunda (Zürich Üniversitesi, Zürih İsviçre) 13, 19 geliştirilen bir protokol dayanmaktadırve artmış DNA verimlerine yol açan çok sayıda modifikasyonları ve büyüklüğü, DNA&gt; 48.5 kbp daha yüksek bir oranını içermektedir. Protokol ayrıca Enstitüsü 20, 21, 22 Enerji Ortak Genom United States Department of tavsiyelerine göre kalite kontrol adımlarını içerir. Liziz tamponu içerisinde yer alan her bir reaktif, ve her bir saflaştırma aşaması için mantık fonksiyonu olarak (2008) 23 Henry tarif edilmiştir. Bitki ve mikrobiyal dokularından, yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA&#39;nın izolasyonu için uygun yayınlanmış protokoller bu protokol 24, 25, 26, 27, 28 tasarımında başvurulmuştur.

<table><tbody><tr><td>MM400 Bilyalı Değirmen</td><td>Retsch</td><td>20.745.0001</td><td>Veya eşdeğer bilyalı değirmen</td></tr><tr><td>Bilyalı değirmen için 2 mL tüp</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>72.694.007</td><td></td></tr><tr><td>5/32" paslanmaz çelik freze bilyaları</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 165-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikroişlemci kontrollü 280 Serisi Su Banyosu 65 &� C'ye Önceden Ayarlanmış; C&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>Veya muadili su banyosu</td></tr><tr><td>Mikroişlemci kontrollü 280 Serisi Su Banyosu 37 °C olarak önceden ayarlanmış; C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>Veya eşdeğeri su banyosu</td></tr><tr><td>Eppendorf 5417R soğutmalı mikrosantrifüj</td><td>Krakeler Scientific&nbsp;</td><td>38-022621807</td><td>Veya eşdeğer mikrosantrifüj</td></tr><tr><td>Klorform: IAA (24: 1 v / v)</td> <td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C0549</td><td>Cilt teması veya soluma durumunda tehlikelidir. Nitril eldiven, koruyucu gözlük, laboratuvar önlüğü giyin ve kimyasal başlıkta çalışın</td></tr><tr><td>Fenol:Kloroform:IAA (25:24:1 v/v)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593031</td><td>Cilt teması veya soluma durumunda tehlikelidir. Nitril eldiven, koruyucu gözlük, laboratuvar önlüğü giyin ve kimyasal başlıkta çalışın</td></tr><tr><td>100% İzopropanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>W292907</tr><tr><td>%100 Etanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>34923</td><td>-20 ° C'ye kadar soğutun; C önceki kullanım</td></tr><tr><td>Sodyum Asetat</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Rnase, Dnaz içermez (10 mg / mL)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum metabisülfit</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P2522</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Lauril Sakroinat</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>10708976001</tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td> <td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Setiltrimetil amonyum bromür (CTAB)</td> <td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H6269</td><td></td></tr><tr><td>Uvex by Honeywell Futura Gözlükler S345C, Uvextreme</td><td>Staples</td><td>423263</td><td>Veya muadili gözlük</td></tr><tr><td>High Five COBALT nitril eldiven, LARGE</td><td>Neta Scientific</td><td>HFG-N193</td><td>Veya muadili eldivenler</td></tr><tr><td>GelRed Nükleik Asit Jel Suda 10.000x</td> leke <td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum Bromür 10 mg/mL</td><td>Biotium</td><td>40042</td><td>Cilt teması halinde tehlikelidir. Nitril eldiven ve koruyucu gözlük kullanın</td></tr><tr><td>Agarose Ultrapure Bioreagent</td><td>VWR International LLC</td><td>JT4063</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Merdiveni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERSM1332</td><td></td></tr><tr><td>8 - 48 kb CHEF DNA boyut standartları</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3707</td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>4472172</td><td>Veya eşdeğer nabız alanlı jel aparatı</td></tr><tr><td>Whatman kalitatif filtre kağıdı, Grade 1</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>WHA1001042</td><td>Veya eşdeğer büyüme odası</td></tr><tr><td>Percival Büyüme Odası</td><td>Percival</td><td>AR66LXC9</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 8000 UV-Vis Spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td>Veya eşdeğeri spektrofotometre</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Test Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P11496</td><td></td></tr><tr><td>TAE Tampon (Tris-asetat-EDTA) (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B49</td><td>Kullanmadan önce 1/50 oranında su ile seyreltin (1x'e kadar)</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12090015&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borat-EDTA, 10x Çözelti (Elektroforez)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP13334</td><td>Kullanmadan önce 1/10 oranında suyla seyreltin (1x'e kadar)</td></tr> <tr><td>Sıvı Nitrojen</td><td></td><td></td><td>Sıvı nitrojen (-196 &°; C) donma tehlikesidir. Ayrıca ısındıktan sonra hızla genişleyecektir ve sıkıca kapalı bir kapta tutulmamalıdır</td></tr></tbody></table>

uzun okuma dizi yapmak İçin küllemesi yüksek moleküler ağırlık genomik dna saflaştırılması

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

külleme mantar ekonomik açıdan önemli fungal bitki patojenlerinin bir gruptur. Nispeten küçük nedeniyle iyi gelişmiş genetik ve genomik kaynak eksikliğinden kısmen, moleküler biyoloji ve bu patojenlerin genetik az şey bilinmektedir. Bu organizmalar, genom sekanslama ve montaj engelleyici zorlaştırmıştır büyük, tekrarlayan genomlara sahiptir. Burada, tek bir toz halinde küf türleri, Golovinomyces cichoracearum yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA toplanması, ekstraksiyon, saflaştırma ve kalite kontrol değerlendirilmesi için yöntemleri tarif eder. Açıklanan protokol, optimize edilmiş bir fenol / kloroform genomik DNA izolasyonu, ardından sporlar mekanik bozulmasını içerir. Tipik verim 150 mg konidia başına 7 ug DNA kullanılmıştır. Bu prosedür kullanılarak izole edilmektedir genomik DNA, uzun okuma sekanslama (yani&gt; 48.5 kbp) için uygundur. Kalite kontrol önlemleri, genomik DNA&#39;nın boyutu ile, verim ve saflığı sağlamak için de vardırBu metot dahilinde tarif. Burada tarif edilen kalite genomik DNA dizilenmesi düzeneği ve bu da daha iyi bir anlaşılmasına yol, birden çok külleme genomlarının, karşılaştırılması için izin verir ve bu tarımsal patojen kontrolü gelişmiş olur.

G. saflaştırılan genomik DNA 60 ng temsili bir örneği, jel elektroforezi kullanılarak bir agaroz jel üzerinde yürütülmüştür cichoracearum ve palslı-alan jel elektroforez kullanılarak sırasıyla Şekil 1 ve 2 de gösterilmiştir. Marjinal geçmek ve kalite kontrolü başarısız geçiren Genomik DNA preparasyonu temsil edilmektedir. tamamen kalite kontrolü yapılan genomik DNA preparatları uzun okuma genom dizileme yaklaşımlar kull...

Burada açıklanan, uzun okunan genom dizilemede kullanılmak üzere zorunlu biyotrofik mantar patojeni olan küllemeden genomik DNA'nın ekstraksiyonu, saflaştırılması ve kalite kontrolü için bir yöntemdir.

Uzun Okuma Dizi Yapmak İçin Küllemesi Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA saflaştırılması

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Bu protokolün genel amacı, uzun okuma genom dizileme için külleme haploid konidilerinden yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA izole etmektir. Bu yöntem, çalışılması zor genomların yapısı ve bileşimi gibi bitki patojenik fungal biyoloji alanındaki temel sorulara cevap verebilir. Bu tekniğin temel avantajı, çalışılması zor bir patojenden yüksek kaliteli genomik DNA ekstraksiyonuna olanak tanımasıdır.Deneye başlamak için, konidya kriyotüplerindeki çelik bilyeleri bir mıknatıs yardımıyla hızlıca çıkarın. 700 µL 65 °C lize tamponu ekleyin ve çözeltiyi beş ila 10 saniye boyunca vorteksleyin. Beş ila 10 saniye sonra bir bulamaç oluşur.300 µL 65 °C'ye önceden ısıtılmış %5 hacimce sarkozil ekleyin ve tüpü nazikçe beş kez alt üst edin. Tüpleri 65 °C'de 30 dakika inkübe edin. Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak çözeltinin tamamını yeni bir 2 mL mikrocentrifüj tüpüne aktarın.Lizis solüsyonuna bir hacim kloroform izoamil alkol ekleyin ve karıştırmak için tüpü beş kez nazikçe ters çevirin. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon süresinin ortasında ve sonunda, karıştırmak için tüpü beş kez nazikçe ters çevirin.Ardından, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak, arayüzdeki materyalleri dahil etmekten kaçınarak sulu fazı dikkatlice yeni bir iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 750 µL hacminde oda sıcaklığında %100 isopropanol ekleyin ve tüpü nazikçe altı kez ters çevirerek karıştırın.Ardından karışımı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanla dikkatlice alın ve atın. 450 µL önceden soğutulmuş %70 etanol ekleyin.Karışımı oda sıcaklığında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın ve atın. 1000 ×g'de üç saniye boyunca santrifüjleyin.Süpernatanı ince bir pipet ucuyla dikkatlice çekin ve süpernatanı atın. Peleti oda sıcaklığında 15 dakika boyunca havada kurutun. Peleti 300 µL TE içerisinde yeniden süspande edin. DNA'yı dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin.Ertesi sabah, çözeltiye girmemiş olan DNA'yı yeniden süspand etmek için tüpü hafifçe vurun. RNA kontaminasyonunu gidermek için 10 µL RNase ekleyin. Tüpü üç kez hafifçe altüst edin ve DNA'yı 1000 ×g'de üç saniye boyunca santrifüjleyin.Ardından DNA'yı 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. 300 µL fenol kloroform izoamil alkol ekleyin, karıştırmak için tüpü beş kez yavaşça ters çevirin ve DNA'yı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun yarı süresinde ve sonunda DNA'yı karıştırmak için tüpü beş kez yavaşça ters çevirin.Ardından tüpü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak süpernatantı yeni bir 1,5 milliliter mikro santrifüj tüpüne aktarın. Üç microliter 3 molar sodyum asetat pH 5.2 ekleyin ve ardından tüpü beş kez nazikçe ters çevirin.750 µL önceden soğutulmuş %100 etanol ekleyin ve tüpü beş kez nazikçe altüst ederek karıştırın. Karışımı 20 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, tüpü 4 °C'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve atın. 450 µL önceden soğutulmuş %70 etanol ekleyin. Ardından tüpü dört °C'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.DNA çöktürüldükten sonra süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın. Kalan süpernatanı tamamen çöktürmek için tüpü 1000 ×g hızında üç saniye daha santrifüjleyin. Artık süpernatanı ince uçlu pipetle uzaklaştırın.Peleti oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika boyunca havada kurutun. Havada kurutma işleminden sonra, peleti 27.5 µL TE içinde yeniden süspande edin. Ertesi gün, çözeltiye girmemiş olan kalıntı materyalleri yeniden süspande etmek için tüpü nazikçe tersyüz edin. Kalite kontrol testleri için 2.5 µL'yi 22.5 µL TE içine alikotlayın.DNA örneklerini, sekanslama için gönderilene kadar 4 °C'de saklayın. Uzun süreli saklama için örnekleri -80 °C'de saklayın ve parçalanmayı önlemek için dondurma-çözme döngülerini en aza indirin. Protokol kullanılarak, saflaştırılmış genomik DNA ile jel elektroforezi gerçekleştirilmiş ve sonuç olarak; 20kbp üzerinde güçlü tek bir bant ve minimum yayılma ile kalite kontrolünden geçen DNA, 20kbp üzerinde tek bir bant ile sınırda sonuç veren DNA ve 20kbp altında yayılma gösteren ve 100bp'de fragmanlar içeren başarısız sonuç elde edilmiştir.Çoğunluğu 48.5kbp'den büyük olan kabul edilebilir bir DNA örneği ile çoğunluğu 20 ve 48.5kbp arasında olan sınırda bir DNA örneğini ayırt etmek için darbeli alan jel elektroforezi (PFGE) gerçekleştirilmiştir. Bu prosedürün ardından, külleme genomu hakkında ek soruları yanıtlamak için tek molekül uzun okuma sekanslama gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

purification-high-molecular-weight-genomic-dna-from-powdery-mildew

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Mikrobiyal topluluk yüksek molekül ağırlıklı ve yüksek kalitede genomik DNA izole etmek için bir metodoloji tarif edilir.

Topraklar ve tortulları Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA çıkarımı

Biz hypersaline mikrobiyal paspaslar yüksek molekül ağırlıklı DNA ayıklamak için geliştirilmiş bir protokol sağlar. Mikrobiyal hücrelerin DNA ekstraksiyonu ve saflaştırma mat matris önce ayrılır. Bu konsantrasyonları, kalite ve DNA boyutunu artırır. Bu protokol, diğer refrakter numuneler için kullanılabilir.

Mikrobiyal Paspas Yüksek Moleküler Ağırlıklı DNA çıkarımı

Örneğin, kistik fibroz hava yolunu kullanarak, el yazması bir hayvan ile ilişkili örneklerde mikrobik ve virüs toplulukları karakterize metagenomic ve metatranscriptomic yaklaşımların bir kombinasyonu içeren kapsamlı bir akışını göstermektedir.

Saf olmayan Arındırıcı: Sıralama Metagenomes ve Metatranscriptomes Kompleksi Hayvan ilişkili Örneklerinden

Bu makale, ekstrakromozomal dairesel DNA'yı (eccDNA) saflaştırmak için Circle-Seq adı verilen hassas bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, kolon saflaştırmayı, kalan doğrusal kromozomal DNA'nın çıkarılmasını, yuvarlanan daire amplifikasyonunu ve yüksek verimli dizilemeyi kapsar. Circle-Seq, ökaryotik eccDNA'nın genom ölçeğinde taranması ve genom kararsızlığı ve kopya sayısı varyasyonunun incelenmesi için geçerlidir.

Ökaryotik Hücrelerde gelen ekstrakromozomal dairesel DNA genom Arıtma

İki bitki organelleri DNA zenginleştirme yönteminin karşılaştırılması ve optimizasyonu sunulmaktadır: geleneksel diferansiyel santrifüjleme ve metilasyon durumuna dayalı toplam gDNA'nın fraksiyonlanması. Ortaya çıkan DNA miktarını ve kalitesini değerlendirir, kısa okunmuş yeni nesil dizilemede performans gösteririz ve uzun okunan tek moleküllü dizilemede kullanım potansiyelini tartışırız.

Yeni nesil Sıralama için Uygun Bitki Organelleri DNA Zenginleştirme Yöntemlerinin Optimizasyonu ve Karşılaştırmalı Analizi

Nanopore teknoloji sıralama biomolecules için geniş uygulamalar patojenler, gıda güvenliği izleme, genom analizi, metagenomic çevre izleme ve bakteriyel karakterizasyonu kimliği de dahil olmak üzere Yaşam Bilimleri içinde vardır. antibiyotik direnci. Bu makalede, metagenomic toprak DNA sıralama nanopore sıralama teknolojisini kullanarak tür tanımlayıcısı için yordam gösterilmiştir.

Nanopore DNA sıralama Metagenomic toprak analizleri için

Tek hücreli sıralama genotypic heterojenlik biyolojik sistemlerde ortaya çıkarır, ama daha fazla işlem hacmi derin topluluk kompozisyon ve işlev profil oluşturma için gerekli güncel teknolojileri eksikliği. Burada, biz bir mikrosıvısal iş akışı sıralama için tarif &gt; 50.000 tek hücreli genleri farklı popülasyonlar hücre.

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Bu iletişim kuralının amacı bilinen yalnızca kısmen bir ortak arındırıcı serisinden kolayca ayrılamayan roman dizileri bulamadı bir arada hesaplamalı ve tezgah araştırma kullanmaktır.

Eksiltici genomik tarafından roman sıra bulma

Uzun okunur dizileri büyük ölçüde karmaşık genleri ve yapısal değişim karakterizasyonu montajı kolaylaştırmak. Biz sıralama nanopore tabanlı platformlar tarafından olağanüstü uzun dizileri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Yaklaşım kilobaz okuma orta kapsama ile yüzlerce insan hücreleri oluşturmak için değiştirilen kitaplığı hazırlıklar ardından en iyi duruma getirilmiş bir DNA ekstraksiyon benimser.

Bütün genomik DNA analizi için olağanüstü uzun okunur sıralama

Burada, M. oryzae ve diğer filamentli mantarların patogenezinde yeni hedef genleri tanımlayabilen histone modifikasyonlarının genom çapındaki dağılımını analiz etmek için bir protokol sunuyoruz.

Magnaporthe oryzae'de Kromatin İmmün Önkapipitasyon Dizileme Yöntemi Kullanılarak Histone Modifikasyonlarının Genom Çapında Analizi

Burada, düşük moleküler ağırlıklı hücre dışı DNA oranını artırarak çevresel antimikrobiyal direnci (AMR) değerlendirmek için basit bir teknik sunuyoruz. % 20 -% 30 PEG ve 1.2 M NaCl ile önceki tedavi, hem genomik hem de yatay olarak transfer edilen AMR genlerinin saptanmasına izin verir. Protokol, ek optimizasyon ile kitsiz bir sürece uygundur.

Antimikrobiyal Direncin Kapsamlı Değerlendirmesi için Atık Sudan Düşük Moleküler Ağırlıklı DNA'nın Gelişmiş Ekstraksiyonu 

Öğrenin, küllemesi mantarından yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA izolasyonu ve uzun okuma dizileme için saflaştırma yöntemini. Bu teknik, karmaşık fungal genomları incelemeyi kolaylaştırır.

Uzun Okuma Dizi Yapmak İçin Küllemesi Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA saflaştırılması

Daha fazla video keşfet