Hassas kesimli Canlı Pulmoner Dendritik Hücreler Visualize'a Fare Akciğer Dilimleri

Bu yöntemin genel amacı, akciğerdeki çeşitli bağışıklık hücresi tiplerinin lokalizasyonunu ve trafiğini görselleştirmek için hassas kesimli akciğer dilimleri (PCLS) kullanmaktır. Bu yöntem, akciğerdeki bağışıklık hücrelerinin lokalizasyon ve göç paternleri gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, akciğerin üç boyutlu mimarisini koruyan canlı ex vivo doku içinde birçok etkileşimin görselleştirilebilmesidir.

Bu yöntem, inflamasyon sırasında bağışıklık hücrelerinin lokalizasyonu ve taşınması hakkında bilgi sağlayabilmesinin yanı sıra, havayolu ve düz kas dokusu kontraksiyonunu görselleştirmek için de kullanılabilir. Akciğer dokusunu toplamak için önce, altı ila 12 haftalık bir farenin karnının ortasından çenesine kadar deri ve peritonu açmak için makas kullanın ve bağırsakları karın boşluğunun yan tarafına çekin. Kanın akciğerlerden uzaklaşmasını sağlamak için vena cava inferior'u kesin ve göğüs kafesinin genişlemesine izin vermek için makasın sivri ucuyla diyaframa delik açın.

Ardından, tükürük bezlerini ve diğer dokuları trakeadan manuel olarak uzaklaştırmak için pens kullanın ve trakeanın ön tarafındaki en kalın kıkırdak bandı üzerine, 20 gauge bir iğnenin girebileceği kadar küçük bir insizyon yapmak için ince pens kullanın. Şimdi, 1,5 inçlik 20 gauge bir iğneyi bir polietilen tüp bölümüne geçirin ve tüpü yaklaşık 45 derecelik bir açıyla kesin. İğneyi bir mililitrelik bir şırıngaya takın ve şırıngaya 40 °C'de %2 düşük erime noktalı agarozdan 0,8 mL çekin.

Tüm agaroz yüklendiğinde, tüpün eğimli ucunu insizyona yerleştirin ve agarozu akciğerlere yavaşça enjekte edin. İğneyi veya şırıngayı hareket ettirmeden, iğneyi trake içerisinde sabitlemek için şırıngayı polistiren tabana bantlayın ve hayvanı en az 10 dakika boyunca 4 °C'lik saklama koşullarına yerleştirin. Agaroz katılaştıktan sonra, makas kullanarak akciğerleri dikkatlice çıkarın ve buz soğukluğundaki PBS içeren üç santimetrelik bir kaba yerleştirin.

Ardından, akciğerin trakeaya bağlanan iç kısmının aşağı bakacak şekilde doku dilimleme için lobu çevirin. Akciğer dokusunu dilimlemek için, öncelikle metal bir şırınga pistonuna küçük bir damla All Purpose No Run gel superglue sürün ve yapıştırıcıyı dairesel hareketlerle yayın. Tüm yapıştırıcı uygulandığında, pens kullanarak çıkarılan lobu trakea tarafı aşağı bakacak şekilde hemen ancak nazikçe kavrayın ve fazla sıvıyı temizlemek için lobu bir peçeteye hafifçe bastırın.

Kurutulmuş lobu dikkatlice pistonun üzerine yerleştirin ve pistonun kenarının dışına taşan fazla dokuları kesin. Metal şırınganın yanları dokunun üzerine çıkacak şekilde pistonu aşağı indirin; böylece şırınga gövdesinin tabanında, akciğerin bulunduğu ve derinliği birkaç santimetreden fazla olmayan bir kuyu oluşturun. Pistonu sabit tutmak için şırınganın alt kısmını bantla çevreleyin.

Ardından, 40 °C sıcaklıktaki %2 düşük erime noktalı agarozu, lobun üst kısmını tam olarak örtecek şekilde dikkatlice şırıngaya boşaltın ve metal şırıngayı buz gibi soğuk bir soğutma bloğu ile çevreleyin. Bir ila iki dakika sonra, numune şırıngasını otomatik dilimleyiciye yerleştirin ve yeni bıçağı hizalayın. Sonrasında, tampon tankını buz gibi soğuk PBS ile doldurun.

Step motor sürücüsünü numune şırıngasıyla hizalayın ve bandı çıkarın. Step motor sürücüsü pistonun arkasına hafifçe değene kadar şalteri hızlı ileri konumuna getirin. Dilimleyici üzerindeki doku kalınlığı, sürekli tek dilim, osilasyon ve hız ayarlarını yapın.

Ardından başlat düğmesine basın ve her bir PCLS tampon tankına düştükçe ince bir spatula kullanarak toplayıp, dilimleri buz gibi PBS içeren 24 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirin. Statik PCLS görüntüleme için, ilgilenilen anatomik bölgeyi içeren akciğer örneklerini, ilgili antikor kokteylinin 1 mL'sini içeren ayrı 3 cm'lik kaplara aktarın. Buz üzerinde, sallama işlemiyle ve ışıktan korunarak 30 ila 60 dakika beklettikten sonra, dilimleri 1 mL buz gibi PBS ile iki kez yıkayın.

Ardından, örnek başına üç santimetrelik yeni, yuvarlak tabanlı cam bir kaba 50 µL PBS ekleyin ve dilimleri hızla her bir damlaya aktararak doku parçalarının düz bir şekilde yayılmasını sağlayacak şekilde nazikçe yönlendirin. Daha sonra PBS'yi bir pipetle aspire edin, lam üzerine oda sıcaklığındaki montaj medyumundan bir damla damlatın ve ardından bir lameli yerleştirin. Dokuyu görüntülemek için kabı konfokal mikroskop tablasına 20x objektif altına yerleştirin ve karo tarama (tile scan) süresini azaltmak için konveks gövde (convex hull) ayarında dokunun kenarlarını belirlemek ve işaretlemek için karo aracını kullanın.

Ardından, özellikle kenarlar boyunca olmak üzere kesitin birden fazla alanında belirlenen aralıkların uygun olduğundan emin olarak z-stack aralığını ayarlayın. Canlı hücre görüntüleme için, ilgili antikor kokteylinde 30 dakikalık inkübasyonun ardından kesitleri iki kez bir mililitre soğuk Leibovitz 10 ile durulayın. Daha sonra, örnek başına hazneli bir lamın bir yuvasına 50 mikrolitre taze Leibovitz 10 ekleyin ve ardından her bir PCLS'yi derhal medyuma aktararak dokular düzleşene kadar nazikçe manipüle edin.

Ardından, bir pipet kullanarak her bir bölmedeki besiyerini aspire edin ve her bir PCLS'yi platin bir ağırlıkla sabitleyin. Taze hazırlanmış, buz gibi soğuk hücre dışı matriksi, jel akciğer dilimlerinin üzerine yerleştirilmesine ve dilimlerin jelin üzerinde yüzmemesine dikkat ederek her bir PCLS'nin üzerine dikkatlice pipetleyin. 37 derece Celsius'ta beş dakika bekledikten sonra, lamı 20x objektif altında 37 derece Celsius'ya ayarlanmış, önceden ısıtılmış bir konfokal mikroskop bölmesine aktarın.

Ardından, kareler arasındaki istenen aralığa göre z-yığını (z-stack) ve karo (tile) aralıklarını belirleyin; dokudaki ilgi alanını belirtmek için karo aracını ve örneği görüş alanına ortalamak için merkezlenmiş ızgara ayarını kullanın. CD11b yüksek konvansiyonel dendritik hücreler akciğer parankiminde yerleşirken, CD103 pozitif konvansiyonel dendritik hücreler öncelikle havayollarının çevresinde ve subplevral alanda bulunur. CD88 ve CD172a için eş-boyama yapılması, CD172a negatif, CD88 pozitif alveolar makrofajların; öncelikle subepitelyal alanda değil, parankimde yerleşmiş olan CD172a pozitif, CD88 pozitif interstisyel makrofajlardan ayırt edilmesini sağlar.

Bilinen bir T-hücresi markörü olan CD90.2 ile lenfanjiyogenez için gerekli olan ana bir transkripsiyon faktörünün transkripsiyonel kontrolü altındaki bir transgen olan TdTomato floresan proteininin birlikte etiketlenmesi, akciğerdeki lenfatik yapıların tanımlanmasını kolaylaştırır. CD103 pozitif konvansiyonel dendritik hücreler; CD324 eksprese eden havayolu epiteli, lenfatikler ve subplevral alan dahil olmak üzere birkaç anatomik bölgede bulunur. Hücre hareketi ve hücreler arası etkileşimler, az önce gösterildiği gibi canlı hücre görüntüleme kullanılarak kaydedilebilir.

Örneğin, temsilci deneyde, oral ova-LPS uygulamasından 16 saat sonra, CD103 pozitif dendritik hücrelerin, dört saatlik bir süre boyunca adaptif olarak transfer edilen ova-spesifik T hücreleriyle etkileşime girdiği net bir şekilde gözlemlenebilir. Uzmanlaşıldığında, doku hazırlama ve dilimleme teknikleri düzgün şekilde uygulandığı takdirde iki buçuk saatte tamamlanabilir. Bu prosedür gerçekleştirilirken, iyi bir agaroz akciğer şişirme işleminin sağlandığından ve ardından görüntüleme için hassas akciğer dilimlerinin mümkün olduğunca düz tutulduğundan emin olmak önemlidir.

Bu prosedürün ardından, çeşitli hastalık durumlarında kalsiyum sinyallemesi ve hava yolu kasılganlığı hakkındaki ek soruları yanıtlamak için PCLS'nin asetilkolin veya metakolin ilele tedavi edilmesi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, akciğerdeki bağışıklık hücrelerinin lokalizasyonunu, trafiğini ve etkileşimlerini görselleştirmek için hassas kesitli akciğer dilimlerinin nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.