Name: Hassas kesimli Canlı Pulmoner Dendritik Hücreler Visualizea Fare Akciğer Dilimleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Öğrenin hassas kesimli akciğer dilimleri yöntemiyle fare akciğerlerinde bağışıklık hücrelerinin lokalizasyonunu ve göçünü canlı görüntüleme tekniğini. Bu yöntem solunum hastalıkları ve inflamasyon araştırmalarında değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz mikroskobu ile yardım için Jeff Tucker, Erica Scappini ve Agnes Janoshazi ederim, eleştirel okuma fare kolonisinin onun yönetimi için Ligon Perrow ve Jun Chen ve Michael Sanderson doku dilimleme makinesi ile yardım ve Michael Fessler ve Derek Cain el yazması. Bu çalışma da Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı tarafından desteklenmektedir NIEHS, NIH (Zia ES102025-09), intramural dalı tarafından finanse edildi.

Bu yazıda anlatılan Hayvan deneysel prosedürler NIEHS Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Akciğer hazırlanması <ol><li> Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komiteleri tarafından sağlanan yönergelere uygun olarak spesifik patojen free koşullarda yaş 6 ve 12 hafta arasında Ev fareleri. NOT: görüntülenmistir fareler her araştırmacının ilgi alanlarına bağlı olarak naif veya tedavi olabilir. Burada, 50 uL bir toplam hacimde bir taşıyıcı olarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) kullanılarak, naif farelerde ve 100 ug ovalbumin (OVA) ve 0.1 ug lipopolisakkarit (LPS) ile tedavi edilen farelerde bağışıklık hücresi lokalizasyonunu tarif etmektedir. oropharyngeally solunum yolları içine OVA / LPS aşılamak için, hayvanlar izofluran teneffüs ile anestezi uygulandı ve dikey olarak bir lastik bant ile dişleri ile süspansiyon haline getirildi. dil forseps ile yavaşça tutulur ve yutma önlemek için bir tarafa yapılan ve 50 # edildi181; ağız boşluğu arka biriken OVA / LPS çözeltisi L önceden 17 tarif. </li><li> sodyum pentobarbital (100 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile fare euthanize ve polistiren tabanına hayvan pin. </li><li> çeneye karın kadar ortasından deri ve periton keserek makas ile karın boşluğuna açın. forseps veya makas donuk kenarı ile bir kenara bağırsak çekin ve akciğer uzak kan akıtmak için inferior vena cava makasla kesme. akciğerler kesmek için dikkatli olmak göğüs kafesinin genişlemesine izin vermek üzere makas sivri ucu ile diyafram ile delikler. </li><li> Şeffaf tükürük bezleri ve forseps ile altta yatan trakea uzak çekerek manuel dokuyu kapma ve uzakta trakeadan diğer doku. tra olsa tüm yol kesmek için dikkatli olmak, ince forseps veya makas kullanılarak kıkırdak en kalın bandın ön tarafında Nefes borusunda küçük bir kesi olunChea. kesik, bir 20 G iğne ile geçmesine imkan vermek için yeterince büyük olmalıdır. </li><li> iğnenin ucundan ileriye boru, yaklaşık 1 cm bırakarak, polietilen boru donanımının bir bölümü üzerine bir 1.5 inç, 20 G iğne kaydırın. agaroz kadar iğne içinden sıcak 0.8 mL (40 ° C),% 2 düşük bir erime noktasına çizerek şırınga, son konik bir 1 ml şırınga iğne takılır ve yük için yaklaşık 45 ° &#39;lik bir açı ile hortumu kesilir. </li><li> Trakea kesi içine boru ucunu yerleştirin ve yavaş yavaş akciğerlere agaroz enjekte edilir. iğne ya da şırınga hareket olmadan, iğne trakeanın kalmasını sağlamak için polistiren tabanına şırınga bantlayın. NOT: Enjeksiyondan sonra, akciğerler göğüs içinde büyük ve şişirilmiş olacaktır. Doğru lob, ilk önce sol lobu genişletin. Sadece bir lob genişletir, iğne (bronş geçen) çok derin olarak yerleştirilen edilmiş ve devam etmeden önce hafifçe çekmek için gerekli olacaktır. bu bölümüProsedür agaroz katılaşmaya başlamadan önce, nispeten hızlı bir şekilde yapılması gerekir. </li><li> En az 10 dakika süreyle bir baz ve bir soğuk odada yine hava borusu içinde yerleştirilmiş bir şırınga ya da buzdolabı, fare yerleştirin. Gerekirse, hayvan birkaç saate kadar, hatta video mikroskobu ile görüntü hücre göçü geçmeden eğer orada tutulabilir. </li><li> Fare soğuk sonra, dikkatli bir şekilde makas kullanılarak agaroz şişirilmiş akciğerler eksize ve buz gibi soğuk PBS ile 3 cm uzunluğunda bir tabağına yerleştirin. buz üzerinde tutun. </li><li> Doku dilimleme için istenen lobu (örneğin sağ superior lob) seçin. Emin (o trakea bağlanır) akciğerin iç kısmı tabak yüz aşağı olduğundan emin olun. Not: lob kullanılmıştır ve pistonu oryantasyon görünür olacak damar ve solunum yollarının boyutunu belirleyecektir. Burada anlatılan oryantasyon büyük hava yollarının görselleştirme ve parankimindeki için idealdir. Fareler bir büyük sol lobu ve sağda dört küçük dilimleri vardır. İçinuygun bir boyut olduğu için değil, aynı zamanda inhalasyon ajanları içindeki eşit dağılması nedeniyle orofaringeal veya intranazal aspirasyon yoluyla akciğerlere alerjenlere açıklanması sonrasında PCLS görüntüleme, sağ superior lob genellikle kısmen kesitli edilir. Ancak, diğer lob, özellikle sol lob da incelenebilir. Fare suşları veya tedaviler karşılaştırırken, aynı lobu karşılaştırmak önemlidir. </li></ol> 2. Akciğer Dilimleme NOT: üreticinin talimatlarına göre metal blok, pistonu ve metal şırınga soğutma, otomatik dilimleme makinesi kullanılarak dilimleri olun. <ol><li> Pistonun üzerine çok amaçlı küçük bir damla, hiçbir işletilen jel superglue koyun ve tutkal metal şırınga kenarlarına dokunmasına izin için özen, dairesel bir hareketle tutkal yayıldı. tutkal, şırınganın tarafı ile temas ettiği şırınga tutkal ve dalma pistonunu olacaktır. </li><li> Hemen yapıştırıcı ile piston kapsayan sonra, yavaşça kavramakAşağı trakea tarafı forseps ile eksize lob, fazla sıvının çıkması, ve dikkatli bir şekilde pistonun üzerine yerleştirmek için bir doku üzerine hafifçe sürün. Pistonun kenarının ötesine uzanan herhangi bir ilave dokusu kesin. </li><li> Metal şırınganın kenarları yukarı ve doku üzerinde, böylece oluşturma aşağı pistonu hareket iyi derin birkaç santimetre daha fazla, alt yapıştırılmış akciğer. Metal şırınga altındaki etrafında Teyp etapta bu konumda tutun. </li><li> sadece lobun üst kaplayacak şekilde dikkatli bir şekilde de içine, 40 ° C&#39;de,% 2 az eriyen agaroz dökün. </li><li> buz soğukluğunda soğutma bloğu metal şırınga Surround ve 1 lob ve agaroz serin - 2 dakika. Not: çevreleyen dokudan agaroz daha kısa bir zaman soğutma bir düzensiz kesme PCLS neden olabilir, dilimleme sırasında agaroz parçalanmasına neden olabilir. </li><li> Otomatik dilimleyicinin içine numune şırınga yükleyin ve buz PBS ile tampon tankı doldurun. hizalama<html> Numune şırınga ile motorlu sürücü adım ve alttan bant parçasını çıkarın. step motor sürücü sadece pistonun arkasına dokunana kadar hızlı ileri (FF) konumuna getiriniz. </li><li> Numune şırınga ile taze bıçak hizalayın. dilimleyici Set doku kalınlığı, sürekli / tek bir dilim, salınım ve hızı. Örneğin doku kalınlığı: 150 um, sürekli kesme (devam). salınım: 9, ve hızı: 3 - 4. başlar. Yukarıdaki ayarları belirli otomatikleştirilmiş dilimleyici özelliklerine ayarlanması gerekebilir. </li><li> bunlar tampon tankına dökülmesini ve buz soğuk PBS içeren bir 24-çukurlu plaka içinde koyun gibi ince bir spatula ya da fırça kullanılarak, her seferinde PCLS bir toplar. NOT: deneyler arasında tutarlılığı sağlamak amacıyla dilimleri tutmak önemlidir. Her akciğer, yaş, cinsiyet ve ağırlığına bağlı olarak farklı olmasına rağmen, 10. dilim, örneğin, genel olarak benzer solunum aygıtı elde edilir. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 3. Antikor Boyama <ol><li> ki potansiyel floresan spektral üste binme ve bir mikroskop tespit alma yetenekleri, ilgi konusu hücre türüne göre fluoresan ışığı ile işaretlenmiş antikor paneli tasarlama. NOT: Bir örnek olarak, DC alt seti tespiti için bir panel: CD11c / alfa X integrin - BrilliantViolet (BV), 605 (Uyarım: 405 nm, tepe emisyon: 605 nm), CD324 / E-kadherin - Alexa 488 (AF488 ) (Uyarım 488 nm, tepe emisyon: 519 nm), CD88 / C5Ra1 - Fikoeritrin (PE) (Uyarım 561 nm, tepe emisyon: 578 nm), CD103 / alfa e integrin - Allofikosiyanin (APC), (Uyarım: 633 nm Peak emisyon: 660 nm). Floresans spektral görüntüleyici araçları (Malzeme listesi) panelleri tasarlamak üzere kullanılır. </li><li> istenen antikorları ihtiva eden bir antikor kokteyli olun. <ol><li> Statik PCLS görüntüleme için, 1.5 ml microcentrifu 800 uL boyama tamponu, 100 uL Fc blocker, 50 uL normal fare serumu ve 50 ul normal sıçan serumu eklemek1 mL toplam hacim için yükümlülüğüne tüpü. canlı hücre görüntüleme, yerine boyama tamponu% 10 FBS (Leibovitz-10) ihtiva eden 800 uL Leibovitz ortamı (1 kez) kullanın. </li><li> Her bir antikorun bir istenen son konsantrasyonunu ayarlamak için antikor ekleyin. 3 cm&#39;lik çanak antikor çözüm aktarın ve kullanıma hazır oluncaya kadar karanlıkta tutun. Not: (- 5 ug / mL, genellikle 1) son konsantrasyonları gerekir her bir antikor için optimize edilmesi. </li></ol></li><li> Bu tür büyük solunum yolları veya akciğer periferinde gibi ilgi, bir anatomik bölgenin bir PCLS seçin ve 1 ml antikor çözeltisi ihtiva eden 3 cm tabak içinde yer. </li><li> 30 ya da 60 dakika boyunca yavaş yavaş sallanan buz üzerinde karanlıkta leke PCLS,. </li><li> Statik PCLS görüntüleme için, canlı hücre görüntüleme için bölüm 4. geçin bölüm 5 geçin. </li></ol> PCLS 4. Statik Görüntüleme <ol><li> antikorlarla PCLS 60 dakika inkübasyondan sonra, t çanak antikor çözüm kaldırmak ve durulamao 1 mL buz gibi soğuk PBS ile iki kez dilimler. </li><li> 3 cm yuvarlak cam alt tabak üzerine pipetle 50 uL PBS ile yıkandı. Bir spatula ya da fırça kullanılarak, düz kadar yavaşça dilim manipüle damla lekeli PCLS transferi ve yayılmış. Bir pipet ile PBS çıkarın. dilim mümkün olduğu kadar düz olmalıdır. Yukarıdaki prosedürler photobleaching önlemek için hızla yapılması gerekir. </li><li> dilime oda sıcaklığı montaj orta 1 damla yerleştirilir ve hafifçe plakasının her bir oyuğuna, cam bir lamel bırakın. Görüntüleme önce bir saat kadar 4 ° C&#39;de karanlıkta PCLS tutun. </li><li> Konfokal mikroskop altında görüntülerken, bir 20X objektif (Malzeme Listesi bakınız) kullanın. &quot;Dışbükey&quot; ayarında doku kenarlarını bulmak ve işaretlemek için &quot;çini&quot; aracını kullanın. Bu karo taramanın süresini azaltmaya yardımcı olacaktır. </li><li> z yığın aralığı belirlenmesinde, özellikle de kenarlarında, dilimin çok alanlarda kontrol grubu aralıkları buuygundur. NOT: z aralığı, doku tamamen düz bir şekilde almak çok zordur, çünkü dokunun kendisinin kalınlığından daha büyük olması gereken muhtemel olacaktır. dilim darbe ve eğrileri karşılamak için 250 um - Örneğin, bir 150 mikron kalınlığında PCLS ile, z-yığın aralığı muhtemelen 200 ayarlanması gerekecektir. 20X objektif ile 12 saat - z-yığın aralığı ve doku boyutuna bağlı olarak, her bir tam akciğer tarama 7 arasında sürer. Her akciğer tektir ve ayarları her deney için ayarlanmalıdır. </li></ol> PCLS 5. Canlı Hücre Görüntüleme <ol><li> antikorlarla PCLS 30 dakika inkübasyondan sonra, çanak antikor çözüm kaldırmak ve Leibovitz-10 soğuk 1 mL&#39;si ile iki kere dilimleri yıkayın. </li><li> Pipet taze 50 uL Leibovitz-10 bölmeli coverglass (8 yuva) uzunlamasına bir içine. , Orta PCLS aktarmak için bir spatula kullanın dilim düz olana kadar yavaşça manipüle ve yaymak. yukarıdaki prosedürlerihtiyaç photobleaching önlemek için hızla yapılacak. </li><li> Bir pipet kullanarak 50 mcL orta çıkarın. dilim mümkün olduğu kadar düz yatan tutulmayacaktır. Not: dilim kenarları bölmenin duvarına dikey olarak ters çevrilmiş durumunda kabul edilebilir bir durumdur. Bundan başka, eğer varsa, bir metal platin ağırlığı bir sonraki aşamaya geçmeden önce, dilim sabitlemek için kullanılabilir. kesilmiş ve küçük ağırlıkların içine bükülebilir platin tel biri, örneğin bağlı Malzeme Listesi bakınız. </li><li> 4 ° C soğuk oda içinde, bir faktör-düşük büyüme, 100 uL Leibovitz-10 ile fenol kırmızısı içermeyen hücre dışı matrisin 100 uL karıştırın. Bunun için önceden soğutulmuş pipet uçları kullanın veya hücre dışı matris ucu sertleşir. Not: matris ve ortamın Bu oran (1: 1), doku-kültür koşullarında PCLS basılı kadar yoğun bir jel oluşturur. </li><li> Yavaşça karıştırmak için matris pipet ve dikkatle jel lu üstüne gider emin olarak PCLS üstünde pipetdilim ng ve dilim jel üstünde yüzerek gelmez. Jel plakanın altına doğru aşağı PCLS ankraj, bir ağırlık olarak çalışması gerekir. </li><li> Dikkatli bir şekilde 37 ° C inkübatör odacıklı coverglass aktarmak ve matris ~ 5 dakika boyunca katılaşmaya sağlar. </li><li> Konfokal mikroskop önceden ısıtılmış aşamasında üzerine tüm odacıklı coverglass aktarın. görüntüleme boyunca 37 ° C&#39;de bölmeyi muhafaza edin. Leibovitz ortamı kullanıldığında CO2 kaynağı cep inkübasyon sırasında gerekli değildir. </li><li> çerçeveler arasında arzu edilen aralığına göre z-yığın aralığı ve kiremit aralığını ayarlayın. konfokal mikroskop altında görüntülerken, bir 20X objektif (Malzeme Listesi bakınız) kullanın. (Örneğin, bir 2x2 merkezli ızgara) &quot;merkezli grid&quot; ayarını kullanarak, dokuda ilgili bölgeyi belirtmek için &quot;çini&quot; aracını kullanın. </li><li> z yığın aralığı ayarı da, ayar aralıkları uygun dilimin çok alanlarda kontrol edin. NOT: zrange dokunun kalınlığını eşit olasılıkla. Her akciğer tektir ve ayarları her deney için ayarlanmalıdır. 2x2 çini ve 10 Z-yığınları, genellikle yaklaşık 1 kare / 2 dakika ile sonuçlanacaktır. Emin olun otomatik odaklanma fonksiyonu görüntüleme döneminde xy ve z-sürüklenme en aza indirmek için deneye başlamadan önce devreye girer. </li></ol>

<ol><li>Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+quantitation+of+eosinophil+and+neutrophil+recruitment+to+allergic+lung+inflammation+in+a+brown+Norway+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).</li>
<li>Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+migratory+dendritic+cells+rapidly+transport+antigen+from+the+airways+to+the+thoracic+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes.</a> J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).</li>
<li>Sung, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+lung+CD103+%28alphaE%29-beta7+integrin-positive+epithelial+dendritic+cell+population+expressing+Langerin+and+tight+junction+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins.</a> J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).</li>
<li>Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lasker+Basic+Medical+Research+Award.+Dendritic+cells%3A+versatile+controllers+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system.</a> Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).</li>
<li>Jakubzick, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph-migrating%2C+tissue-derived+dendritic+cells+are+minor+constituents+within+steady-state+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes.</a> J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).</li>
<li>Julia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+restricted+subset+of+dendritic+cells+captures+airborne+antigens+and+remains+able+to+activate+specific+T+cells+long+after+antigen+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure.</a> Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).</li>
<li>Nakano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+properties+of+pulmonary+dendritic+cells+are+determined+by+their+developmental+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage.</a> Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).</li>
<li>Nakano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+receptor+C5aR1%2FCD88+and+dipeptidyl+peptidase-4%2FCD26+define+distinct+hematopoietic+lineages+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells.</a> J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).</li>
<li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).</li>
<li>Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+lung+slices%3A+a+powerful+approach+for+assessment+of+lung+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology.</a> Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).</li>
<li>Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-cut+tissue+slices%3A+applications+in+pharmacology+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology.</a> Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).</li>
<li>Bergner, A., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+stimulates+Ca2%2B+oscillations+and+contraction+in+airway+smooth+muscle+cells+of+mouse+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).</li>
<li>Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Videomicroscopy+of+methacholine-induced+contraction+of+individual+airways+in+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices.</a> Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).</li>
<li>Henjakovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+testing+of+immune+responses+in+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).</li>
<li>Henjakovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+lung+function+measurements+in+precision-cut+lung+slices+%28PCLS%29+from+chemical+allergen-sensitized+mice+represent+a+suitable+alternative+to+in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies.</a> Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).</li>
<li>Paddenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic+vasoconstriction+of+partial+muscular+intra-acinar+pulmonary+arteries+in+murine+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices.</a> Respir Res. 7, 93(2006).</li>
<li>Wilson, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+sensitization+through+the+airway+primes+Th17-dependent+neutrophilia+and+airway+hyperresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness.</a> Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).</li>
<li>Schlitzer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cDC1-+and+cDC2-committed+DC+progenitors+reveals+early+lineage+priming+at+the+common+DC+progenitor+stage+in+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow.</a> Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).</li>
<li>Baluk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+lymphatic+growth+in+bronchus-associated+lymphoid+tissue+in+sustained+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation.</a> Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).</li>
<li>Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+cell+antigen+1+%28Thy1%2C+CD90%29+is+expressed+by+lymphatic+vessels+and+mediates+cell+adhesion+to+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium.</a> Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).</li>
<li>Truman, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProxTom+lymphatic+vessel+reporter+mice+reveal+Prox1+expression+in+the+adrenal+medulla%2C+megakaryocytes%2C+and+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets.</a> Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).</li>
<li>Wigle, J. T., Oliver, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prox1+function+is+required+for+the+development+of+the+murine+lymphatic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system.</a> Cell. 98 (6), 769-778 (1999).</li>
</ol>

Yazarlar ilan etmek çıkar çatışması var.

Burada açıklanan protokol başlangıçta akciğer içinde CDCS iki alt kümelerinin yerleri görselleştirmek için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu protokol, hali hazırda hücre canlılığı ve akciğer üç-boyutlu yapısını muhafaza ederken, bir çok farklı hücre tipleri incelemek için adapte edilebilir. İkinci özellik hücre kültürü sistemleri üzerinden önemli bir avantaj olduğunu ve nadir hücre tiplerinin tanımlanması kolaylaştırır. yöntem, akciğer PCLS oluşturulmasına dayanır ve bir arka plan renklendirmesini en aza indirerek ...

Bu tür lipopolisakarit (LPS) gibi pro-enflamatuar uyarılara solunması sonra, orada içinde, bağışık hücrelerin koordineli hareketi ve akciğer. Örneğin, nötrofiller hızla akciğer parankimi ve hava yoluna alınsın. Buna ek olarak, geleneksel bir dendritik hücreler (CDCS) olarak bilinen bir profesyonel antijen sunan hücreler, nispeten karmaşık göç desen, 1, 2 geçer. CDCS yüzey işaretleyici, kendi ekranında CD11c kısmen, akış sitometrisi kullanılarak tespit dayalı olabilir. DClerin Farklı alt-kümeleri CD103 ve CD11b 3 ayırıcı yüzey ifadesi ile ayırt edilebilir. Nefes yoluyla antijene aldıktan sonra, bir CDCS akciğer çıkmak ve antijen-spesifik T hücrelerinin 4 peptidleri sunan akciğer lenf düğümleri (LN) lenf damarları içinden yer değiştirmektedir. Bu adaptif bağışıklık r başlatılmasında kritik bir erken olaydıresponses. Bilinmeyen nedenlerden dolayı, ancak, inhale antijenleri elde tüm CDCS akciğere bırakmaz ve bu hücrelerin çoğunun, birkaç ay 5 için bu organda 6 kalır. Monosit türevli CD11c + kemokin reseptörü, CCR7 yoksun hücreler, bölgesel LN 7, 8 göç etmek mümkün olduğu için bu gözlem, bu hücrelerin gelişim kökenli ile açıklanabilir. CDCS göç potansiyeli de akciğer içindeki anatomik pozisyona göre, en azından kısmen, tespit edilir gibi görünmektedir. Bununla birlikte, akciğerdeki CDCS bu farklı popülasyonlarda kesin yeri tam olarak karakterize edilmemiştir. Akciğer içinde ve yöneltmek moleküllerin bağışıklık hücre lokalizasyonu iyileştirilmiş bir bilgi, akciğerin bağışıklık sistemi aktive olur nasıl daha iyi anlamak için gereklidir. PCLS olmak artıyorakciğer yapısının 9, 10 yapısal bütünlüğünü korurken, ly, hücresel konum ve hücre-hücre etkileşimleri görselleştirmek için bir eks vivo yaklaşımı olarak da kullanılır. PCLS fareler, sığır, maymun, koyun, at, ve insanlar 11 dahil olmak üzere birçok türün, akciğerlerini incelemek için kullanılmıştır. Bu tekniğin önemli bir avantajı, yaklaşık 20 dilim böylece ayrı ayrı deneyler için gerekli hayvan sayısını azaltmak, bir fare akciğer Tek bir lobdan elde hazırlanabilir olmasıdır. DCler, makrofajlar, nötrofiller ve T hücreleri dahil olmak üzere hemen hemen tüm immün hücre tipleri, PCLS içinde mevcut olan ve normal yapısını korur. PCLS de asetilkolin 12 veya metakolin 13 ile tedaviden sonra, kalsiyum sinyal ve solunum yolu düz kas hücrelerinin kasılma incelemek için kullanılabilir. Bu yaklaşımda, akciğer sadece küçük bir kısmı, birmikroskobik alyzed ancak bir çalışma PCLS hava yolu daralması ölçümleri dilim dilim sadece yaklaşık% 10 farklılık gösterir ve bu varyans intakt hayvanlarda 14 akciğer fonksiyon testleri kullanılarak görülenle kıyaslanabilir olduğunu bildirdi. Diğer araştırmacılar, LPS 15 ile inkübe edildikten sonra, sitokin ekspresyon ve hücre yüzey markörlerinin değişiklikleri incelemek için bir eks vivo yaklaşımı olarak PCLS kullandık. PCLS aynı zamanda küçük içi asinar arterlerde pulmoner hipoksik vazokonstriksiyon bir ex vivo modelinde kullanılmıştır. Bu damarlar kesilmiş arter segmentler veya kalmanın damar 16 analizinden kayıtları gibi diğer prosedürler, ulaşılamıyor akciğer kısmında yer almaktadır. Bizim laboratuvar öncelikle bir in vivo ateşli güdünün ardından bağışıklık hücresi kalıcı halde canlı akciğer dokusunda lokalize edilmesini ve görselleştirmek için PCLS kullanmıştır. aşağıdaki gibi biz bunun için geliştirdik yöntemlerdir.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Prox1-TdDomates transgenik fareler&nbsp;</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>018128</td><td>B6; 129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J</td></tr><tr><td>OT-II OVA'ya özgü TCR x Nur77-GFP transgenik fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>004194, 016617</td><td>B6. Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J&nbsp;</td></tr><tr><td>Rag1 nakavt fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>002216</td><td>B6.129S7-Rag1tm1Mom/J</td></tr><tr><td>Ovalbumin, Düşük Endo, Saflaştırılmış</td><td>Worthington Biyokimya Şirketi</td><td>LS003059</td><td></td></tr><tr>Escherichia coli <td>Sigma-Aldrich Co.'</td><td>dan lipopolisakkaritler</td>.<td>L2630-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen boru (Steril Olmayan) 100 ft</td><td>BD Teşhis Sistemleri</td><td>427421</td><td>0,86 mm iç çap, 1,27 mm dış çap</td></tr><tr><td>GeneMate Elek GQA Düşük Eriyik Agaroz BioExpress</td><td></td><td>E-3112-125</td><td>PBS içinde 70 ° C'de çözülmüş %2'lik çözelti; C ve 40 ° C'de tutuldu.</td></tr><tr><td>Sıkıştırma VF-300</td><td>Hassas Aletler, Inc.</td><td>VF-300</td><td></td></tr><tr><td>Çift Kenarlı Paslanmaz Tıraş Bıçağı Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>72000</td><td>Tek Kullanımlık; 250/kutu. Her akciğer için bıçak değiştirilmelidir.</td></tr><tr><td>Krazy Glue Çok Amaçlı Anında Jel</td><td>VWR</td><td>500033-484</td><td>Yerel eczanelerde genellikle 3 $ / tüp karşılığında bulunur&nbsp;</td></tr><tr><td>Leibovitz'in L-15 Orta, fenol kırmızısı içermeyen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Normal Sıçan Serumu (NRS)</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>012-000-120</td><td></td></tr><tr><td>Normal Fare Serumu (NMS)</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>015-000-120</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Boyama Tamponu</td><td>Evde Yapılan</td><td>N/A</td><td>PBS, %0.5 sığır serum albümini, %0.1 NaN3, pH 7.4</td></tr><tr><td>Fc Bloker (anti-CD16/32 antikorları)</td><td>Evde Üretilmiştir</td> N<td>/A</td><td>Kültürlenmiş hibridoma hücre hattının süpernatantı 2.4G2</td></tr><tr><td>Anti-fare CD11b eFluor 450 eBioscience</td><td></td><td>48-0112-80</td><td>Anti-fare CD11b eFluor 450 (klon: M1/70)&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-fare CD11c Brilliant Violet 605</td><td>BioLegend</td><td>101237</td><td>Brilliant Violet 605 anti-fare CD11c (klon: M1 / 70)</td></tr><tr><td>Anti-fare CD11c Phycoerythrin</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-82</td><td>PE konjuge anti-fare CD11c (klon: N418)</td></tr><tr><td>Anti-fare CD11c Allofikosiyanin</td><td>BD Phamingen</td><td>550261</td><td>APC etiketli anti-fare CD11c 9klon: HL3)</td></tr><tr><td>Anti-fare CD88 Phycoerythrin</td><td>BioLegend</td><td>135806</td><td>PE anti-fare CD88 (klon: 20/70)</td></tr><tr><td>Anti-fare CD103 Allofikosiyanin</td><td>eBioscience</td><td>17-1031-82</td><td>Anti-fare CD103 APC (klon: 2E7)</td></tr><tr><td>Anti-fare CD90.2 / Thy1.2 eF450</td><td>eBioscience</td><td>48-0902-82</td><td>Anti-fare CD90.2 eFluor 450 (klon: 53-2.1)</td></tr><tr><td>Anti-fare CD172a / Sirp1a Allofikosiyanin</td><td>eBioscience</td><td>17-1721-82</td><td>Anti-fare CD172a APC (klon: P84)</td></tr><tr><td>Anti-fare CD324 Parlak Menekşe 421</td><td>BD Horizon</td><td>564188</td><td>BV421 fare anti-E Cadherin (klon: 5E8, 5E8-G9-B4 olarak da bilinir)</td></tr><tr><td>Anti-fare CD324 Alexa Fluor 488</td><td>eBioscience</td><td>53-3249-82</td><td>Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Un 488 (klon: DECMA-1)</td></tr><tr><td>Anti-fare CD324 Alexa Fluor 647</td><td>eBioscience</td><td>51-3249-82</td><td>Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Un 647 (klon: DECMA-1)</td></tr><tr><td>Cam Tabanlı Mikro Kuyu Kapları 35 mm petri kabı, 14 mm Mikro kuyu, No. 1.5 kapak camı</td><td>MatTek Corperation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Odacıklı Kapak</td><td>Camı ThermoFisher Scientific</td><td>155411PK&nbsp;</td><td>16'lı Paket</td></tr><tr><td>15 mm Lamel, No. 1.5 Cam Kalınlığı</td><td>MatTek Kaplama</td><td>PCS-1.5-15</td><td></td></tr><tr><td>Çıplak Platin Tel</td><td>World Hassas Aletler</td><td>PTP201</td><td>0.020" (0.5 mm) çap ~1 cm uzunluğunda parçalar halinde kesilmiş ve "L" şeklinde bükülmüş</td></tr><tr><td>ProLong Altın Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36934</td><td>4 &°C'de tutun; C, kullanmadan önce oda sıcaklığına ısıtın.</td></tr><tr><td>Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) bazal membran matrisi, fenol kırmızısı içermez, *LDEV içermez</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 880 çoklu foton lazer tarama mikroskobu</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Zen Black yazılım sürümü 8.1, 2012 (Zeiss)</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objektif ödünç verir</td><td>Carl Zeiss</td><td>420650-9901-000</td><td></td></tr></tbody></table>

hassas kesimli canlı pulmoner dendritik hücreler visualize&#39;a fare akciğer dilimleri

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

alerjenler ve patojenlerin solunması akciğer immün hücre tiplerinde çeşitli birden çok değişiklik ortaya çıkarmaktadır. Akış sitometrisi bağışıklık hücreleri üzerinde hücre yüzey proteinlerinin kantitatif analizi için güçlü bir tekniktir, ancak bu akciğer içinde, bu hücrelerin lokalizasyonunda ve göç desen hakkında bilgi vermez. Benzer şekilde, kemotaksi deneyleri, in vitro olarak kemotaktik faktörlere yanıt hücrelerinin değişim potansiyelini araştırmak için yapılabilir, ancak bu deneyler, sağlam akciğer kompleks ortam yeniden yoktur. Bu yukarıda sözü edilen tekniklerin aksine, akciğer içinde tek tek hücre tiplerinde konumu hali hazırda ticari olarak temin edilebilir, flüoresan etiketli antikorlar ile boyanması, hassas-kesim Akciğer dilimleri (PCLS) üretilmesi ve konfokal mikroskopi ile bölümleri görselleştirme ile görselleştirilebilir. PCLS canlı her ikisi için kullanılan ve akciğer dokusunun sabit ve dilimler bütün bir lob kesiti kadar büyük alanları kapsayabilir edilebilir. Başarıyla dendritik hücrelerin farklı tipleri, makrofajlar, nötrofiller, T hücreleri ve B hücreleri gibi, örneğin lenfatik endotelyal gibi yapısal hücreleri dahil olmak üzere akciğerde hücre tipleri, çeşitli konumunu görselleştirmek için bu protokolü kullanılır, ve adres epitel hücreleri. Hücreler akciğer içinde hareket etmesi ve kararlı bir halde ve enflamasyon sırasında birbirleri ile nasıl etkileşime, canlı, üç boyutlu akciğer dokusunda dendritik hücreleri ve T hücreleri arasındaki gibi hücresel etkileşimler, görselleştirmek için yeteneği, ortaya çıkarabilir. gibi akış sitometrisi ve kantitatif PCR gibi başka prosedürler ile bir arada kullanıldığında Böylece, PCLS akciğerin allerjik ve enflamatuar hastalıkların altında yatan hücresel etkinlikleri kapsamlı bir anlayış katkıda bulunabilir.

C57BL / 6 farelerinden alınan iki DC alt-konumunu, CD11b hi CDCS ve CD103 + CDCS, PCLS belirlemek için kesilmiş ve CD11c özgü monoklonal antikor (mAb) ile boyanmıştır, CD88, CD103, CD324 ve (E-kadherin). CD324 leke hava yolu epitelial hücreler ile antikorlar ve CD88 makrofajlar ve nötrofiller, ancak CDCS 8 gösterilir. Bu, CD11c + makrofajlardan CDCS ayırt etmek ve hava yolları (Şekil 1), her hücre türü uzaysal iliş...

Bu hassas kesim Akciğer dilimleri (PCLS) üretilmesi ve akciğerde çeşitli immün hücre tipleri lokalizasyonunu görselleştirmek için bunları immünolojik boyama için bir yöntem tarif eder. Bizim protokol, çeşitli koşullar altında konum ve birçok farklı hücre tiplerinin fonksiyonunu görselleştirmek için uzatılabilir.

Hassas kesimli Canlı Pulmoner Dendritik Hücreler Visualize&#39;a Fare Akciğer Dilimleri

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

Bu yöntemin genel amacı, akciğerdeki çeşitli bağışıklık hücresi tiplerinin lokalizasyonunu ve trafiğini görselleştirmek için hassas kesimli akciğer dilimleri (PCLS) kullanmaktır. Bu yöntem, akciğerdeki bağışıklık hücrelerinin lokalizasyon ve göç paternleri gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, akciğerin üç boyutlu mimarisini koruyan canlı ex vivo doku içinde birçok etkileşimin görselleştirilebilmesidir.Bu yöntem, inflamasyon sırasında bağışıklık hücrelerinin lokalizasyonu ve taşınması hakkında bilgi sağlayabilmesinin yanı sıra, havayolu ve düz kas dokusu kontraksiyonunu görselleştirmek için de kullanılabilir. Akciğer dokusunu toplamak için önce, altı ila 12 haftalık bir farenin karnının ortasından çenesine kadar deri ve peritonu açmak için makas kullanın ve bağırsakları karın boşluğunun yan tarafına çekin. Kanın akciğerlerden uzaklaşmasını sağlamak için vena cava inferior'u kesin ve göğüs kafesinin genişlemesine izin vermek için makasın sivri ucuyla diyaframa delik açın.Ardından, tükürük bezlerini ve diğer dokuları trakeadan manuel olarak uzaklaştırmak için pens kullanın ve trakeanın ön tarafındaki en kalın kıkırdak bandı üzerine, 20 gauge bir iğnenin girebileceği kadar küçük bir insizyon yapmak için ince pens kullanın. Şimdi, 1,5 inçlik 20 gauge bir iğneyi bir polietilen tüp bölümüne geçirin ve tüpü yaklaşık 45 derecelik bir açıyla kesin. İğneyi bir mililitrelik bir şırıngaya takın ve şırıngaya 40 °C'de %2 düşük erime noktalı agarozdan 0,8 mL çekin.Tüm agaroz yüklendiğinde, tüpün eğimli ucunu insizyona yerleştirin ve agarozu akciğerlere yavaşça enjekte edin. İğneyi veya şırıngayı hareket ettirmeden, iğneyi trake içerisinde sabitlemek için şırıngayı polistiren tabana bantlayın ve hayvanı en az 10 dakika boyunca 4 °C'lik saklama koşullarına yerleştirin. Agaroz katılaştıktan sonra, makas kullanarak akciğerleri dikkatlice çıkarın ve buz soğukluğundaki PBS içeren üç santimetrelik bir kaba yerleştirin.Ardından, akciğerin trakeaya bağlanan iç kısmının aşağı bakacak şekilde doku dilimleme için lobu çevirin. Akciğer dokusunu dilimlemek için, öncelikle metal bir şırınga pistonuna küçük bir damla All Purpose No Run gel superglue sürün ve yapıştırıcıyı dairesel hareketlerle yayın. Tüm yapıştırıcı uygulandığında, pens kullanarak çıkarılan lobu trakea tarafı aşağı bakacak şekilde hemen ancak nazikçe kavrayın ve fazla sıvıyı temizlemek için lobu bir peçeteye hafifçe bastırın.Kurutulmuş lobu dikkatlice pistonun üzerine yerleştirin ve pistonun kenarının dışına taşan fazla dokuları kesin. Metal şırınganın yanları dokunun üzerine çıkacak şekilde pistonu aşağı indirin; böylece şırınga gövdesinin tabanında, akciğerin bulunduğu ve derinliği birkaç santimetreden fazla olmayan bir kuyu oluşturun. Pistonu sabit tutmak için şırınganın alt kısmını bantla çevreleyin.Ardından, 40 °C sıcaklıktaki %2 düşük erime noktalı agarozu, lobun üst kısmını tam olarak örtecek şekilde dikkatlice şırıngaya boşaltın ve metal şırıngayı buz gibi soğuk bir soğutma bloğu ile çevreleyin. Bir ila iki dakika sonra, numune şırıngasını otomatik dilimleyiciye yerleştirin ve yeni bıçağı hizalayın. Sonrasında, tampon tankını buz gibi soğuk PBS ile doldurun.Step motor sürücüsünü numune şırıngasıyla hizalayın ve bandı çıkarın. Step motor sürücüsü pistonun arkasına hafifçe değene kadar şalteri hızlı ileri konumuna getirin. Dilimleyici üzerindeki doku kalınlığı, sürekli tek dilim, osilasyon ve hız ayarlarını yapın.Ardından başlat düğmesine basın ve her bir PCLS tampon tankına düştükçe ince bir spatula kullanarak toplayıp, dilimleri buz gibi PBS içeren 24 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirin. Statik PCLS görüntüleme için, ilgilenilen anatomik bölgeyi içeren akciğer örneklerini, ilgili antikor kokteylinin 1 mL'sini içeren ayrı 3 cm'lik kaplara aktarın. Buz üzerinde, sallama işlemiyle ve ışıktan korunarak 30 ila 60 dakika beklettikten sonra, dilimleri 1 mL buz gibi PBS ile iki kez yıkayın.Ardından, örnek başına üç santimetrelik yeni, yuvarlak tabanlı cam bir kaba 50 µL PBS ekleyin ve dilimleri hızla her bir damlaya aktararak doku parçalarının düz bir şekilde yayılmasını sağlayacak şekilde nazikçe yönlendirin. Daha sonra PBS'yi bir pipetle aspire edin, lam üzerine oda sıcaklığındaki montaj medyumundan bir damla damlatın ve ardından bir lameli yerleştirin. Dokuyu görüntülemek için kabı konfokal mikroskop tablasına 20x objektif altına yerleştirin ve karo tarama (tile scan) süresini azaltmak için konveks gövde (convex hull) ayarında dokunun kenarlarını belirlemek ve işaretlemek için karo aracını kullanın.Ardından, özellikle kenarlar boyunca olmak üzere kesitin birden fazla alanında belirlenen aralıkların uygun olduğundan emin olarak z-stack aralığını ayarlayın. Canlı hücre görüntüleme için, ilgili antikor kokteylinde 30 dakikalık inkübasyonun ardından kesitleri iki kez bir mililitre soğuk Leibovitz 10 ile durulayın. Daha sonra, örnek başına hazneli bir lamın bir yuvasına 50 mikrolitre taze Leibovitz 10 ekleyin ve ardından her bir PCLS'yi derhal medyuma aktararak dokular düzleşene kadar nazikçe manipüle edin.Ardından, bir pipet kullanarak her bir bölmedeki besiyerini aspire edin ve her bir PCLS'yi platin bir ağırlıkla sabitleyin. Taze hazırlanmış, buz gibi soğuk hücre dışı matriksi, jel akciğer dilimlerinin üzerine yerleştirilmesine ve dilimlerin jelin üzerinde yüzmemesine dikkat ederek her bir PCLS'nin üzerine dikkatlice pipetleyin. 37 derece Celsius'ta beş dakika bekledikten sonra, lamı 20x objektif altında 37 derece Celsius'ya ayarlanmış, önceden ısıtılmış bir konfokal mikroskop bölmesine aktarın.Ardından, kareler arasındaki istenen aralığa göre z-yığını (z-stack) ve karo (tile) aralıklarını belirleyin; dokudaki ilgi alanını belirtmek için karo aracını ve örneği görüş alanına ortalamak için merkezlenmiş ızgara ayarını kullanın. CD11b yüksek konvansiyonel dendritik hücreler akciğer parankiminde yerleşirken, CD103 pozitif konvansiyonel dendritik hücreler öncelikle havayollarının çevresinde ve subplevral alanda bulunur. CD88 ve CD172a için eş-boyama yapılması, CD172a negatif, CD88 pozitif alveolar makrofajların; öncelikle subepitelyal alanda değil, parankimde yerleşmiş olan CD172a pozitif, CD88 pozitif interstisyel makrofajlardan ayırt edilmesini sağlar.Bilinen bir T-hücresi markörü olan CD90.2 ile lenfanjiyogenez için gerekli olan ana bir transkripsiyon faktörünün transkripsiyonel kontrolü altındaki bir transgen olan TdTomato floresan proteininin birlikte etiketlenmesi, akciğerdeki lenfatik yapıların tanımlanmasını kolaylaştırır. CD103 pozitif konvansiyonel dendritik hücreler; CD324 eksprese eden havayolu epiteli, lenfatikler ve subplevral alan dahil olmak üzere birkaç anatomik bölgede bulunur. Hücre hareketi ve hücreler arası etkileşimler, az önce gösterildiği gibi canlı hücre görüntüleme kullanılarak kaydedilebilir.Örneğin, temsilci deneyde, oral ova-LPS uygulamasından 16 saat sonra, CD103 pozitif dendritik hücrelerin, dört saatlik bir süre boyunca adaptif olarak transfer edilen ova-spesifik T hücreleriyle etkileşime girdiği net bir şekilde gözlemlenebilir. Uzmanlaşıldığında, doku hazırlama ve dilimleme teknikleri düzgün şekilde uygulandığı takdirde iki buçuk saatte tamamlanabilir. Bu prosedür gerçekleştirilirken, iyi bir agaroz akciğer şişirme işleminin sağlandığından ve ardından görüntüleme için hassas akciğer dilimlerinin mümkün olduğunca düz tutulduğundan emin olmak önemlidir.Bu prosedürün ardından, çeşitli hastalık durumlarında kalsiyum sinyallemesi ve hava yolu kasılganlığı hakkındaki ek soruları yanıtlamak için PCLS'nin asetilkolin veya metakolin ilele tedavi edilmesi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, akciğerdeki bağışıklık hücrelerinin lokalizasyonunu, trafiğini ve etkileşimlerini görselleştirmek için hassas kesitli akciğer dilimlerinin nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

precision-cut-mouse-lung-slices-to-visualize-live-pulmonary-dendritic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Belirli doku tiplerinin hücreleri Dissociating doku ajitasyon için belirli parametreler uygulanabilir kültürlenebilen hücrelerinin yüksek ses elde etmek için gereklidir. Miltenyi gentleMACS dissociator basit, pratik bir protokol ile bu görevi en iyi hale getirir. Bu yayında akciğer dokusunda bu cihazların kullanımı açıklanmıştır.

Standardize Hazırlık gentleMACS Dissociator kullanarak Fare Akciğer Doku Tek Hücre Cezalar

Biz anestezi farelerin trakea yoluyla ciğerlerine test malzemelerin cerrahi olmayan teslimat göstermektedir. Bu yöntem, bakteriyel ve viral patojenler, sitokinler, antikorlar, boncuk, kimyasallar, ya da boyalar akciğer maruz izin verir. Daha hasat ve flow sitometri akciğer ve akciğer drenaj lenf düğümleri (LDLNs) işlenmesi açıklanmaktadır.

Akış Sitometri Akciğerler ve Akciğer Boşaltma lenf düğümleri Analizi fareler cerrahi olmayan intratrakeal damlatma

Fare akciğer dendritik hücreler yüksek oranda saflaştırılmış açıklanmıştır. Özgül ağırlık, geleneksel dendritik hücre alt izolasyon verilir.

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Bu çalışmada bildirilen yeni protokol kombine farelerde tek hücreli çözünürlükte metastaz seçici algılama...

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme<em&gt; In-situ</emAkciğer Doku ve X-Gal Boyanma&gt; Perfüzyon<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tümör Hücreleri

Bu video, akciğer adenokarsinomu hücrelerinin PD-L1 ekspresyonunu incelemek için akış sitometrik analizi için fare akciğer hücresi süspansiyonunun hazırlanmasını açıklar.

Flow Sitometrisi için Fare Akciğeri Hazırlığı: Flow Sitometrik Analiz için Akciğer Dokusundan Hücre Süspansiyonu Oluşturma

Burada sunulan PCLS murine akciğer dokusunun damar kontrititesini korumak için bir protokoldür, bu da pulmoner vaskülat ve hava yolunun sofistike bir üç boyutlu görüntüsü ile sonuçlanır, bu da çok sayıda prosedüre duyarlı 10 güne kadar korunabilir.

Ex vivo Pulmoner Damar Yapısı ve Kontritite Çalışmaları İçin Verimli Bir Araç Olarak Hassas Kesim Akciğer Dilimleri

Bu çalışmada, murin solunum sisteminin immün popülasyonlarını izole etmek için etkili ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, 9 renk tabanlı bir akış sitometri paneli kullanarak, sağlıklı farelerin akciğerlerinde bulunan tüm doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücrelerinin tanımlanması için bir yöntem sunuyoruz.

Murin Akciğerinin Doğuştan Gelen ve Adaptif İmmün Hücrelerinin Tanımlanması için Akım Sitometrik Analizi

Mevcut protokol, neredeyse in vivo bir ortamda hava yolunu ve intrapulmoner arteriyel düz kas kontraktilitesini değerlendirmek için fare hassasiyetiyle kesilmiş akciğer dilimlerinin hazırlanmasını ve kullanılmasını açıklamaktadır.

Hava yolu ve intrapulmoner arteriyel düz kasın kasılma regülasyonunu incelemek için hassas kesilmiş akciğer diliminin kullanılması

Burada, İzolektin B4'ün tek boyamasını kullanarak tüm farelerin akciğer dokusu için pulmoner mikrovasküler yoğunluğun tarafsız bir şekilde ölçülmesini sağlamak için basit ve ekonomik bir protokol açıklıyoruz.

Lobüller Boyunca Farelerde Pulmoner Mikrovasküler Yoğunluğun Ölçülmesi

Floresan mikroskobu ile analiz için akciğer hava yollarındaki mantar sporlarının doğal yerleşimini koruyan bir mantar patogenez modeli için bir yöntem sunuyoruz.

Hava Yollarındaki Mantar Sporlarının Mekansal Dinamiklerini Koruyan Murin Akciğerlerini Görüntülemek için Etkili Yöntem

Öğrenin hassas kesimli akciğer dilimleri yöntemiyle fare akciğerlerinde bağışıklık hücrelerinin lokalizasyonunu ve göçünü canlı görüntüleme tekniğini. Bu yöntem solunum hastalıkları ve inflamasyon araştırmalarında değerli bilgiler sunar.

Hassas kesimli Canlı Pulmoner Dendritik Hücreler Visualize'a Fare Akciğer Dilimleri

Daha fazla video keşfet