Name: pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Keşfedin membran protein trafiğini ve hücre içi dağılımını pHluorin etiketleme ve TIRFM kullanarak canlı hücrelerde gerçek zamanlı izleme. Bu yöntem genetik mutasyonların ve farmakolojik ajanların protein davranışı üzerindeki etkilerini değerlendirmeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma kısmen Ulusal Uyuşturucu Bağımlılığı Enstitüsü T32 DA 016176, Ulusal Uyuşturucu Bağımlılığı Enstitüsü DA 038817 ve Ulusal Uyuşturucu Bağımlılığı Enstitüsü DA 040047 tarafından desteklenmiştir.

1. Hücre Kültürü ve transfeksiyonu <ol><li> Büyüme ortamı fare nöroblastom 2a (N2a) hücreleri korumak. <ol><li> Yüksek glikoz 200 mi Dulbecco&#39;nun Eagle ortamında (DMEM) 500 mi N2a büyüme ortamı yapmak, 250 mi, serum ortamı, 50 ml cenin sığır serumu (FBS), düşük ve 5 ml penisilin / streptomisin (100 X). </li><li> % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de bir T75 şişesi içinde hücreleri korumak. </li><li> Bölünmüş hücreler 01:15 gerektiğinde, ya da yaklaşık% 80-90 confluency. Bu genellikle haftada 2-3 kez olduğunu. </li></ol></li><li> Coat 35 mm cam poli-D-lizin ile alt çanak. <ol><li> Laminer akış biyo-güvenlik kabini, steril 35 mm çanak cam alt bölgesi üzerine 0.1 ug / ml poli-D-lisin 200 ul ekle. </li><li> 1 saat boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde çanak yerleştirin. </li><li> Dikkatle GKD 2 O 3-4 kez yemek durulayın. </li><li> Birden fazla 1 saat boyunca yemekler tamamen kurumasını bekleyin. </li><li> SterilGerekirse biyogüvenlik kabini UV ışık kullanarak yemekleri ize. </li></ol></li><li> TIRFM görüntüleme için N2a hücreler plaka. <ol><li> yapışık hücrelere büyüme ortamı çıkarın. </li><li> % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 1 ml 1 x tripsin (+ EDTA) ile inkübe edilerek şişe bundan sonrakinden hücrelerin ayrılmaları. </li><li> 9 ml büyüme ortamı ekleyerek tripsin inaktive. Bir pipet kullanarak medya, tripsin ve müstakil hücreleri karıştırın. </li><li> Görme hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısı ve her bir poli-D-lizin kaplı cam alt çanak 90.000 hücre eklemek için doğru hacmi hesaplamak. Bu yoğunluk etkin transfeksiyon ve tek bir hücre TIRF görüntüleme için gereklidir. </li><li> 90.000 hücreleri içeren her cam alt çanak 2 ml büyüme ortamı ekleyin. </li><li> 16-24 saat süreyle% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe edin çanak. </li></ol></li><li> N2A transfeksiyon <ol><li> dahil bir Eylül fluorofor içeren bir plazmid yapı eldeilgili proteinin hücre-dışı bölümü içine. Bu PCR amplifikasyonu 5 gibi standart klonlama teknikleri yapı oluşturmak için de kullanılabilir. NOT: endoplazmik retikulum veya trafik veziküllerin lümeni içinde bulunduğu ve plazma membranı üzerinde hücre dışı çözeltisine maruz kaldığı Eylül membran proteini hücre dışı bölgesinin dahil edilmesi gerekir. GFP ve benzeri klonlama stratejileri kullanılabilir SEP boyutu benzer. </li><li> 1.5 mi düşük serum ortamında kaplama hücreleri üzerinde büyüme ortamı yerine (örneğin, Opti-MEM), yaklaşık 30 dakika transfeksiyon reaktifi ilave edilmeden önce. NOT: reseptörleri ilacın yol açtığı değişiklikleri incelemek için, ilacın, uygun bir konsantrasyonu, transfeksiyon zamanı eklenebilir. </li><li> 250 ul düşük serum ortamı oluşturmak her istenilen plazmid 500 ng ekleyin (tüp 1). </li><li> Ayrı bir tüp c transfeksiyon reaktifi 2 ul ekleindirgenmiş serum ortamı içeren gruptur 250 ul. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında boru 2 inkübe edin. DNA plazmid transfeksiyon reaktifi oranı her bir ilgi proteini ifade etmek üzere optimize edilmelidir. </li><li> transfeksiyon reaktifi ve plasmid karışımı, 500 ul içeren bir solüsyonun hazırlanması için tüpler 1 ve 2 bir araya getirin. 25 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> tabak başına 2 ml&#39;lik toplam hacmi 500 ul transfeksiyon karışımı önceden kaplama hücreleri ekleyin. </li><li> 24 saat boyunca bir% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> 24 saat sonra, transfeksiyon karışımı çıkarın ve büyüme ortamı ile hücrelerin yıkayın ve daha sonra her bir tabak için büyüme ortamının 2 ml ekleyin. NOT: Bir ilaç transfeksiyon zamanı ilave edildi, bu, bu aşamada daha doldurulan olabilir. </li><li> 24 saat boyunca bir% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> Görüntü hücreleri transfeksiyondan 48 saat sonra. </li></ol></li></ol> Toplam In tarafından 2. Canlı Hücre Görüntülememodu, harici Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM) <ol><li> Görüntüleme kurmak <ol><li> Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi bir tarama aşaması ile ters flüoresan mikroskop kurulumu ile görüntüleme gerçekleştirin. Bu 488 nm DPSS lazer kaynağının hizalanmasını gerektirir bir kademeli motor 488 nm ışın pozisyonu ve yüksek sayısal aralığı (1.49 NA) 60X ya 100X yağ daldırma objektif ayarlayın. </li><li> Uygun uyarma filtresi (bant geçiş 488/10 nm) aracılığıyla lazer ışını geçirin. Bir step motora monte edilmiş bir başlatıcısı bağlı bir tek modlu fiber üzerinden polarize lazer ışını aynı hizaya getirin. Epifloresans modunda, uyarma ışın hedefi arka diyafram ortasında merkezli. </li><li> kritik açı ulaşıldığında ve kiriş artık numune boyunca iletilir ve yerine tamamen cam cel yansıyan kadar TIRF elde etmek için, objektif lens arka diyafram boyunca odaklanmış bir lazer ışını çevirmek için step motor kullanmakl arayüzü. </li><li> Uygun emisyon filtresi ile görüntüleme yazılımı (örneğin Metamorph) ile kontrol edilen bir EMCCD (512 x 512 piksel) kullanarak Yakalama görüntüleri emisyon yolunda monte (525/50 nm). </li></ol></li><li> Görüntüleme çözüm hazırlayın <ol><li> GKD 150 mM NaCI, 4 mM KCI, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM HEPES ve 10 mM glükoz karıştırılarak 200 mi hücre dışı çözelti (EİS) hazırlanması 2 O stok çözeltileri NaCI, KCI, MgCI2, ve CaCl2 önceden hazırlanmış ve görüntüleme gününde taze HEPES ve glikoz ile kombine edilebilir. </li><li> pH 7,4-100 mi ECS ihtiva eden bir çözeltinin pH&#39;ının ayarlanması. 5.4 arasında bir pH değerine ECS kalan 100 ml ayarlayın. ECS 2 ml (pH 7.4) ile transfekte hücrelerin durulayın. </li><li> görüntüleme önce transfekte hücrelere ECS 2 ml (pH 7.4) eklenir. </li></ol></li><li> TIRF Canlı hücre görüntüleme <ol><li> includin tüm sistemi açıng 488 nm lazer, kamera, çeviri sahne ve görüntüleme programı. Epifloresans ışını Odak ve 60X objektif yaklaşık 1 mW güç ayarlayın. </li><li> amaç yağ ekleyin ve çeviri sahnede transfekte hücrelerin bir tabak koyun. Hücreler birden çok kez görüntülenmiş olabilir bu yüzden sahneye göre hareket etmiyor sağlamak için sahne bağlar kullanarak yerine çanak sabitleyin. </li><li> Epifloresans modunda, mikroskop odak ve floresan, transfekte hücreler bulun. Hücreler çeşitli odak düzlemleri boyunca odaklanmaya devam edecektir. TIRF ile devam etmek tek izole hücreler bulun. </li><li> görüntüleme programı, 200 milisaniye maruz kalma zamanını ayarlamak ve EM kazanç ayarlayarak floresan yoğunluğu optimize. </li><li> step motor kullanılarak kademeli bir şekilde objektif karşısında ışını çevirerek TIRF içine lazer ışınını Geçiş. o th yakınsar kadar kritik açı yaklaşırken, kiriş gözle görülür yemeğin kenarı boyunca tercüme edecektirÖrnek uçakta toplam iç yansıma e noktası. </li><li> Hücreler odak düğmesini ayarlayarak TIRF modunda olduğundan emin olun. TIRF, hücrelerin sadece bir düzlemde, plazma membranının yüksek çözünürlüğe sahip bir çok tanımlanmış bir görüntü üreten (cam arayüzünden, yani yaklaşık olarak 150 nm) odaklanabilir. </li></ol></li><li> Hücre içi lokalizasyonu belirlemek için görüntüleme Eylül <ol><li> Görüntüleme düzlemde sağlıklı, transfekte tek hücreleri bulun. </li><li> pH 7.4 hücrenin odaklanmış bir görüntü kazanır. Eylül görünür olmalıdır plazma zarı ve endoplazmik retikulum üzerinde reseptörleri etiketli. </li><li> Hızlı photobleaching önlemek için örnek ulaşmasını lazer ışınını bloke eder. </li><li> Birden fazla xy yeri kayıt yeteneğine mikroskop görüntüleme yazılımı kullanarak her hücreye karşılık gelen sahne pozisyonları ezberleyin. </li><li> yazılımı kullanırken çanak başına 20-30 hücreleri için adımları tekrarlayın 2.4.1-2.4.4 her hücrenin konumunu kaydetmek için. </li><li> AfpH 7.4&#39;te tüm hücre görüntüleri toplanan ter, elle pipet kullanarak pH 7.4 ECS çözüm kaldırmak. Bu ezberlemiş sahne pozisyonları hareket olabilir gibi çanak dokunmayın. </li><li> Dikkatle çanak pH 5.4 ECS 2 ml ekleyin ve 10 dakika bekleyin. Bu süre zarfında, önceden edinilmiş görüntüleri kaydetmek. </li><li> PH 7.4 görüntüleri toplamak kaydedilen her pozisyona sahne taşımak ve pH 5.4 de aynı hücrede bir görüntü elde etmek için kullanılan koşullar aynı set altında. algılanan tüm floresan reseptörleri etiketli Eylül sınırlı endoplazmik retikulum kaynaklı beri Hücreler daha az tanımlanmış bakmak gerekir. pH 5.4 hücre görüntüleri kaydedin. </li></ol></li><li> Canlı hücrelerde Görüntüleme tek vezikül ekleme olaylar <ol><li> 2 mi, pH 7.4 ECS ile transfekte edilmiş hücrelerin büyüme ortamı yerine veya Leibovitz L-15 ortamı ile. Leibovitz L-15 ortam maddesinin pH değeri, gerekirse görüntüleme uzun bir süre boyunca meydana sağlayan CO2 bağımsızdır. </li><li> Placmikroskop sahnede transfekte hücrelerin çanak e. Güvenli ve yukarıdaki Adım 2.3 aşağıdaki TIRF tek bir hücreyi odaklanır. </li><li> Varsa odak görüntüleme süresi boyunca kayması değil böylece, otofokus ayarlayın. </li><li> Sürekli 200 msn bir kare hızında fotoğraf çekimi, 1.000 kare bir dizi kaydedin. floresan patlamaları dışı pH 7.4 SEP açığa plazma zarı ile kaynaştırarak düşük pH kaçakçılığı veziküller karşılık, bu süre içinde görünür olacaktır. </li><li> başka bir tek hücreyi bulup yukarıdaki adımı tekrarlayın. Gerekirse otofokus sıfırlayın. </li></ol></li></ol> 3. Görüntü Analizi ve Veri İşleme <ol><li> Eylül floresan analiz hücre içi lokalizasyonu belirlemek için <ol><li> Bu Metamorph ya ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) gibi bir görüntü analizi yazılımı kullanılarak hücre görüntüleri açın. yuvarlanan top ayarını kullanarak hem pH 5.4 ve pH 7.4 görüntüleri arka plan çıkarın.</li><li> tek bir hücreden floresan ölçmek için bir yoğunluk threshold kullanın. El ile pH 7.4 görüntüdeki hücrenin çevresinde ilgi bir bölge seçin. </li><li> , Hücre alanını ölçün yoğunluğu ortalama ve entegre yoğunluk ImageJ bir eklenti kullanarak veya Analiz sekmesi altında &quot;Tedbir&quot; fonksiyonu yerleşik kullanarak. </li><li> dikkatle aynı şekilde ilgi yoğunluğu tabanlı eşiği ve bölgeyi ayarlama, pH 5.4 aynı hücre için adımlar 3.1.1-3.1.3 tekrarlayın. </li><li> Entegre yoğunluğu hem pH 7.4 ve 5.4 hücre görüntüler için elde edildikten sonra, pH 7.4 değeri, pH 5.4 değeri çıkarılarak plazma zarı entegre yoğunluğunu hesaplar. Fark TIRF uyarma bölgede plazma zarı üzerinde göreli sayı reseptörlerine karşılık gelir. </li><li> İnsan ticareti bir tedbir olarak, SEP göreceli yüzdesi TIRF excitati görünür kalan reseptörlerine kıyasla plazma zarı üzerinde bulunan reseptörler etiketli hesaplamak100 ile çarpılarak pH 7.4&#39;de toplam entegre yoğunluğu ile yoğunluğu entegre plazma zarı, bölerek birimde. </li></ol></li><li> Tek vezikül ekleme olayları analiz <ol><li> görüntü analiz yazılımı kullanılarak 1.000 tiff görüntü serisi açın. yuvarlanan top ayarını kullanarak tüm kareleri arka planı çıkarma. </li><li> Ekleme olayları mesaneye gelen yoğun bölgeleri maksimize etmek kaydın renk dengesini ayarlar. El ile daha uzun 3 kare (&gt; 600 msn) süren floresan patlamaları saymak. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lester, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+is+a+selective+pharmacological+chaperone+of+acetylcholine+receptor+number+and+stoichiometry.+Implications+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery.</a> AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).</li>
<li>Henderson, B. J., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside-out+neuropharmacology+of+nicotinic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs.</a> Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).</li>
<li>Banerjee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+protein+in+the+temporal+cortex+in+Alzheimer%27s+and+Parkinson%27s+disease--a+stereological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach.</a> Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).</li>
<li>Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+%CE%B17+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+%CE%B2-amyloid+levels+in+early+alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cortical α7 nicotinic acetylcholine receptor and β-amyloid levels in early alzheimer disease.</a> Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).</li>
<li>Richards, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+%CE%B14%2A+Nicotinic+Receptors+Revealed+by+Superecliptic+Phluorin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).</li>
<li>Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+acts+as+a+pharmacological+chaperone+to+up-regulate+human+a4b2+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors.</a> Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).</li>
<li>Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nicotine+metabolite%2C+cotinine%2C+alters+the+assembly+and+trafficking+of+a+subset+of+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).</li>
<li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+exploits+a+COPI-mediated+process+for+chaperone-mediated+up-regulation+of+its+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors.</a> J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).</li>
<li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menthol+Alone+Upregulates+Midbrain+nAChRs%2C+Alters+nAChR+Subtype+Stoichiometry%2C+Alters+Dopamine+Neuron+Firing+Frequency%2C+and+Prevents+Nicotine+Reward%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward.</a> J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).</li>
<li>Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+trafficking+of+CFTR+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cyst.+Fibros%22%5BJournal%5D)">Endocytic trafficking of CFTR in health and disease.</a> J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).</li>
<li>Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8764371">Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels.</a> J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).</li>
<li>Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine-induced+upregulation+of+native+neuronal+nicotinic+receptors+is+caused+by+multiple+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms.</a> J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).</li>
<li>Mazzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine-modulated+subunit+stoichiometry+affects+stability+and+trafficking+of+alpha3beta4+nicotinic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor.</a> J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).</li>
<li>Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B14%CE%B22+nicotinic+receptors+with+high+and+low+acetylcholine+sensitivity%3A+pharmacology%2C+stoichiometry%2C+and+sensitivity+to+long-term+exposure+to+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">α4β2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine.</a> Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/book/10.1007/978-1-4939-3768-4">Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies</a>. Ming, L. 117, Humana Press. (2016).</li>
<li>Khiroug, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+membrane-inserted+fraction+of+pHluorin-tagged+channels+using+repetitive+acidification+technique%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique.</a> BMC Neurosci. 10 (141), (2009).</li>
<li>Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+insertion+of+the+AMPA+receptor+GluA2+subunit+is+regulated+by+NSF+binding+and+Q%2FR+editing+of+the+ion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).</li>
<li>Yudowski, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+discrete+exocytic+events+mediating+surface+delivery+of+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors.</a> J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X08006079">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).</li>
<li>Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pH+of+the+secretory+pathway%3A+measurement%2C+determinants%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation.</a> Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

SEP pH duyarlılığı, plazma zarı üzerinde bulunan reseptörler endoplazmik retikulum hücre içi reseptörler ayırt edilmesini sağlar ve sokma olayları çözmek için kullanılabilen reseptör taşıyan veziküller 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . Yüzey biyotinilasyon ve ligand dahil olmak üzere çeşitli teknikl...

Reseptör ifadesi, dağıtım, ve montaj değişiklikler Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, kistik fibroz, ve madde bağımlılığı, 1, 2, 3, 4, 5 dahil olmak üzere hastalıkların geniş bir yelpazede bağlı olmuştur. Örneğin, nikotin ve nikotinik ligandlar kaçakçılığı, ifadesi ve yukarı doğru düzenleme, 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 değişikliklere yol nikotinik asetilkolin reseptörleri (nAChR&#39;ler) kaçakçılığı etkilemektedir. Nikotin, bir hücre içinde bir araya nAChR&#39;lerin sayısı artar, plazma zarının kaçakçılığı artırand bazı alt tiplerinin yüksek hassasiyet sürümünü lehine alt birimlerinin montajını değiştirir. bir hastalık modelinde kaçakçılığı, montaj ve reseptörlerin ifadesinde belirgin değişiklikler çözümleniyor ilaç hedefleri tanımlamak için gerekli olan çok önemli mekanistik ayrıntıları sağlar. Ideal bir yaklaşım hızla hücre içi reseptörler ve plazma membran üzerinde lokalize olanlar arasında ayrım olur. Bu, belirli bir proteinin bir çoğunluğu bu nAChR&#39;lerle gibi, hücre bulunduğu durumlarda, özellikle zordur. nAChR&#39;lerin çoğunluğu endoplazmik retikulum lokalize olduğundan, geleneksel ölçümler salgı yolu boyunca lokalizasyonu ve kaçakçılık değişikliklerini saptamak için gerekli uzay-zamansal çözünürlüğe yoksundur. NAChR&#39;lerin Reseptör kaçakçılığı ve anlatım çalışmaları öncelikle 11 Radyogland bağ, biyotinilasyon deneyleri 12, batı lekeleme 13 veya immünopresipitasyon techniq kullanılarak yapılmıştır<html> ues 12. Bu hücreler, bir raportör molekülü veya tespitin bağlama spesifikliği bağlıdır ve aynı zamanda plazma zarı yerleşik ve hücre içi reseptörler ayırt kabiliyetinden yoksundur. Bu nedenle, iyon kanal montaj ve vezikül dinamikleri çalışmalar büyük ölçüde düşük verimlilik elektrofizyolojik teknikler 14 yararlanmıştır. Üstün mekansal ve zamansal çözünürlükte floresan mikroskobu gelişmeler ile mümkündür. , Yeşil flüoresan protein (GFP) ve türevleri gibi genetik olarak kodlanmış raportör moleküller, spesifik olmayan bağlama sorunları ortadan kaldırmak ve hassasiyeti 15 artar. Superecliptic pHluorin (SEP) olarak bilinen GFP bir pH duyarlı varyantı, yeri 5, 7, 8 belirlemek için, hücre içinde bölmeler arasında doğal pH farklılıkları yararlanmak için kullanılabilecekref &quot;&gt; 9, 16, 17, 18. Eylül pH 6 daha yüksek olduğunda fluoresces, ancak daha düşük pH değerlerinde bir kapalı durumda kalır. Bu nedenle, lümen tarafında SEP ile etiketlenmiş reseptörleri endoplazmik retikulumda mevcut olduğunda tespit edilir ( bir trafik kesecik sınırlı ER) veya plazma zarı (PM) içine sokulması üzerine, ancak., plazma zarı üzerinde reseptörleri ile temas ekstrasellüler pH manipülasyonu sonuç olarak floresans ve bu reseptörlerin nedenle algılama değiştirir. aynı hücre halinde ardışık olarak nötr ekstrasellüler pH ile 6 daha düşük daha sonra bir pH hem de görüntülenmiş olan, görüntü arasındaki fark, plazma membranı üzerinde bulunan reseptörlere bağlanabilir. Bu, aynı anda hücre içi ölçümünü (periferik ER) ve plazma membran yerleşik reseptörleri 5 karşılaştırın 7, 8 </sup&gt; 9. hücre dışı pH nötr olduğunda tek vezikül ekleme olaylar da çözülebilir. Düşük pH trafik vezikül plazma membranı ile kaynaştıran sonra, vesikül luminal tarafında floresan 7, 18, 19, 20 bir patlama olarak algılanabilir bir geçiş neden nötr hücre dışı çözeltiye maruz bırakılır. Eylül plazma membranı ve periferik endoplazmik retikulum lokalize reseptörlerin ölçüm sağlar ve bu hücre içi bölgelerde 5, 7, 18 arasında reseptörlerinin kaçakçılığı ölçmek için bir araç sağlar. plazma membranında yüksek çözünürlük elde etmek için, genetik olarak kodlanmış SEP ile reseptör toplam iç yansıma florasan mikroskobu (TIRFM) tarafından görüntülü. Bu yöntem, özellikle biryararlı reseptörlerin çoğunluğu TIRFM plazma zarı görünürlüğünü arttırır, çünkü hücre içi bölgelere lokalize ise. TIRFM da PM içine sokulması üzerine Eylül-etiketli reseptörleri taşıyan tek veziküllerin kaçakçılığı dinamiklerinin çözünürlüğü sağlar. Toplam iç yansıma bir hücre ve bir cam kapak-slip 21, 22 arasında olduğu gibi, farklı kırılma indislerine sahip malzeme ara yüzeyinde meydana gelir. Cam ve hücre çözümü arayüzünde toplam iç yansıma elde aydınlatmaktadır 488 nm uyarma, ışınlanmış zaman Eylül fluoresces. Bu örnek, bu hacmin içinde sadece heyecanlı fluorophores içine yaklaşık 150 nm nüfuz bir evanescent dalga üretir. ikaz bu aralık içinde nötr pH ortamında reseptörleri içeren sadece Eylül plazma membranı veya periferik endoplazmik retikulum üzerinde bulunan kişilerce karşılık gelen tespit edilir. algılama sınırlı t olduğundanhücre içi bölge kaybolan dalga eşiğe göre O uyarım azalır ve sinyal gürültü oranı, 22 21 arttırılır. Buna ek olarak, hücre toplu nüfuz etmez ışıma, fotohasar zaman içinde canlı hücre görüntüleme sağlayan en aza indirilir. Bunun bir sonucu olarak, TIRFM Eylül salgı yolu boyunca membran reseptörlerinin hücre içi lokalizasyonu ve trafik dinamikleri ölçmek için gerekli olan yüksek çözünürlük ve hassasiyet sağlayan genetik olarak kodlanmış ile birlikte.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Reaktif/Malzeme</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre Kapaklı Hücre Kültürü Şişeleri, Steril, Greiner Bio One, 75 cm2</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td></td></tr><tr><td>35 mm cam tabanlı Petri kapları, steril</td><td>Cell E& G</td><td>GBD00002-200</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizin</td><td>vwr</td><td>215017510</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modifiye Eagle Medium&lrm; (DMEM), Yüksek Glikoz</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-965-084&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Azaltılmış Serum Besiyeri</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>31-985-088</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, Sertifikalı, ABD Menşeli, Standart (Steril Filtreli)&nbsp;</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>16-000-044</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzim (1x), fenol kırmızısı yok</td><td>Fisher Scientific</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Çözeltisi</td><td>VWR</td><td>45000-652</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz'in L-15 Orta, fenol kırmızısı yok</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td>İsteğe Bağlı</td></tr><tr><td>Lipofiktamin</td><td>Fisher Scientific 11668030</td><td></td><td>Yavaşça karıştırın; Sodyum klorürü girdap yapmayın</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-10</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Objektif daldırma yağı&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>Tipi F</td><td></td></tr><tr><td>İsim</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Fotoğraf Makinesi</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>60X, 1.49 NA yağa daldırma objektifi</td><td>Olympus</td><td>APON 60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>Motorlu sahne</td><td>Önceki</td><td>IXPROXY</td><td></td></tr><tr><td>Motorlu aktüatör (step motor)</td><td>Thorlabs</td><td>ZST213</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph (veya başka bir görüntüleme programı)</td><td>Metamorph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm lazer</td><td>Pazar Teknolojisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek modlu fiber</td><td>Thorlabs</td><td>SM450</td><td></td></tr><tr><td>Aynalar</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E01</td><td></td></tr><tr><td>Dikroik 488 nm LP</td><td>Semrock</td><td>Di02-R488-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Bant geçiren filtre, 488 nm</td><td>Semrock</td><td>LL01-488-12.5</td><td></td></tr><tr><td>Bant geçiren filtre, 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr></tbody></table>

phluorin etiketli reseptör kullanarak subselüler yerelleşme ve ticareti monitör

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Anlamak membran proteini kaçakçılığı, montaj ve ifade hücre içi organellerin kalanların ve plazma membran üzerinde lokalize olanlar arasında farklılık bir yaklaşım gerektirir. Geleneksel floresan bazlı ölçümler farklı organellere ikamet eden zar proteinleri ayırt yeteneği yoksundur. Kesici kenar metodolojileri toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) ile pH-duyarlı fluorophores bağlanmasıyla geleneksel yöntemlerle aşmak. TIRF aydınlatma, böylece arka plan azalan sinyal gürültü oranını artırmak ve çözünürlük arttırıcı, cam numunesi arayüzünden 150 nm&#39;ye kadar örnek uyarılmaktadır. TIRFM içinde uyarma hacmi gibi periferik ER olarak plazma zarı ve yakındaki organelleri kapsar. Superecliptic pHluorin (SEP) GFP pH&#39;ya duyarlı bir versiyonudur. Genetik olarak ilgi konusu bir membran proteini hücre dışı etki alanına SEP kodlayan fluorofor ile ilgili pozisyonlarıER ve hücre dışı bölgesinde lümen taraf. Eylül pH, 6 daha büyük olduğu zaman, floresan, ancak daha düşük pH değerlerinde kapalı durumda kalır. Bu nedenle, (PM) plazma membranında endoplazmik retikulum (ER) &#39;de ya da sokulması üzerine bulunan ancak bir trafik vezikül veya Golgi gibi diğer organellere sınırlı değilken Eylül floresan ile etiketlenmiş reseptörleri. ekstrasellüler pH, plazma zarı üzerinde reseptörlerin floresan dikte ayarlanabilir. Aynı hücre için nötr ve asidik hücre dışı pH TIRF görüntüleri arasında floresan farkı, plazma zarı üzerinde reseptör göreli sayısına karşılık gelir. Bu hücre içi ve plazma zarı ikamet reseptörlerinin bir ölçümünü sağlar. ekstrasellüler pH plazma membranı ile füzyonu bir floresan haline geçiş, düşük pH trafik vezikül tekabül eden nötr olduğunda tek vezikül yerleştirme etkinlikleri de ölçülebilir. bu versatilE tekniği membran proteinlerinin lokalizasyonu, ifade ve ticaretini incelemek için kullanılabilir.

Bir reseptör olarak Eylül dahil canlı bir hücreye reseptörün doğrudan tespit edilmesine olanak sağlar. TIRFM ile birleştiğinde, bu plazma zarı ve TIRF uyarma bölgede hücre içi yerlerinizdeki reseptörlerin dağılımı üzerindeki bağıl ifade seviyelerinin değerlendirilmesini sağlar. Tek vezikül kaçakçılığı olayları da çözülebilir. Plazma Zarında Eylül-etiketli Reseptör göreli İfade Düzeyleri <p class="jove_content" fo:keep-togethe...

pH&#39;ya duyarlı bir florofor ile bir membran proteinin hücre dışı alanını Etiketleme, superecliptic pHluorin (SEP), hücre içi lokalizasyonu, sentezleme ve trafik saptanmasına olanak sağlamaktadır. Görüntüleme toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) proteinleri Eylül-etiketli periferal ER ve plazma membranı protein seviyelerinin ölçümü sağlar.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Bu floresan görüntüleme yönteminin genel amacı, membran protein taşınımındaki ve hücre içi dağılımdaki değişiklikleri izlemektir. Bu yöntem; genetik mutasyonların veya farmakolojik ajanların vezikül iletim hızına ve hücre yüzeyindeki protein ekspresyonuna etkileri gibi protein taşınımındaki değişikliklere dair içgörü sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, ölçümlerin örneğe zarar vermeden, gerçek zamanlı olarak, yüksek çözünürlükte ve hızla gerçekleştirilebilmesidir.Görüntülemeden 48 saat önce, fare nöroblastoma 2A hücreleri, ilgi duyulan proteinin hücre dışı bölgesine yerleştirilmiş pH hassasiyetli bir florofor olan SEP içeren bir plazmit yapısıyla transfekte edilir. Transfekte edilen hücreler, toplam iç yansıma floresan veya TIRF mikroskobu ile görüntüleme için hazır olduğunda, hücrelere iki mililitre pH 7.4 hücre dışı çözelti veya ECS ekleyin. Hücrelerin bulunduğu kabı taşıma tablasına yerleştirin ve kabı sabitlemek için tabla bağlantı aparatlarını kullanın.Epifloresan modunda mikroskobu odaklayın ve floresan işaretli transfekte hücreleri bulun. Hücreler birkaç odak düzlemi boyunca odakta kalacaktır. TIRF ile devam etmek için tekil, izole hücreleri belirleyin.Görüntüleme programında

utilizing-phluorin-tagged-receptors-to-monitor-subcellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu rapor yüzey ekspresyonu, ulaşım yolları ve dışsal olarak ifade edilen, pH-duyarlı GFP-etiketli nöronların plazma membran proteinlerinin kaçakçılığı kinetik belirlemek için canlı hücre görüntüleme ve photobleach tekniklerinin kullanımı anlatılmaktadır.

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Etiketleme tarafından superecliptic pHluorin membran reseptörlerinin ekstraselüler domain ve görüntüleme kültürlü fare nöronları bu füzyon reseptörleri, biz doğrudan plazma membran reseptörlerinin bireysel veziküler ekleme olayları oluşturulabiliyor. Bu teknik, plazma membran reseptör ekleme düzenleyen moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasına vesile olacaktır.

Görüntüleme İlköğretim Kültürlü Fare Nöronlar içinde Plazma Membran Reseptör Yerleştirme pHluorin etiketli

Hücre yüzeyindeki akson kılavuz reseptörlerinin mekansal-zamansal dinamiklerini incelemek için pH'a duyarlı yeşil floresan protein varyantı pHluorin'in kullanımını burada açıklıyoruz. pHluorin etiketli reseptör hem hücre kültüründe hem de in vivoolarak ifade edilir Civciv embriyosunun elektroporasyonunu kullanarak.

Hücre Kültüründe ve Civciv Embriyosunda Akson Kılavuz Reseptörlerinin Dinamiklerini Değerlendirmek için pHluorin Kullanımı

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Burada, florometrik bir yöntem kullanarak yapışık makrofaj hücre hattı ile floresan parçacıkların fagositozunu ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, partikül içselleştirmesinin yanı sıra ortaya çıkan aktin polimerizasyonunun yüksek verimli bir miktar tayinini kolaylaştırır.

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

Bu makale, bir sinaptobrevin2-pHluorin yapısı ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanarak nöroblastom hücrelerinde nörotransmitter vezikül dinamiklerini araştırmak için bir yöntem sağlar. Görüntü işleme ve veri analizi için geliştirilen strateji de raporlanmaktadır.

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Reseptör ticareti ligandlarına sinyal ve hücre yanıt modüle ve kendisi ligand bağlı sinyal dahil olmak üzere hücre koşulları, yanıt verici olmaktadır. Burada, biz kantitatif immün ve colocalizational analizi kullanılarak ilaca bağlı reseptör ticaretini değerlendirmek için güçlü ve esnek bir teknik açıklar.

Colocalizational Analizi Reseptör Sonrası içselleştirme Ticareti Uyuşturucu kaynaklı Değişiklikleri İzleme

Veziküler kaçakçılık olaylarının doğru bir şekilde ölçülmesi, genellikle belirli proteinlerin rolleri ve mutasyonların etkileri hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu makale, kantitatif floresan mikroskobu ve akış sitometrisi kullanılarak canlı hücrelerde endositik olayların nicelleştirilmesi için bir araç olarak pH'a duyarlı bir GFP varyantı olan süperekliptik pHluorin'i kullanma yöntemlerini sunmaktadır.

Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Burada anjiotensin II tedavi tarafından başlatılan endositoz sırasında yeşil flüoresan protein etiketli anjiotensin tip 1a reseptörlerini eksprese görüntü hücrelere bir protokol mevcut. Bu teknik, zaman içinde, üç boyutlu olarak reseptör ve lizozom ko-lokalizasyonunu analiz yazılımı kullanılarak daha sonra etiket, ikinci bir fluoresan işaretleyici ile lizozomlar ve benzerini kapsamaktadır.

Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti

Burada, fotoreseptör membran proteinlerinin lokalizasyonu ve eGFP floresan kullanılarak Drosophila bileşik gözünde retinal dejenerasyonun değerlendirilmesi için non-invaziv yöntemler tanımlanmıştır.

eGFP Etiketli Proteinler Kullanarak Drosophila Fotoreseptör Hücrelerinde Membran Protein Kaçakçılığının İncelenmesi

Keşfedin membran protein trafiğini ve hücre içi dağılımını pHluorin etiketleme ve TIRFM kullanarak canlı hücrelerde gerçek zamanlı izleme. Bu yöntem genetik mutasyonların ve farmakolojik ajanların protein davranışı üzerindeki etkilerini değerlendirmeye olanak tanır.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Daha fazla video keşfet