pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Bu floresan görüntüleme yönteminin genel amacı, membran protein trafiği ve hücre içi dağılımdaki değişiklikleri izlemektir. Bu yöntem, genetik mutasyonların veya farmakolojik ajanların hücre yüzeyindeki vezikül iletim hızı ve protein ekspresyonu üzerindeki etkisi gibi protein kaçakçılığındaki değişiklikler hakkında bilgi sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, ölçümlerin numuneyi tahrip etmeden gerçek zamanlı olarak hızlı, yüksek çözünürlükte gerçekleştirilebilmesidir.

Görüntülemeden 48 saat önce, fare nöroblastomu 2A hücreleri, ilgilenilen proteinin hücre dışı bölgesine dahil edilmiş pH'a duyarlı bir florofor olan SEP içeren bir plazmit yapısı ile transfekte edilir. Kesilen hücreler görüntüleme için hazır olduğunda, toplam iç yansıma floresansı veya TIRF mikroskobu ile, hücrelere iki mililitre pH 7.4 hücre dışı çözelti veya ECS ekleyin. Çeviri aşamasına bir hücre kabı yerleştirin ve çanağı yerine sabitlemek için sahne montaj parçalarını kullanın.

Epifloresan modunda, mikroskobu odaklayın ve floresan transfekte edilmiş hücreleri bulun. Hücreler birkaç odak düzlemine odaklanmaya devam edecektir. TIRF ile devam etmek için tek, yalıtılmış hücreleri bulun.

Görüntüleme programında, pozlama süresini 200 milisaniyeye ayarlayın ve EM kazancını ayarlayarak floresan yoğunluğunu optimize edin. Işını hedef boyunca kademeli olarak çevirmek için Step motoru kullanarak lazer ışınını TIRF'ye geçirin. Kritik açı yaklaştıkça, ışın, numune düzlemi üzerindeki toplam iç yansıma noktasında birleşene kadar çanağın kenarı boyunca gözle görülür bir şekilde çevrilecektir, bu noktada ışın artık çanağın kenarı boyunca görünmez.

Odak düğmesini ayarlayarak hücrelerin TIRF modunda olduğunu doğrulayın. TIRF'de, yalnızca bir hücre düzlemi odaklanabilir, bu da plazma zarının yüksek çözünürlüğü ile yüksek çözünürlüklü bir görüntü üretir. Bu prosedüre başlamak için, görüntüleme düzleminde sağlıklı transfekte edilmiş tek hücreleri bulun.

pH 7.4'te hücrelerin odaklanmış bir görüntüsünü elde edin. Plazma membranı ve endoplazmik retikulum üzerindeki SEP işaretli reseptörler görünür olmalıdır. Foto ağartmayı önlemek için lazer ışınının numuneye ulaşmasını hızlı bir şekilde engelleyin.

Her hücreye karşılık gelen aşama konumlarını kaydetmek için birden fazla XY konumunu kaydedebilen mikroskop görüntüleme yazılımı kullanın. Bu şekilde, her hücrenin konumunu kaydetmek için yazılımı kullanırken çanak başına 20 ila 30 hücrenin görüntülerini yakalayın. pH 7.4'teki tüm hücre görüntüleri toplandıktan sonra, tabağa dokunmadan pipetleme yaparak pH 7.4 ECS'yi manuel olarak çıkarın.

Tabağa dikkatlice iki mililitre pH 5.4 ECS ekleyin ve 10 dakika bekleyin. Bu süre zarfında, daha önce alınan görüntüleri kaydedin. pH 7.4'te görüntüleri toplamak için kullanılan aynı koşullar altında, sahneyi kaydedilen her konuma taşıyın ve pH 5.4'te aynı hücrenin bir görüntüsünü elde edin.

Tespit edilen tüm floresans, endoplazmik retikulum sınırlı SEP etiketli reseptörlerden kaynaklandığı için hücreler daha az tanımlanmış görünmelidir. PH 5.4 hücre görüntülerini kaydedin. Tek vezikül yerleştirmelerini görüntülemek için, önce transfekte edilmiş hücrelerin büyüme ortamını iki mililitre pH 7.4 ECS ile değiştirin.

Daha sonra, transfekte edilmiş hücrelerden oluşan çanağı mikroskobun tablasına yerleştirin ve tabağı yerine sabitlemek için tabla montajlarını kullanın. Daha önce gösterildiği gibi TIRF'de tek bir hücreye odaklanın. Varsa, otomatik odaklamayı, odak görüntüleme süresi boyunca kaymayacak şekilde ayarlayın.

Sürekli olarak 200 milisaniyelik kare hızında görüntü yakalayan 1.000 karelik bir dizi kaydedin. Bu süre zarfında, plazma zarı ile kaynaşan ve SEP'yi hücre dışı pH 7.4'e maruz bırakan düşük pH kaçakçılığı veziküllerine karşılık gelen floresan patlamaları görünür olacaktır. Hücre altı lokalizasyonunu belirlemek üzere SEP floresan analizine başlamak için, ImageJ gibi bir görüntü analiz yazılımı kullanarak hücre görüntülerini açın.

Yuvarlanan top ayarını kullanarak hem pH 5.4 hem de pH 7.4 görüntülerinden arka planı çıkarın. pH 7.4'te tek bir hücreden floresanı ölçmek için yoğunluğa dayalı eşiği kullanarak, önce görüntüyü seçin, ayarlayın ve eşiği ayarlayın. Ardından, hücrenin etrafında manuel olarak bir ilgi alanı seçin.

Analiz sekmesi altındaki yerleşik ölçüm işlevini kullanarak hücre alanını, ortalama yoğunluğu ve entegre yoğunluğu ölçün. Bu ölçümleri pH 5.4'te aynı hücre için tekrarlayın. Hem pH 7.4 hem de 5.4'teki hücre görüntüleri için entegre yoğunluk elde edildikten sonra, pH 7.4 değerinden pH 5.4 değerini çıkararak plazma zarı entegre yoğunluğunu hesaplayın.

Fark, TIRF uyarma bölgesi içindeki plazma zarı üzerindeki nispi reseptör sayısına karşılık gelir. Kaçakçılığın bir ölçüsü olarak, plazma zarı entegre yoğunluğunu pH 7.4'teki toplam entegre yoğunluğa bölerek ve 100 ile çarparak, plazma zarı üzerinde bulunan SEP etiketli reseptörlerin TIRF uyarma hacminde görünen kalan reseptörlere kıyasla nispi yüzdesini hesaplayın. Tek vezikül yerleştirme olaylarını analiz etmek için, görüntü analiz yazılımı kullanarak 1.000 TIFF görüntü serisini açın.

Yuvarlanan top ayarını kullanarak arka planı tüm karelerden çıkarın. Vezikül yerleştirme olaylarına karşılık gelen yoğun bölgeleri en üst düzeye çıkarmak için kaydın renk dengesini ayarlayın. Üç kareden veya 600 milisaniyeden daha uzun süren floresan patlamalarını manuel olarak sayın.

pH 7.4'teki bu hücre görüntüsü örneği, plazma zarı ve endoplazmik retikulum üzerinde bulunan reseptörleri göstermektedir. PH 5.4'te, plazma zarındaki reseptörler floresan yapmaz, bu nedenle sadece endoplazmik retikulum yerleşik reseptörleri görülebilir. pH 7.4 ve pH 5.4'teki floresanın entegre yoğunluğu arasındaki fark, plazma zarına lokalize reseptörlere karşılık gelir.

Tek vezikül yerleştirme olayları, pH 7.4'te plazma zarında en az 600 milisaniye süren bir floresan patlaması olarak görselleştirilir. Bir yerleştirmeden hemen önce, fark edilebilir bir patlama mevcut değildir. SEP taşıyan bir taşıma vezikülü geldiğinde floresan yoğunluğunda bir artış görülür.

SEP etiketli reseptörler daha sonra daha önce yerleştirilmiş reseptörlerden ayırt edilemeyecek duruma gelene kadar plazma zarı boyunca yayılır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yemek başına 45 dakika içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, periferik ER ve plazma zarı arasındaki protein dağılımındaki değişiklikleri nasıl izleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.