Name: Bir Ismarlama HPLC Arıtma Protokolü That Oligomer Formasyonu Yetenekli Verim Yüksek saflıkta Amiloid Beta 42 ve Amiloid Beta 40 peptidler, (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Öğrenin, Alzheimer araştırmaları için yüksek saflıkta Aβ42 ve Aβ40 peptitlerini elde etmek üzere özel HPLC arıtma protokolünü. Bu yöntem, oligomer oluşumu yeteneğini koruyarak zorlu arıtma sürecini kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar teknik yardım için Agilent teşekkür etmek istiyorum. Kate Markham ve Rafael Palomino Dr Hsiau-Wei Lee yazının Şekil 1 hazırlanmasında yaptığı yardım için teşekkür edilmektedir Aβ peptid ve onların ilk sentezinde yardım ve arıtma için yatırılır.

Aβ40 ya Aβ42 Peptid 1. Hazırlayıcı HPLC saflaştırma <ol><li> HPLC saflaştırması için, aşağıdaki tamponlar hazırlamak. <ol><li> Ultra saf su 1000 ml NH4OH (% 28 çözelti) 1.3 mL ilave edilerek tampon A (20 mM NH4OH) hazırlayın. </li><li> HPLC-grade asetonitril 800 mL ve ultra saf su 200 mL çözeltisine NH4OH (% 28 çözelti) 1.3 mL ilave edilerek tampon B (20 mM NH4 OH ile% 80 asetonitril) hazırlayın. </li><li> Ultra saf su ve 100 mL NH4OH (% 28 çözelti), 100 uL eklenmesiyle Örnek erime tamponu (% 0.1 NH4OH) hazırlayın. </li></ol></li><li> Kurulum, Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, HPLC aleti. <ol><li> A tampon ve polimer tüp kullanarak HPLC pompası girişlerine B tampon içeren çözücü şişe yerleştirin. tek parça uydurma HPLC pompası polimer boru takın. polimer boru emin olunher bir tampon aygıtının doğru giriş valfı takılmıştır. Bir degazör ile HPLC pompası takın. </li><li> Çift 300 Å 8 mikron 25 mm х 300 mm hazırlayıcı sütun girişi ile HPLC pompası polimer boru kullanılarak (Şekil 1B, aşırı sol sütun, Malzeme Listesi bakınız). <ol><li> tek parça parmak sıkı geçme ile hazırlayıcı sütun polimer boru takın. Polimer sütunu doğru bir şekilde yönlendirilmesini sağlamak. Not: Hazırlama sütunun durağan faz poli (stiren-divinilbenzen) parçacıklar oluşur. Polimer kolonun doğru yönelim tek yönlü ok ile dış gövde üzerinde işaretlenir. </li></ol></li><li> Polimer boru kullanarak ikili dalga boyu dedektörü sütunun çıkışını bağlayın ve 214 nm ve 280 nm dalga boyu dedektörü ayarlayın. <ol><li> kurulum enstrüman yöntemi seçeneği belirleme dalgaboyu parametrelerini değiştirerek dalga boyu AlterDahili HPLC yazılımı. </li></ol></li><li> tek parçalı bir parmak sıkı geçme ile bir dalga boyu detektörü girişine polimer boru takın. dalga boyu dedektörü çıkış vanasına polimer boru takın. tek parça parmak sıkı geçme ile HPLC dedektörü çıkış vanasına polimer boru takın. Bu örnek toplama tüp olacaktır. Not: Aβ peptidi üzerinde güçlü bir kromofor eksikliği 214 nm pik toplama primer ultraviyole (UV) bir dalga boyu olarak kullanılması zorunlu kılar. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55482/55482fig1.jpg" /> Şekil 1: beta amiloid peptidlerin saflaştırılması için kullanılan HPLC aygıtının deney düzeneği. (A) bir gaz giderici ve 214 nm ve 280 nm ayarlı değişken dalga uzunluğu detektörü ile donatılmış kuaterner HPLC pompası; (B) olarak hazırlanmıştır HPLC sütunları arasında, beta amiloid peptidlerin saflaştırılması için kullanılansoldan sağa, 25 x 300 mm, 2, hazırlayıcı kolon, 7.5 x 300 mm, 2, yarı preparatif kolonu ve 4.6 x 250 mm 2 Analitik kolon; (C) analitik HPLC için kullanılan 20 uL paslanmaz çelik enjeksiyon döngü ile Manuel enjektör; (D) hazırlayıcı ve yarı hazırlayıcı saflaştırma için kullanılan 10 ml paslanmaz çelik enjeksiyon döngü ile manuel enjektör. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55482/55482fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="3"><li> (HPLC yazılımı yerleşik kurulum enstrüman yöntemi seçeneği) çözücü tarife parametresini değiştirerek arıtma yöntemi giriniz Tablo 1&#39;de görüldüğü gibi arıtma yöntemini çalıştırmak için HPLC yazılım programı. HPLC yazılım üzerinde &quot;açık&quot; butonuna tıklayarak HPLC pompası açın. NOT: Pompa tampon A başlangıç ​​oranını temin başlar ve hazırlık yoluyla B tampon olacakarative kolon ve HPLC aleti. <ol><li> 30 dakika tamamen dengelenmesi için sistem bırakın. </li></ol></li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Saat / dakika </td><td> Tampon A% &#39;si </td><td> Tampon B b% </td><td> Akış Hızı d / ml dak -1 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 80 </td><td> 20 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 45 </td><td> 75.5 </td><td> 24.5 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 45.01 </td><td> 80 </td><td> 20 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 52.01 </td><td> 80 </td><td> 20 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 52.02 </td><td> 73 </td><td> 27 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 85 </td><td> 73 </td><td> 27 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 92 </td><td> 5 </td><td> 95 ° C </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> &lt;strong&gt; Tablo 1: 25 × 300 mm polimer kolon kullanılarak Aβ42 ve Aβ40 peptidler saflaştırılması için zaman çizelgesi. Bir Tampon A - 20 mM NH4 OH ile H2O; 20 mM NH4 OH ile B% 80 MeCN /% 20 H2O; örnek aşağıdaki enjeksiyondan önce sütun yıkama 15 dakika Cı Ran; D HPLC enstrümantasyon 6 mL / dakika bir akış hızı çalıştırmak için, basınç sınırı 200 bar azaltılması gerekir. <ol start="4"><li> Aβ peptidi numunenin saflaştırılması Not: Ham peptid bir otomasyonlu katı faz peptid sentezi ile elde edildi. 10 <ol><li> Örnek erime 4 ml tampon ham Aβ peptidi 3 mg eritin. Oda sıcaklığında 30-60 sn ve çözünmeye yardımcı olması için 40 kHz frekansta örnek sonikasyon. </li><li> 16-gauge ile donatılmış 5 mL&#39;lik bir plastik bir şırınga kullanılarak HPLC kolonuna Numunenin tamamı enjektepaslanmaz çelik iğne. alt aşama 1.3 belirtildiği gibi arıtma yöntemi çalıştırın. NOT: Sistem numune enjeksiyon 10 ml paslanmaz çelik enjeksiyon döngüsü (Şekil 1D) ile donatılmış bir el enjektörün kullanımı ile yapılabilir sağlar. İstenen Aβ peptid keskin çözülmesi tepe (Şekil 2C) olarak 72 ila 74 dakika Zehir. </li><li> 50 ml konik santrifüj tüpüne örnek toplamak. Toplanan eluent doğrudan enjeksiyon kütle spektrometresi ile Aβ zirve kimliğini onaylamak. 11 -20 ° C&#39;de en fazla 12 saat boyunca yıkama sıvısı. NOT: daha uzun 12 saat peptid oksidasyonu için potansiyeli nedeniyle tavsiye edilmez dönemler için çözümün depolama. </li><li> Toplanan kısım dondurma flaş saflaştırılmış peptid Yalıtmak / sıvı azot ve Lyophilize içinde Aβ peptid alikotları. -60 ° C ve bir pres içinde bir sıcaklıkta dondurularak kurutulması örnek tarafından liyofilizasyon gerçekleştirmek24 saatlik bir süre için 20 mTor olun. </li><li> Aβ peptidi saflığını belirlemek için aşağıda verilen analitik HPLC protokolü çalıştırın. 6 aya kadar bir süre için -20 ° C &#39;de bunların liyofilize formda saklayın peptidler. </li></ol></li></ol> Saflaştırılmış Aβ Proteininin 2. Analitik HPLC Analizi <ol><li> alt bölümde 1.1 belirtildiği gibi HPLC tamponlar hazırlayın. Yukarıdaki protokol. </li><li> Kurulum aşama 1.2.1 uyarınca ve 4.6 x 250 mm analitik sütun (Şekil 1B, en sağ sütun) ve 20 uL, paslanmaz çelik enjeksiyon döngüsü ile el enjektör ile, Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi (Şekil 1C) monte analitik HPLC Enstrüman. </li><li> Adım 1.3 ile benzer talimatları izleyerek Tablo 2&#39;de görüldüğü gibi analitik yöntemini çalıştırmak için HPLC yazılım programı. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Zaman /dk </td><td> Tampon A% &#39;si </td><td> Tampon B b% </td><td> Hızı / ml dak akış -1 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 95 </td><td> 5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 50 </td><td> 50 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Aβ peptidi HPLC saflığı analizi için takvim. Bir Tampon A - 20 mM NH4 OH ile H2O; 20 mM NH 4 OH b% 80 MeCN /% 20 H 2 O. <ol start="4"><li> Aβ peptidi saflığı analizi <ol><li> Örnek tampon çözeltisi içinde peptidin çözülmesi yoluyla saflaştırılmış peptidin 1 mg / ml çözelti hazırlayın. NOT: Tampon tarifi alt bölümde 1.1 bulunabilir. Protein konsantrasyonu, 280 nm&#39;de (A 280nm) protein emiliminin ölçülmesi ile belirlenir. 12 m<html> konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır olar yok olma katsayısı (ε) ε = 1.490 dm3 mol-1 cm-1 olan. 13 </li><li> HPLC kolonuna 1 mg / ml (222 uM) çözeltisinin 20 ul enjekte edilir ve adım 2.3 kurulum oldu analitik yöntem çalıştırın. Not: analiz için kullanılmaz kalan çözelti, sıvı nitrojen içinde dondurulur ve Aβ peptidi kurtarmak için liyofilize edilebilir. Liyofilizasyon ayrıntıları alt bölümde 1.4.4 bulunabilir. Aβ peptidi 16 ve 18 dakika boyunca (Şekil 2B) arasındaki analitik sütundan elute olur. Aβ peptidi saflığını belirlemek için HPLC aleti birlikte yerleşik entegre analiz yazılımı kullanarak. Saflık spektrumunun bireysel zirveleri her entegre ve peptit tepe yüzdesi alanını hesaplanarak belirlenir. Tipik olarak,&gt;% 95 bir saflaştırma saptanmalıdır. </li></ol></li></ol><img alt="&lt;/ Html">&quot;Şekil 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55482 / 55482fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2: Aβ42 Temsilcisi HPLC izleri. (A) Geleneksel C4 silika saflaştırma koşulları: Tampon A: H2O,% 0.1 trifluoroasetik asit (TFA), B tampon maddesi ile:% 0.1 TFA, gradyan ile MeCN (asetonitril): 20 tampon B 40 dakika boyunca,% 27 ve ardından izokratik% 27 B tamponu ile; (B) 25 x 300 mm, 2 Polimer kolonu, koşullar kullanılarak hazırlayıcı saflaştırma: 20 mM NH4OH, tampon B ile H2O: Tampon A% 80 MeCN /% 20, H, 20 mM NH4 OH ile 2, O, gradyan : izokratik% 27 tampon B, ardından 70 dakika boyunca% 20 ila 27 tampon B; 25 x 300 mm, 2 Polimer kolonu kullanılarak hazırlayıcı saflaştırmaya Optimize (C) koşulları alt bölüm protokolü açıklama metni 1.3 bulunan Tablo 1 &#39;de tarif edilir; (D) Analitik HPLC 4.6 x 250 mm 2 Polimer kolonu, kon kullanılarakitions: Tampon A: H2O, 20 mM NH4OH, tampon B ile: 30 dakika boyunca 20 mM NH4OH, gradyan% 5 ila 50 tampon B% 80 MeCN /% 20 H2O. Bölüm A, B ve C Aβ42 tekabül zirve bir yıldızla işaretlenir. Bölüm D. Kütle spektrometrisi gösterildiği gibi C&gt;% 95 bir saflığa ortaya kısmen işaretlenmiş Aβ42 tepe toplama Aβ42 zirvesinin ne olduğu belirlemek için kullanılmıştır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55482/55482fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol><li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20107219">Alzheimer's Disease.</a> N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).</li>
<li>McGowan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A%CE%B242+Is+Essential+for+Parenchymal+and+Vascular+Amyloid+Deposition+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice.</a> Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/100/18/10417.abstract">Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (18), 10417-10422 (2003).</li>
<li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Oligomers+of+the+Amyloid+%CE%B2-Protein+Impair+Synaptic+Plasticity+and+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior.</a> Behav Brain Res. 192 (1), 106-113 (2008).</li>
<li>Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+and+Chemical+Factors+Affecting+Amyloid+%CE%B2+Peptide+Amyloidogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity.</a> Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).</li>
<li>Kim, W., Hecht, M. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2346586/">Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer's Aβ Peptide.</a> J Mol Bio. 377 (2), 565-574 (2008).</li>
<li>Fezoui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+preparing+the+amyloid+beta-protein+for+fibrillogenesis+and+neurotoxicity+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments.</a> Amyloid. 7 (3), 166-178 (2000).</li>
<li>Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+on+polystyrene-divinylbenzene+columns+for+the+rapid+separation+and+purification+of+acid-soluble+nuclear+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins.</a> J Chromatogr A. 763 (1-2), 65-70 (1997).</li>
<li>Thess, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-engineered+mRNA+Without+Chemical+Nucleoside+Modifications+Enables+an+Effective+Protein+Therapy+in+Large+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals.</a> Mol Ther. 23 (9), 1456-1464 (2015).</li>
<li>Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+D-glutamate+at+a+critical+residue+of+A%CE%B242+stabilizes+a+pre-fibrillary+aggregate+with+enhanced+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eur+J%22%5BJournal%5D)">Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity.</a> Chem Eur J. 22 (34), 11967-11970 (2016).</li>
<li>Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-line+High-performance+Liquid+Chromatography%2FMass+Spectrometric+Investigation+of+Amyloid-%CE%B2+Peptide+Variants+Found+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer's Disease.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).</li>
<li>Layne, E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/279960568_Spectrophotometric_and_Turbidimetric_Methods_for_Measuring_Proteins">Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins.</a> Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).</li>
<li>Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0268005X1400469X">Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer.</a> Food Hydro. 46, 216-225 (2015).</li>
<li>Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-Induced+Cross-Linking+of+Unmodified+Proteins+%28PICUP%29+Applied+to+Amyloidogenic+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides.</a> J. Vis. Exp. (23), e1071(2009).</li>
<li>Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12506200">Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Aβ peptidi HPLC saflaştırma arıtılmadan kullanılan durağan faz peptid elüt edilmesi için seçilen mobil faz iki seçimi oldukça bağlıdır. toplama peptidin yüksek eğilimi düşük izoelektrik noktası Aβ peptidi uzun bir geniş olmayan çözüldü olarak elüsyon ile hidrofobik proteinlerin ayrılması (C4 veya asidik bir mobil elüsyon ile birleştirilmiş C8 faz) zor geleneksel kromatografik koşullan sağlamaya pik (Şekil 2A). Yüksek pH değerinde kimyasal olarak stabil, bu sorunu, PLRP-S dur...

Alzheimer hastalığı bir nörodejeneratif bir hastalıktır etkileri 35 milyondan fazla kişi dünya çapında. Hastalığın başlangıcı ve gelişiminde güçlü Belirtilmiş 1, yüksek toplama eğilimli, hidrofobik peptid Amiloid beta (Aβ) &#39;dir. 2 Aβ Ancak, beta amiloid 42 (Aβ42), proteinin en toksik bir şekilde 42-amino asit türevi olduğu düşünülmektedir, uzunluğu 36 ila 43 amino asit arasında değişir. 3 Bu hali hazırda, özellikle nörotoksik maddeler olduğu düşünülmektedir yayılabilir oligomerik türler oluşturma Aβ42 yeteneğini büyük bir kısmında kaynaklanmaktadır. 4 Aβ peptid anlayışımızı ilerletmek için, rutin yüksek saflıkta malzeme elde etmek esastır. saf olmayan artıklarının varlığı büyük ölçüde peptidin birikme eğilimi özelliklerini değiştirmek için gösterilmiştir. 5 Traditionally, örneğin Aβ hidrofobik peptitler, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ayırma C 4 ya da Cı 8 silis bazlı sabit fazlarda ve bir asidik mobil faz bir kombinasyonunun kullanımı ile yapılmıştır. 6 Ancak, bu tür koşullar peptid saflaştırılması için bir meydan okuma sunabilir. Aβ peptidi düşük izoelektrik noktası (pl yaklaşık 5.5) 7, asidik koşullar altında, peptid agregasyon artar ve bunun bir sonucu olarak genellikle izole etmek zordur, geniş olmayan çözüldü HPLC tepe (Şekil 2A) üretilmeleri anlamına gelir. Ayrıca, bu tür geniş zirveler genellikle peptid toplama profilini etkileyebilecek ve yaygın dramatik üretilen peptid miktarını etkileyebilir arınma sonraki mermi gerektirebilir safsızlıklar içermezler. poli (stiren / divinilbenzen) durağan faz, PLRP-S, saflaştırmadan bir alternatif araçları temsil ederYing hidrofobik peptitler. hareketsiz faz farklı protein ve haberci ribonükleik asitlerin (mRNA) &#39;in bir dizi saflaştırılmasında kullanılmıştır. 8, 9 PLRP-S sabit faz ters faz ayrılması için ek bir alkil ligandı gerektirir ve daha da önemlisi, peptidin agregadan arındırma çaresinin yol açan yüksek pH değerinde kimyasal olarak kararlıdır. 7 Burada, yüksek saflıkta amiloid beta 42 (Aβ42) ve amiloid beta 40 (Aβ40) peptidleri veren bir özel HPLC arıtma protokolü sunduk.

<table><tbody><tr><td>Agilent 1260 Infinity II çeyrek pompa</td><td>Agilent</td><td>G7111B</td><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II Çift değişken dalga boyu dedektörü</td><td>Agilent</td><td>G7114A</td><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II Manuel Enjektör, 10 mL paslanmaz çelik numune halkası ile donatılmıştır</td><td>Agilent</td><td>0101-1232</td><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II Manuel Enjektör, 20 & mikro ile donatılmıştır; L paslanmaz çelik numune halkası</td><td>Agilent</td><td>G1328C</td><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector</td></tr><tr><td>Halka Standı Montaj Braketi</td><td>Agilent</td><td>1400-3166</td><td></td></tr><tr><td>Agilent PLRP-S 300 & Aring; 5 &nbsp; &mikro; m 4,6 x 250 mm (Analitik)</td><td>Agilent</td><td>PL1512-5501</td><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features</td></tr><tr><td>A&beta; 42 veya A & beta; 40 peptit</td><td></td><td></td><td>CEM liberty otomatik peptit sentezleyici kullanılarak şirket içinde sentezlenir.</td></tr><tr><td>Amonyum Hidroksit (NH4OH, %28 çözelti)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669-500</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC sınıfı su</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL konik santrifüj tüpü</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-954-49A</td><td></td></tr><tr><td>Supelco PEEK Bağlantı Tek parça parmak sıkı, 5 adet paket</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z227250</td><td></td></tr><tr><td>Normject 5&nbsp; cc steril şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>1481729</td><td></td></tr><tr><td>16 Ölçer SS İğne</td><td>Reodyne</td><td>3725-086</td><td></td></tr></tbody></table>

bir ismarlama hplc arıtma protokolü that oligomer formasyonu yetenekli verim yüksek saflıkta amiloid beta 42 ve amiloid beta 40 peptidler,

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Alzheimer hastalığına bağlı Amiloid beta (Aβ) gibi amiloidojenik peptitler, yüksek saflıkta malzeme elde etmeye çalışırken önemli bir zorluk oluşturabilir. Burada, yüksek saflıkta amiloid beta 42 (Aβ42) ve amiloid beta 40 (Aβ40) peptitleri üretmek için özel bir HPLC saflaştırma protokolü sunuyoruz. Yüksek pH koşulları altında ticari olarak temin edilebilen hidrofobik poli (stiren/divinilbenzen) sabit faz, polimer laboratuvar ters fazı - stirendivinilbenzen (PLRP-S) kombinasyonunun, tek bir kromatografik çalışmada yüksek saflıkta (% >95) Aβ42 elde edilmesini sağladığını bulduk. Saflaştırma yüksek oranda tekrarlanabilir ve saflaştırılması istenen malzeme miktarına bağlı olarak hem yarı hazırlayıcı hem de analitik koşullara değiştirilebilir. Protokol, Aβ40 peptidine aynı başarı ile ve yöntemi değiştirmeye gerek kalmadan da uygulanabilir.

PLRP-S durağan faz bir kombinasyonunu 72 ve 74 dakika boyunca (Şekil 2C) arasında bir alıkonma zamanında Aβ peptidi için keskin çözüldü tepe oluşumunda yüksek bir pH mobil faz sonuçları kullanılarak Aβ42 peptidinin arıtılması. tepe kimliğinin teyidi toplanan elüsyon direkt enjeksiyonu kütle spektrometrisi yoluyla yapılır. yıkama sıvısı kadar 12 saat boyunca çözelti içinde -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. depolamanın daha uzun süreli protein oksidasyonu ile sonuçlanabi...

Bu yazıda oligomer oluşturabilen yüksek saflıkta amiloid beta 42 (Aβ42) ve amiloid beta 40 (Aβ40) peptidler, veren bir özel HPLC arıtma protokolü sunduk. Amiloid P Alzheimer hastalığında rol yüksek çekiş eğilimli hidrofobik peptittir. peptid amiloidojenik doğası onun saflaştırma bir meydan okuma yapar.

Bir Ismarlama HPLC Arıtma Protokolü That Oligomer Formasyonu Yetenekli Verim Yüksek saflıkta Amiloid Beta 42 ve Amiloid Beta 40 peptidler,

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Bu prosedürün genel amacı, oligomer oluşturma yeteneğine sahip yüksek saflıkta amiloid beta 42 ve amiloid beta 40 peptitleri üretmek için HPLC saflaştırmasını kullanmaktır. Amiloid beta peptidinin biyokimyasal özellikleri, saflaştırılmasını genellikle zorlaştırabilir. Bu nedenle, oligomer oluşumuna uygun yüksek saflıkta peptid elde etmek zorlayıcı olabilir. Bu prosedür, söz konusu zorluğu gidermeye yardımcı olur. Bu HPLC protokolü için A ve B tamponlarının stok çözeltilerinin yanı sıra örnek çözündürme tamponunu hazır bulundurun. HPLC'yi kurmak için öncelikle A ve B tampon şişelerini pompanın girişlerine yerleştirin. Polimer borular ve tek parçalı bağlantı aparatları kullanın ve valfleri karıştırmayın. Pompa çıkışından preparatif kolon girişine polimer boruyu bağlayın. Tek parçalı bağlantı aparatını elinizle sıkıca sabitleyin ve kolonun doğru yönde olduğundan emin olun. Şimdi kolon çıkışından çift dalga boyu detektörüne başka bir polimer boru sabitleyin. El ile sıkılan tek parçalı bağlantı aparatları kullanın; ardından HPLC kurulum yazılımında, dalga boyu detektörünü 214 ve 280 nanometrelerdeki pikleri ölçecek şekilde ayarlayın. Sonrasında, dalga boyu detektörünün çıkış valfini, po

a-tailored-hplc-purification-protocol-that-yields-high-purity-amyloid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Alzheimer hastalığının bir özelliği Aβ yükseklik.

Β-amiloid Oligomerik hazırlanması 1-42</subHipokampal Dilimleri Sinaptik Plastisite değer düşüklüğü> İndüksiyon

Amiloid beta-Protein, Alzheimer hastalığının etkeni Aptamers Seçimi

Bir ekstrasellüler matriks polisakkaritlerin yapısına anlayışlar kazanmak için hızlı bir şekilde açıklanmıştır. Yöntemi dakika miktarda malzeme analiz edilmesi için izin kütle spektrometresi glycosylhydrolases özgüllüğü ve duyarlılığı yararlanır. Bu teknikte doku kendisini doğrudan kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Ekstrasellüler polisakkaritler Oligo Kitle Profil (Olimp)

Bu video, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ve amiloid olmayan proteinlerin sindirimi kullanılarak fare beyin dokusu ekstraktından amiloid fibrilleri izole etme protokolünü göstermektedir.

Beyin Dokusu Ekstraktından Amiloid Fibrillerin İzolasyonu

Proteinler ya doğal bir yapıyı benimseyebilir ya da çözünmeyen amiloid'e yanlış katlanabilir. Yanlış katlanma yolunu destekleyen koşullar, farklı tipte amiloid fibrillerin oluşumuna yol açar. Burada açıklanan yöntemler, doğal proteinlerin in vitro olarak amiloid'e hızlı bir şekilde dönüştürülmesine izin verir.

İn vitro Yerli Proteinlerden Hızlı Amiloid Üretimi

Küçük ölçekte mikrobiyal ekzopolisakkaritlerin tanımlanması ve karakterizasyonu için otomatikleştirilmiş modüler yüksek verimli bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, yeni izole edilen bakteri suşlarının veya tüm suş koleksiyonlarının hızlı bir şekilde taranmasını sağlamak için salgılanan polisakkaritlerin toplam miktarını ayrıntılı bir karbonhidrat parmak izi ile analiz etmek için hızlı bir ön seçimi birleştirir.

Otomatik Modüler Yüksek Verimli Ekzopolisakkarit Tarama Platformu Oldukça hassas Karbonhidrat Parmak İzi Analizi ile birleştiğinde

Plazmada kombine proteomik ve glikomik saflaştırma ve LC-MS/MS miktar tayini için yüksek verimli bir protokol geliştirilmiştir. N-bağlı glikozilasyon motiflerinin deamidasyon analizi, deglikosile edilmiş bölgelere özgüydü. N-glikanların doğru kantitasyonu, glikan hidrazid etiketleri stratejisi ile etiketleme yapılırken filtre destekli N-glikan ayrımının bireysellik normalizasyonuna bağlanmasıyla elde edildi.

Nicel Glycomics ve Proteomik Kombine Arıtma Stratejisi

N- glukanlardir bağlantı için bir alüminyum oksit kaplı cam sentezi için modüler bir yaklaşım olarak geliştirilen glycan Mikroarray ve geniş antikor nötralize bir HIV profil oluşturma için kullanımı gösterilmiştir (ACG slayt) kaydırın.

N- glukanlardir dizi geliştirme ve HIV antikor için kemoterapi enzimatik sentezi profil oluşturma

Bu iletişim kuralı bir sentetik peptid vitro üzerinden Aβ reaksiyonlar hazırlamak için ve göreli Aβ oligomer miktarda analiz kurutma bir nokta tarafından değerlendirmek için açıklar.

A11-pozitif β-amiloid Oligomer hazırlama ve değerlendirme sistemini kullanarak Dot Blot Analizi

Kütle spektrometrisine dayalı proteomik analiz ile bu biyokimyasal saflaştırma yöntemi, Alzheimer hastalığını önleme hedeflerinin belirlenmesini hızlandırabilecek amiloid fibril çekirdeklerinin sağlam karakterizasyonunu kolaylaştırır.

Beyinden Amiloid Fibril Çekirdeklerinin Biyokimyasal Saflaştırılması ve Proteomik Karakterizasyonu

Bu protokol, dört farklı mantar β-glukanının saflaştırma adımlarını ve sonraki çalışmalarını, glioblastoma hücrelerine karşı mikroglia'nın anti-tümöral özelliklerini geliştiren potansiyel immünomodülatör moleküller olarak tanımlamaktadır.

Glioblastoma için İmmünoterapi Stratejisi Olarak Fungal β-Glukan'ın İzolasyonu ve Saflaştırılması

Öğrenin, Alzheimer araştırmaları için yüksek saflıkta Aβ42 ve Aβ40 peptitlerini elde etmek üzere özel HPLC arıtma protokolünü. Bu yöntem, oligomer oluşumu yeteneğini koruyarak zorlu arıtma sürecini kolaylaştırır.

Bir Ismarlama HPLC Arıtma Protokolü That Oligomer Formasyonu Yetenekli Verim Yüksek saflıkta Amiloid Beta 42 ve Amiloid Beta 40 peptidler, (Video) | JoVE Journal

Bir Ismarlama HPLC Arıtma Protokolü That Oligomer Formasyonu Yetenekli Verim Yüksek saflıkta Amiloid Beta 42 ve Amiloid Beta 40 peptidler,

Daha fazla video keşfet