Genetik Kodlanmış Floresan Nitrik Oksit Uygulama (• NO) Tek Hücrelerde YOK • Sinyallerin Gerçek zamanlı Görüntüleme için sondalar, geNOps,

Bu görüntüleme yaklaşımının genel amacı, genetik olarak kodlanmış floresan nitrik oksit problarının yeni bir sınıfı olan geNOps'u kullanarak nitrik oksit sinyallerini tek tek hücrelerin seviyesinde gerçek zamanlı olarak izlemektir. Nitrik oksidin biyoloji ve fizyolojideki önemi göz önüne alındığında, keşfedildiğinden beri bu molekülün hücresel ve hatta hücre altı düzeyde görüntülenmesi arzu edilmiştir. Nitrik oksit sinyallerini yeni, oldukça basit yapılı, floresan protein bazlı problar olan geNOps ile görselleştiriyoruz.

GeNOps, floresan söndürme ile doğrudan ve hemen nitrik okside yanıt verir. Bu, tek hücrelerde nitrik oksidin üretiminin, yayılmasının ve bozunmasının gerçek zamanlı kinetiğini izleyebileceğiniz anlamına gelir. GeNOps'un ana avantajı, geleneksel bir floresan mikroskobu kullanarak yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip nitrik oksit sinyallerine bakabilmenizdir.

Bu prosedüre, endotel hücre hattının veya HEK293 hücrelerinin depolama tamponunu, oda sıcaklığında demir (II) güçlendirici çözeltisinin oyuğu başına bir mililitre ile değiştirerek başlayın. Hücreleri karanlıkta tam olarak 20 dakika inkübe edin. Demir yükleme prosedürü, probların tam yanıt verebilirliğini elde etmek için gereklidir ve farklı hücre tipleri ve uygulamaları için uyarlanabilir.

Daha sonra, hücreleri bir kez depolama tamponu ile yıkayın ve hücrelerin dengelenmesine izin vermek için her bir kuyucuğu iki mililitre depolama tamponu ile oda sıcaklığında en az iki saat inkübe edin. Ardından, depolama arabelleğini bir mililitre depolama arabelleğinde 3.3 mikromolar Fura-2AM ile değiştirin. Hücreleri ışıktan koruyun ve 45 dakika inkübe edin.

45 dakika sonra, hücreleri iki kez depolama tamponu ile yıkayın ve hücrelerin dengelenmesine izin vermek için bir kez daha en az 30 dakika inkübe edin. Prosedüre başlamak için, önce endotel hücre hattı veya HEK293 hücreleri ile kaplanmış 30 milimetrelik bir lamel metal bir perfüzyon odasına sabitleyin. Görüntüleme sistemini açın ve ardından metal perfüzyon odasını mikroskobun üzerine yerleştirin.

Akış tüpünü tampon rezervuarlarına bağlayın ve ardından perfüzyon sistemini açın. Şimdi akışı bir vakum pompasına bağlayın, tutarlı bir akış sağlayın ve lamellerin boşalmasını önleyin. Yarı otomatik bir perfüzyon sistemi kullanarak fizyolojik kalsiyum tamponu ile yerçekimi güdümlü perfüzyonu başlatın.

Ardından, ilgili yazılımı kullanarak görüntüleme ayarlarını tanımlayın. Fura-2 görüntüleme için 340 nanometre ve 380 nanometre ve heyecan verici G-geNOp için 480 nanometre uyarma dalga boylarını seçin. Ardından, birkaç floresan hücre odaklanana kadar mikroskobun xyz tablosunu hareket ettirerek görüntüleme bölgesini seçin.

Ardından, ilgilendiğiniz bölgeleri tanımlayın. Her görüntüleme alanı için birkaç tam tek floresan hücreyi kapsayan bölgeleri çizin. Bunu takiben, benzer boyutta bir arka plan bölgesi tanımlayın.

Motorlu bir numune aşaması ve monokromatik bir ışık kaynağı ile ters çevrilmiş ve gelişmiş bir floresan mikroskopta veri toplamaya başlayın. Alternatif olarak, hücreleri Fura-2AM için sırasıyla 340 nanometre ve 380 nanometrede ve G-geNOp için 480 nanometrede uyarın. İlgili pozlama sürelerini, tüm kanallar için zaman içinde net bir floresan sinyali algılanacak şekilde ayarlayın.

500 nanometre uyarıcı, 495 nanometre dikroik ve 510-520 nanometre yayıcıdan oluşan uygun filtre setine sahip bir CCD kamera kullanarak yayılan ışığı Fura-2AM için 510 nanometrede, G-geNOp için 520 nanometrede toplayın. Ardından, her üç saniyede bir toplam kare kaydedin. İlgili floresan sinyallerinin taban çizgisini elde etmek için ilk üç dakikayı fizyolojik kalsiyum tamponunda kaydedin.

Stabil bir temel floresan gözlendiğinde, hücreleri üç dakika boyunca uyarmak için fizyolojik kalsiyum tamponu içeren 100 mikromolar histamine veya ATP'ye geçin. Daha sonra, bileşikleri hücrelerden çıkarmak için beş dakika boyunca histamin veya ATP ve L-NNA içermeyen fizyolojik kalsiyum tamponuna geri dönün. Daha sonra, perfüzyon sistemini kullanarak fizyolojik kalsiyum tamponunda iki dakika boyunca 10 mikromolar NOC-7 uygulayın.

Nitrik oksit donörü, G-geNOp floresansını güçlü bir şekilde etkiler ve genellikle 10 mikromolar NOC-7'ye yanıt olarak hücreleri %20'den fazla azaltır. EA.hy926 hücrelerinde, NOC-7 etkisi, agonist kaynaklı G-geNOp floresan söndürmeye kıyasla daha güçlüdür. Bunu takiben, nitrik oksit salan bileşiği fizyolojik kalsiyum tamponu ile yaklaşık 10 dakika yıkayın ve bazal floresan geri kazanıldığında kaydı durdurun.

Burada gösterilen, Fura-2AM ile yüklenmiş G-geNOp eksprese eden EA.hy926 hücrelerinin temsili geniş alan floresan görüntüleridir. Ve burada, 100 mikromolar histamine yanıt olarak Fura-2 ve G-geNOp sinyallerinin eşzamanlı kayıtlarının temsili zaman seyri yer almaktadır. Belirtildiği gibi, histamin bir perfüzyon sistemi kullanılarak üç dakika sonra çıkarıldı.

Bu eğriler, geçici olarak G-geNOp eksprese eden tek bir Fura-2AM yüklü endotel hücresinin sitozolik kalsiyum ve nitrik oksit sinyallerinin eşzamanlı kayıtlarını temsil eder. Hücreler, kalsiyum içeren bir tamponda üç dakika boyunca 100 mikromolar histamin ile uyarıldı. Ve burada gösterilen, ölçümden önce 500 mikromolar L-NNA ile ön işleme tabi tutulan bir EA.hy926 hücresinin zaman içinde eşzamanlı olarak kaydedilen kalsiyum ve nitrik oksit sinyalleridir.

Hücreler, iki milimolar kalsiyum varlığında 100 mikromolar histamin ile tedavi edildi. Bu şekil, bir mikromolar ATP'ye yanıt olarak sitozolik nitrik oksit sinyallerini temsil eden ortalama eğrileri ve ardından 100 mikromolar ATP ile ikinci bir hücre stimülasyonunu göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik nitrik oksit sinyallerini minimum çabayla gerçek zamanlı olarak görselleştirmenizi sağlar.

Bu tekniğin, araştırmacıların çeşitli hücre modellerindeki nitrik oksit sinyallerini keşfetmeleri ve yeniden araştırmaları için yol açacağına inanıyorum. Bu videoyu izledikten sonra, model sisteminizdeki nitrik oksidin gerçek zamanlı görüntülenmesi için geNOps teknolojisini nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.