Name: Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Öğrenin, zebra balığı embriyolarında retinal progenitör hücrelerin canlı izlenmesiyle hücre dışı sinyalleşmenin sinir oluşumuna etkisini. Bu yöntem genetik arka planların hücre davranışını nasıl etkilediğini ortaya koyar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser (PO 1440 / 1-1) LP PRJ bir ARC Decra (DE120101311) tarafından ve bir Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) araştırma bursu ile desteklenmiştir. Avustralya Rejeneratif Tıp Enstitüsü Victoria Eyalet Hükümeti ve Avustralya Federal Hükümeti fonları tarafından desteklenmektedir. Biz Kei ve ark yayınlanan Burada anlatılan deneyler yaptılar Dr. Jeremy Ng Chi Kei, kabul. 2016 Prof. Higashijima gelen transgenik balık hükümleri için minnettarız ve Profs teşekkür ederiz. H2B-RFP ve H2A-GFP yapıları oluşturmak için pCS2 plazmid Dr. Wilkinson sağlanması için Turner ve Rupp. Biz hayvanların bakımı için FishCore tesis personeli (Monash Üniversitesi) teşekkür ederim.

<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+on+the+stage+-+spotlight+on+nervous+system+development+in+zebrafish%3A+EMBO+practical+course%2C+KIT%2C+Sept.+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013.</a> Neural Dev. 8, 23(2013).</li>
<li>Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lineage in the vertebrate retina.</a> Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).</li>
<li>Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+on+neural+lineage+and+mode+of+division+in+the+zebrafish+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo.</a> J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).</li>
<li>Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+analysis+of+retinal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse analysis of retinal differentiation.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).</li>
<li>Jusuf, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biasing+amacrine+subtypes+in+the+Atoh7+lineage+through+expression+of+Barhl2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2.</a> J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).</li>
<li>Jusuf, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+determination+of+inhibitory+cell+lineages+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina.</a> J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).</li>
<li>Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+retinal+progenitor+lineages+in+developing+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li>
<li>Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+transgenic+zebrafish+embryos+for+imaging+the+developing+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li>
<li>Vitorino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vsx2+in+the+zebrafish+retina%3A+restricted+lineages+through+derepression%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression.</a> Neural Dev. 4, 14(2009).</li>
<li>Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+regulation+of+neuronal+production+in+the+larval+frog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina.</a> J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).</li>
<li>Reh, T. A., Tully, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tyrosine+hydroxylase-containing+amacrine+cell+number+in+larval+frog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina.</a> Dev Biol. 114, 463-469 (1986).</li>
<li>Livesey, F. J., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+neural+cell-fate+determination%3A+lessons+from+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina.</a> Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).</li>
<li>Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+and+orientation+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo.</a> Neural Dev. 1, 2(2006).</li>
<li>Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alx%2C+a+zebrafish+homolog+of+Chx10%2C+marks+ipsilateral+descending+excitatory+interneurons+that+participate+in+the+regulation+of+spinal+locomotor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits.</a> J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).</li>
<li>Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V2a+and+V2b+neurons+are+generated+by+the+final+divisions+of+pair-producing+progenitors+in+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord.</a> Development. 135, 3001-3005 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+from+each+retinal+neuron+population+drives+expression+of+subsequent+fate+determinant+genes+without+influencing+the+cell+cycle+exit+timing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing.</a> J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Zou, J., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+GFP-expressing+blastomeres+for+live+imaging+of+retinal+and+brain+development+in+chimeric+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+axis+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of axis formation in zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).</li>
<li>De Luca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/articles/srep04898">ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos.</a> Sci Rep. 4, 4898(2014).</li>
<li>Lin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+requirement+for+ptf1a+in+endocrine+and+exocrine+lineages+of+developing+zebrafish+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas.</a> Dev Biol. 274, 491-503 (2004).</li>
<li>Hollyfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+retina+in+the+killifish%2C+Fundulus+heteroclitus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus.</a> J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).</li>
<li>La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1894769">Cytogenesis in the monkey retina.</a> J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).</li>
<li>Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+topography+of+cell+genesis+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Timing and topography of cell genesis in the rat retina.</a> J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).</li>
<li>Sharma, S. C., Ungar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+goldfish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the goldfish retina.</a> J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).</li>
<li>Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+birthdays+in+Xenopus+laevis+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Cell birthdays in Xenopus laevis retina.</a> Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

verimli, belirli bir post-mitotik hücre tipinde, hatta desenli doku içine ayırt etmek için embriyonik veya uyarılmış multipotent kök hücreleri talimat amaçlayan zaman hangi ölçüde komşu hücrelerin hücre zarı kaderi belirleyen faktörlerin ifade zamanlamasını etkilemesi anlamak esastır. Ayrıca, canlı hayvanın gelişmekte olan hücrelerde bu moleküler olayları inceleyen ayrıca ilgili dinamiği in vivo bu olaylar ile ilgili özel hücresel bağlamlarda (zamansal ve mekansal) bilgi sağlar. Bu tür çalışmalar kolayca tüm om...

<html> In vivo omurgalı önemli gelişim süreçleri görselleştirmek için yeteneği normal ve hastalık koşullarını incelemek için Zebra balığı bir anahtar modeli yapma katkıda bulunmuştur (1 gözden, 2). Özellikle nöral retinanın merkezi sinir sistemi erişilebilir bir parçasıdır. Retina nedeniyle son derece organize, henüz nispeten basit yapısı ve omurgalı türlerin 3 genelindeki yüksek oranda korunmuş nöron tiplerine kolayca nöron çalışmalar yapmak için oldukça rahat. Böyle çoğalması, hücre döngüsü çıkış, asimetrik hücre bölünmesi, kader özellikleri, farklılaşma ve nöral devreler oluşumu gibi hücresel davranışları dinamikleri 3 gün postfertilization tarafından zebrabalıkları merkezi retinada tamamlanır retinogenesis tüm süreç boyunca takip edilebilir ( dpf) 4, 5,ref &quot;&gt; 6, 7. Bundan başka, yukarıda bahsedilen aşamaların her biri farklı genlerin fonksiyonel gereksinimler eş zamanlı olarak, sadece ölüm sonrası inceleme sonucunda tespit edilebilir olup, burada gen knockout tekniklerinin uygulanması sonucu ortaya çıkan fenotipler diğer omurgalı modeller üzerinde bir avantaj sağlayarak, zebra balığı retinada değerlendirilebilir dokularını düzeltildi. Özellikle, görselleştirmek ve retina raportör transgenler olarak floresan proteinleri ifade izleyebilen transgenik hatların kullanımı, ABD, belirli bir nöronal hücre tipinin oluşumunu altında yatan, gen sentezlenmesinin zamansal çözünürlüğü elde edilmesine olanak sağlamaktadır. Nedeniyle zebrabalıkları hızlı gelişimine, bu olaylar dolayısıyla nöronal hücre kimlik edinme ve hücre davranışı ile ilgili olarak gen ifadesinin zamansal önemi hakkında daha ayrıntılı bilgiler sağlayarak, tüm gelişim döneminde görülebilir. Son olarak, bu yaklaşımlar, gen fonksiyonu iki temel yönlerine ilişkin olarak elde edilen, transplantasyon ile kimera üretimi ile zebrabalıkları etkin birleştirilebilir. Birincisi, onlar bir etiketsiz vahşi tip ortamında geliştirmek iken belirli bir genin nakavt edildiği bir donör embriyo, nakledilen hücrelerin incelenmesi, hücre-otonom bir şekilde gen fonksiyonu hakkında ilgili bilgi almak için bize izin verir. Bu, normal olarak, artık, bu genler, 4, 6, fonksiyonel proteini oluşturabilir progenitörlerin gelişim kaderi sonucu incelenmesi ile örneklenmiştir. Bu ifade edilmiştir progenitör hücreler içinde retina kaderi belirleyici faktörleri işlevi hakkında önemli noktanın anlaşılmasını yol açar 8, 9. Bu yaklaşımı kullanarak, birçok kader belirleyici faktörler (örneğin, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) hücre hareket ettiklerini göstermiştir-autonomously belirli retina nöronal kaderi sürücü; Gen ifadesinin eksikliği temel olarak demonte gen ile hücreler alternatif bir hücre kaderine 4, 6, 7, 10 benimseyerek canlı kalır, öyle ki bir kader anahtar yol açar. İkincisi, bu tür kimerik deneyler farklı genetik ortamlar içinde geliştiğinde tip ataları nasıl davranacağını vahşi değerlendirmek için de kullanılabilir. Örneğin, genellikle manipüle ana bilgisayar ortamında (örneğin, gen nakavt / demonte) karşısında WT ilgi (ve muhabir transgen) bir gen ifade WT hücrelerinin gelişimini karşılaştırarak, gen ifadesi ve hücre kaderi üzerinde çıkan etkileri değerlendirilebilir . Ev sahibi ortamında bazı nöron tipleri olmaması, örneğin, daha az temsil o ayırma yöntemi önyargılı için onları, hücre otonom-olmayan bir şekilde, yabani tip progenitör davranışını etkilemek için gösterilmiştirNöron türleri 4, 7, 11, 12 eksik r. Retina nöronlar (13 gözden) belirli nöronal kaderi belirleyici gen sırayla zamanlı ifadesi (kader gen ifadesi) tarafından korunmuş histogenez sırayla doğarlar göz önüne alındığında, biz göstermek için bu yöntemleri nasıl kullandığını vahşi tip atalarıdır kader gen ifadesinin zamanlaması Bu tür atalarıdır kaynaklı anormal hücre kompozisyonlar ile retina konak ortamlarda gelişebilir zaman etkilenir. Nispeten standart ve yaygın olarak kullanılan tekniklerin kombinasyonu retina atalarıdır 8, 9 gelişmekte olan kader gen ifadesinin zamanlaması incelenmesini sağlar nasıl Burada delil olarak bu yaklaşımları özetlemektedir. Bu protokol başına kolaylığı ile time-lapse görüntüleme birleştiren deneysel bir yaklaşım anlatılmaktadırex vivo gelişmekte olan zebrafish embriyo nakli oluşturan bireysel mosaically gelişimsel retinogenesis tüm dönem boyunca etiketli hücreleri takip etmek. fonksiyonel gen manipülasyonlar yaparak ya ev sahibi embriyo, donör embriyo, her ikisi veya hiçbiri de, bir gen fonksiyonu hücre özerklik değerlendirebilir. Bu yaklaşım Burada özetlenen bileşenleri tek tek uygun olan herhangi bir başka sistemde benzer araştırma sorularına yaygın adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td>Agaroz kaplı yemekler birkaç gün önceden hazırlanabilir, kurumasını önlemek için parafilm ile kapatılabilir ve 4 & # 176'da saklanabilir; C</td></tr><tr><td>Agaroz düşük eriyik</td><td>Sigma</td><td>A9414-100G</td><td>Daha büyük hacimlerde hazırlanabilir, sıvılaştırmak için mikrodalgada pişirilebilir ve daha sonra 40 & # 176'da erimiş halde tutulabilir; C su banyosu. 1 mL alikot hazırlanabilir (monte edilen her embriyo grubu için bir tane).</td></tr><tr>benzer çapa sahip <td>borosillicate glass kılcal boru SDR</td><td>Scientfic</td><td>30-0035</td><td>filamentsiz alternatifler kullanılabilir&nbsp;</td></tr><tr><td>SDR Scientfic</td><td>30-0038</td> <td>filamentli borosillicate cam kılcal boru</td><td>benzer çapa sahip alternatifler kullanılabilir&nbsp;</td></tr><tr><td>cam petri kapları (60 mm çap)</td><td>Bilim Her</td><td>boyutta herhangi bir cam alternatifi</td><td>1070506</td> tedarik</tr><tr><td>Enjeksiyon tüpü (2 m)</td><td>Eppendorf</td><td>524616004</td><td>Bu, nakil sırasında iğne tutucuyu şırıngaya bağlar</td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon kalıbı (kama şeklinde çıkıntılara sahip plastik kalıp)</td><td>Uyarlanabilir Bilim Araçları</td><td>Benzer şekle sahip</td><td>PT-1</td> alternatifleri</tr><tr><td>mikroiğne kullanılabilir tutucu</td><td>Narishige</td><td>M-152</td> enjeksiyon <td>iğnelerinin dış çapına uyan herhangi bir alternatif</td></tr><tr><td>mikroenjektör</td><td>veya Eppendorf Femtojet</td><td></td> kullanılabilir, <td>gaz basıncı</td></tr> kullanan pnömatik enjektör <tr><td>mikromanipülatör</td><td>Coherent Scientific</td><td>M330IR</td><td>benzer alternatifler kullanılabilir</td></tr><tr>,<td>mikro yükleyici ucu</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma</td><td>M5904-500ML</td><td></td></tr><tr><td>iğne çektirme</td><td>Sutter Instruments</td><td>Model P-2000</td><td>Bu çektirme için kullanılan ayarlar şunlardır: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Uygun uç boyutu ile sonuçlanırsa herhangi bir iğne çektirme kullanılabilir</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Interpath</td><td>PM996</td><td>herhangi bir parafin filmi</td></tr><tr><td>Pasteur pipet plastik</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet camı</td><td>Hirschmann Laborgeraete</td><td>9260101</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5942-25MG</td><td>&nbsp; Proteaz Tip XIV</td></tr><tr><td>N-fenil tiyoüre</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTU toksiktir ve toza sık sık maruz kalmaktan kaçınmak için bir stok çözeltisi olarak hazırlanabilir, satın almadan / kullanmadan önce MSDS'ye danışın.</td></tr><tr><td>Qiaquick jel ekstraksiyonu</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>DNA'yı saflaştırmak için herhangi bir alternatif kullanılabilir</td></tr><tr><td>Rneasy Mini kiti</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>RNA'yı saflaştırmak için herhangi bir alternatif</td></tr><tr><td>kullanılabilir SP6 mMessage kiti</td><td>Qiagen</td><td>AM1340</td><td>SP6 kullanarak DNA'yı kopyalamak için herhangi bir alternatif</td></tr></tbody></table>

kimerik zebra balığı embriyolar bireysel retina progenitörlerin transgenik gen İfade vivo görüntüleme hücre otonom olmayan etkiler eğitim için

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Genetik ve teknik güçlü Zebra balığı omurgalı gen manipülasyon sonuçları hızlı gelişim dönemi boyunca in vivo izlenebilmektedir hangi önemli bir model organizmadır yaptık. Çoklu işlemler hücre çoğalması, gen ekspresyonu, hücre göçü ve morfojenezinin içeren incelenebilir. Önemli olarak, transplantasyon ile kimeralar üretimi kolayca mevcut ortamının etkisi altında mozaik etiketleme ve tek tek hücrelerin izleme sağlayan gerçekleştirilebilir. Örneğin, tek tek nakledilen verici hücreler üzerinde (morfolino mikroenjeksiyon yoluyla örneğin) ana embriyo fonksiyonel gen manipülasyonlar ve canlı görüntüleme, ekstrinsik etkileri (genetik olarak modifiye edilmiş bir ortamda sağlanan) hücre otonom olmayan sinyallerin birleştirilmesi ile değerlendirilebilir. İşte biz bu yaklaşım hücre kaderinin tanımlayabiliriz zamanlaması için bir vekil olarak floresan transgen ifadesi başlangıcını karşılaştırmak için kullanılır nasıl göstermekfarklı genetik konak ortamlarda tirme. Bu yazıda, donör hücreleri işaretlemek için ve gen konak embriyolarda demonte, kimerik embriyolar oluşturmak için kullanılan nakli tekniğinin bir açıklama ve hazırlanması ve in vivo time-lapse konfokal çalışan için protokol neden Zebra balığı embriyolar microinjecting için protokol sağlar birden çok embriyo görüntüleme. Bu tür bir gen ifadesinin başlangıcı gibi olaylar zamanlamasını karşılaştırırken Özellikle, birden çok noktaya görüntüleme gerçekleştirmek son derece önemlidir. Bu çoklu kontrol ve eş zamanlı olarak işlenen deneysel embriyolardan veri toplama gerektirir. Böyle bir yaklaşım, kolayca herhangi bir organ ya da görüntüleme yaşamak için erişilebilir seçim dokuda dış etkilerden çalışmaları için uzatılabilir, transplantasyonlar kurulan embriyonik kader haritalarına göre kolayca hedef olabilir şartıyla.

Bu çalışma yabani tip retina atalarıdır bir morphant ev sahibi embriyo içinde geliştiğinde gen ifadesi zamanlama değişiklikleri değerlendirmek için deneysel bir protokol sunar. Deneysel ana embriyolar retina 7, 26 ara doğan yatay ve amacrine internöronlardan eksikliği Ptf1a morphants vardır. Bunlar standart bir kontrol morfolino enjekte edildi konak embriyolar, kontrol karşılaştırılmıştır. <p class="jove_content" fo:keep-toge...

farklı genetik kökenden bireysel WT retina atalarıdır Canlı izleme nöron sırasında hücre özerk olmayan sinyalizasyon katkısı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, embriyo transplantasyonu yoluyla ve in vivo time-lapse konfokal görüntüleme gen demonte, kimera nesil bir arada bu amaçla kullanılmıştır.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Bu prosedürlerin genel amacı, gelişmekte olan hücrelerin içinde veya çevresindeki ortamda meydana gelen gen ekspresyonu değişikliklerinin, gelişim sırasındaki zamansal süreçleri nasıl etkilediğini incelemektir. Bu yöntem, kader belirleme zamanlamasının bir hücre içinde hücre-otonom şekilde eksprese edilen genler tarafından mı, yoksa komşu hücrelerde hücre-non-otonom şekilde mi kontrol edildiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, genetik olarak farklı ortamlarda gelişen bireysel progenitör hücrelerin, in vivo bir omurgalıda takip edilebilme yeteneğinde yatmaktadır.Prosedürü, laboratuvarımdan araştırma görevlisi Stefanie Dudczig uygulamalı olarak gösterecek. Metin protokolüne uygun olarak zebrafish embriyolarının yanı sıra Morpholino veya mRNA yüklü mikroenjeksiyon iğnelerini hazırladıktan sonra, iğne ucunu bir kap içindeki bir damla mineral yağına daldırın. Ayak pedalına basarak enjeksiyon hacmini ölçün ve enjeksiyon hacmi, bir mikrometre lamı veya alternatif olarak oküler gratikülü ile ölçüldüğünde bir nanolitreye eşit olana kadar gaz basıncını ve/veya süre süresini ayarlayın.Bir Petri kabına bir mikroskop lamı yerleştirin ve bir transfer pipetiyle, tek hücre evresindeki embriyoları lamın kenarı boyunca bırakın. Ardından, enjeksiyonlar sırasında hareketleri önlemek için ince bir transfer pipetiyle mümkün olduğunca fazla sıvıyı uzaklaştırın. Sonra, ince ucunun yarısı kesilmiş bir Microloader pipet ucu kullanarak, embriyoları tek bir sütun haline getirin.Ardından, iğneyi tek hücre aşamasındaki bir embriyoya doğru indirin ve koriyon ile vitellusu tek bir pürüzsüz hamleyle delin. İğne ucu vitellusun merkezine yerleştiğinde, ayak pedalına bir kez basın ve tek aşamalı embriyonun vitellusuna bir nanolitre H2AGFP veya H2BRFP mRNA mikroenjekte edin. Enjeksiyon iğnesini çıkarın, bir sonraki embriyoyu konuma getirmek için embriyoların bulunduğu kabı hareket ettirin ve embriyo sütununun tamamı enjekte edilene kadar işleme devam edin.Tüm embriyoları enjekte ettikten sonra, tabağı 30 ila 45 derecelik bir açıyla eğin ve enjekte edilen embriyoları yeni, temiz bir Petri kabına aktarmak için sıkmalı şişedeki E3 ortamını nazik bir akışla kullanın. Döllenmeden üç saat sonra, 2X ila 5X büyütmede bir floresan mikroskobu altında, donör embriyolarda etiketleme sinyalini kontrol etmek için bir RFP filtresi kullanın. Güçlü floresan sinyali olan, iyi gelişmiş embriyoları seçin.Enjeksiyon plakalarını ve Petri kaplarını metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, uzun formlu ve ince uçlu bir cam Pasteur pipetinin ucunu, elmas bıçakla iğneyi çevirerek çizip uç düşene kadar işlemi tekrarlayarak, rahat manevra yapmaya olanak sağlayacak bir uzunlukta kesin. Kesimin düz olduğundan emin olun. Ardından, koryonları ayrılmış embriyolara zarar vermemek için, cam transfer pipetinin kesilmiş yüzeyini bir Bunsen beki alevinde döndürerek uçların pürüzsüzleşmesi için ateşle cilalayın.Embriyoları dekoryone etmek için, iyi gelişmiş konakçı ve donör embriyoları iki ayrı 10 mililitre Erlenmeyer cam beherin içine yerleştirin ve mümkün olduğunca fazla sıvıyı uzaklaştırın. Her bir behere önceden hazırlanmış 0,5 miligram per mililitre proteaz çözeltisinden 5 mililitre ekleyin ve embriyoları bir diseksiyon mikroskobu altında gözlemlerken nazikçe çalkalayın. Çalkalamaya devam ederken, ilk embriyo koryondan çıkar çıkmaz, sıvının çoğunu döküp yan taraftan nazikçe E3 ekleyerek behere yeniden doldurma işlemiyle proteaz çözeltisini uzaklaştırmak için E3 ortamı kullanarak üç kez hızlıca durulama yapın.İlk birkaç koryonu sökülmüş embriyo gözlemlenir gözlemlenmez, hızlı ancak nazik bir durulama yaparak enzimatik dekoryonasyonu durdurun. Transplantasyonlar için, yalnızca simetrik bir hücre kütlesine sahip, vitellusta belirgin deformasyon veya hasar bulunmayan dekoryonize embriyoları seçin. Blastula transplantasyonunu gerçekleştirmek için, iğneyi iğne tutucuya yerleştirin ve transplantasyon düzeneğinin borularına bağlayın.Sıvıyı iğneden içeri ve dışarı çekmek için şırıngayı manuel olarak çalıştırarak sızdırmazlığı test edin. Ardından, bir cam pipet yardımıyla donör embriyoları agaroz kalıbının birinci kolonuna aktarın. Sonrasında ise host embriyoları agaroz kalıbının ikinci ile altıncı kolonları arasına aktarın.Transplantasyon iğnesini donör embriyosunun blastomer hücrelerinin üzerine nazikçe yerleştirin ve yaklaşık 20 ila 50 hücreyi yavaşça transplantasyon iğnesine çekin. Vitellusu çekmekten kaçının. Mikromanipülatörü kullanarak, transplantasyon iğnesini donör embriyodan kaldırın.Enjeksiyon kabını sola hareket ettirin ve transplantasyon iğnesi ucunu hücre kütlesinin yan tarafından, birinci konak embriyosunun hayvan kutbuna yerleştirin. Bu bölgenin ön beyin göz alanını oluşturduğunu gösteren bir kader haritalamasına göre, yüzeye yakın bir yere beş ila 10 hücre bırakın. Embriyoları görüntüleme için sabitlemek amacıyla, plastik bir transfer pipetiyle en fazla beş embriyo çekin ve embriyoların yerçekimi yardımıyla uç kısımda birikmesini sağlayın.Embriyoların tüpün içine çökmesini sağlarken E3 transfer miktarını sınırlayarak, transfer pipetini daha önce hazırlanmış %1 düşük erime noktalı agaroz içeren plastik tüpün yüzeyine dokundurun. Ardından, beş embriyoyu agarozlu plastik tüpten 0,5 ile 1 ml agaroz içeren bir Petri kabına aktarın ve aynı transfer pipette'i kullanarak, geriye sadece küçük bir damla kalacak şekilde fazla agarozu uzaklaştırın. Agaroz katılaşana kadar embriyoları yan yana hizalamak için ucu kırılmış bir mikro-yükleme pipeti kullanın.Ardından, her seferinde beş embriyoya kadar, ayrı agaroz damlacıkları içinde montaj işlemine devam edin. Dik bir mikroskopla görüntüleme yapılıyorsa, embriyoları Petri kabı çevresinden bir santimetre mesafe bırakarak yerleştirin. Görüntüleme sırasında herhangi bir yerinden çıkma ve yanal hareketi önlemek için, kabın kenarındaki agaroz damlacıklarını birbirine bağlamak amacıyla ek %1 düşük erime noktalı agaroz kullanın.Doğru montaj açısına, güçlü bir kalp atışına ve gen ekspresyon dalgasının başladığı gelişmekte olan retinanın ön ventral kadranında öncelikle birkaç transplantasyon yapılmış donör hücreye sahip embriyoları seçin. Görüntülemeyi metin protokolüne uygun olarak gerçekleştirin. Bu şekilde gösterildiği gibi, tek hücre aşamasındaki embriyoların vitellusine bir nanolitre mRNA mikro-enjeksiyonu, döllenmeden üç saat sonra floresan raporlayıcı protein ekspresyonu ile sonuçlanır ve bu aşamada en parlak donörler seçilir.Döllenmeden 24 saat sonra, ilgili retinal bölgelere donör hücreler nakledilen embriyolar 16 ila 24 saat boyunca zaman ayarlı görüntülemeye tabi tutulmuştur. Tek bir optik Z-kesitinden oluşan bu konfokal görüntü, gelişmekte olan gözdeki parlak alanın kırmızı kanallarla üst üste bindirilmesini ve etiketlenmemiş konak ortamı içerisinde kırmızı ile işaretlenmiş birkaç donör hücreyi göstermektedir. Bu mikrograflar, etiketlenmemiş yabani tip bir konağa nakledilen atoh7:gapGFP transgenik embriyolardan alınan, gelişmekte olan yabani tip donör hücrelerin zaman ayarlı görüntülemelerinden elde edilmiştir.Burada görüldüğü gibi, birkaç hücrede transgen ekspresyon başlangıcı belirtilmektedir. Uzmanlaşıldığında, mikro-enjeksiyonlar iki saat içinde gerçekleştirilebilir ve embriyo seçimi, hazırlama ve transplantasyon aynı gün içinde üç saatte tamamlanabilir. Bu prosedürlerin ardından veya bunlarla paralel olarak, post-mortem analiz için embriyoları belirli yaşlarda sabitleyebiliriz.Örneğin, donör hücrelerin ne kadarının belirli bir geni veya proteini eksprese ettiğini, spesifik bir morfolojiye sahip olduğunu veya belirli bir konuma göç ettiğini nicel olarak belirleyebiliriz. Bu videoyu izledikten sonra, zebrafish embriyolarının genetik olarak nasıl manipüle edileceği ve genetik olarak farklı donör ve konakçılar arasında nasıl kimeralar oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ayrıca, fikse edilmiş dokularda yanıtlanamayan soruları cevaplamak için embriyoları in vivo zaman aşımı görüntülemesi için monte edebilmelisiniz.

in-vivo-imaging-transgenic-gene-expression-individual-retinal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Zebra balığı hücre nakli, doku spesifik kimeralar üretmek için genetik ve embriyoloji kombinasyonu sağlar. Bu video gastrula laboratuarımızda önbeyin komissür oluşumu sırasında, Astroglial nüfus ve özel rehberlik ipuçları rollerini araştırmak için izin hücre transplantasyon sahnelenen göstermektedir.

Doku Hedeflenen Embriyonik Chimeras: Zebra balığı Gastrula Hücre Nakli

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Biz embriyogenez sırasında canlı görüntüleme hücresel davranışı için kimerik zebrafish embriyolar üretmek için bir protokol ortaya koymaktadır.

Transplantasyon GFP of-Kimerik Zebra balığı Embriyolar Retina ve Beyin Gelişimi Canlı Görüntüleme blastomer ifade

Bu video, çok renkli konfokal zaman atlamalı görüntüleme ve hedeflenen hücre ablasyon teknikleri verilmektedir. Time-lapse görüntüleme ilgi birden fazla hücre tiplerinin davranışlarını izlemek için...

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

Mevcut video, gelişmekte olan zebrafish önbeyin bireysel nöral progenitör hücrelerin canlı görüntüleme gerçekleştirmek için elektroporasyon ve konfokal mikroskopi kombinasyonu yararlanır bir yöntem gösteriyor.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Intravitreal antisens morpholinos enjekte ve retina içine electroporating koşullu yetişkin zebrafish retinanın bir hedef protein ifade demonte bir yöntem açıklanmıştır. Ortaya çıkan protein yenileyici veya sağlam retina proteinin rolünü test edilmesine imkan sağlayan birkaç gün, nakavt edilir.

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Hücre nakli, hücre iskeleti etiketleme ve fonksiyon kaybı/kazanımı yaklaşımlarını birleştiren bu protokol, göç eden zebra balığı prospektif prekordal plağın, in vivo hücre göçünde bir aday genin işlevini analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Zebra balığı retina rejenerasyon çoğunlukla sabit retina kullanılarak incelenmiştir. Ancak, bu tür interkinetic nükleer göç gibi dinamik süreçler rejeneratif tepki sırasında meydana gelen ve altında yatan mekanizmaları araştırmak için canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada, biz multiphoton mikroskopi kullanılarak Interkinetic Nükleer Göç (INM) gerçek zamanlı olarak izlemek için kültür ve görüntüleme koşulları açıklar.

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

Retina doku Imaging geleneksel biyokimyasal yöntemlerle toplanan tek hücreli bilgiler sağlar. Bu iletişim kuralı üzerinden Zebra balığı retina dilimleri hazırlanması için confocal düşsel açıklar. Floresan genetik olarak kodlanmış sensörler ve göstergesi boyalar görselleştirme çok sayıda biyolojik süreçlerin ayrı retina hücre türlerinde izin vermeyin.

Ex Vivo deneyler görüntüleme için yetişkin Zebra balığı üzerinden hazırlanması taze retina dilimleri

Öğrenin, zebra balığı embriyolarında retinal progenitör hücrelerin canlı izlenmesiyle hücre dışı sinyalleşmenin sinir oluşumuna etkisini. Bu yöntem genetik arka planların hücre davranışını nasıl etkilediğini ortaya koyar.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için (Video) | JoVE Journal

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

Daha fazla video keşfet